Saccharomyces cerevisiae Cinética de crecimiento exponencial en la cultura de lote para analizar el metabolismo respiratorio y fermentativo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para estimar el metabolismo respiratorio y fermentativo encajando el exponencial crecimiento de Saccharomyces cerevisiae a la ecuación de crecimiento exponencial. Cálculo de los parámetros cinéticos permite la proyección de la influencia de compuestos de sustancias en fermentación o respiración mitocondrial.

Resumen

Las células de Saccharomyces cerevisiae en la fase exponencial sostienen su crecimiento mediante la producción de ATP por fermentación o respiración mitocondrial. La concentración de carbono fermentables principalmente gobierna cómo las células de levadura generan ATP; por lo tanto, la variación en los niveles de carbohidratos fermentables impulsa el metabolismo energético de S. cerevisiae. Este papel describe un método de alto rendimiento basado en el crecimiento exponencial de la levadura para estimar los efectos de los cambios de la concentración y naturaleza de la fuente de carbono sobre el metabolismo respiratorio y fermentativo. El crecimiento de S. cerevisiae es medido en una microplaca o sacudirse cónico matraz mediante la determinación de la densidad óptica (OD) a 600 nm. Entonces, una curva de crecimiento es construida por OD trazado frente al tiempo, que permite la identificación y selección de la fase exponencial y está equipado con la ecuación de crecimiento exponencial para obtener parámetros cinéticos. Las tasas de crecimiento bajo con tiempos de duplicación superiores generalmente representan un crecimiento respiratorio. Por el contrario, mayores tasas de crecimiento específico con menores tiempos de duplicación indican crecimiento fermentativo. Valores umbral de duplicar el tiempo y la tasa de crecimiento específico se calculan usando condiciones respiratorias o fermentativas bien conocidas, tales como fuentes de carbono no fermentables o altas concentraciones de azúcares fermentables. Esto se obtiene de cada cepa específica. Por último, los parámetros cinéticos calculados se comparan con los valores de umbral para establecer si la levadura demuestra crecimiento fermentativo o respiratorio. La ventaja de este método es su relativa sencillez para la comprensión de los efectos de un compuesto de sustancia en el metabolismo fermentativo o respiratorio. Es importante destacar que el crecimiento es un proceso intrincado y complejo biológico; por lo tanto, los datos preliminares de este método deben ser corroborados por la cuantificación del consumo de oxígeno y la acumulación de subproductos de la fermentación. Por lo tanto, esta técnica puede utilizarse como una proyección preliminar de compuestos/sustancias que pueden alterar o mejorar el metabolismo fermentativo o respiratorio.

Introducción

Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae ha servido como una herramienta valiosa para identificar decenas de mecanismos fisiológicos y moleculares. Crecimiento se mide principalmente por tres métodos: diluciones seriadas para pruebas de punto, unidad formadora de colonias contando y las curvas de crecimiento. Estas técnicas se pueden utilizar solo o en combinación con una variedad de sustratos, condiciones ambientales, mutantes y productos químicos para investigar las respuestas específicas o fenotipos.

La respiración mitocondrial es un proceso biológico en el cual cinética de crecimiento se ha aplicado con éxito para descubrir meca....

Protocolo

1. medios de cultivo y preparación del inóculo

1. Preparar 100 mL de medio líquido de 2% levadura extracto-peptona-dextrosa (YPD) (agregue 1 g de levadura extracto, 2 g de peptona de caseína, y 2 g de glucosa a 100 mL de agua destilada). Pipetear 3 mL de los medios de comunicación en esterilizable tubos cónicos de 15 mL. Autoclave de los medios de comunicación durante 15 min a 121 ° C y 1.5 psi.
   Nota: Los medios de comunicación pueden conservarse hasta un mes en 4 – 8 ° C.
2. Inocular un tubo cónico con 3 mL de fresco caldo YPD 2% estéril con 250 μL de células de S. cerevisiae conservadas en glicerol a-20 ° C. Incubar durante una noche en un ....

Resultados

Las curvas de crecimiento pueden utilizarse para diferenciar preliminarmente los fenotipos respiratorios y fermentativos de la levadura S. cerevisiae . Por lo tanto, se realizaron cultivos batch de S. cerevisiae (BY4742) con concentraciones diferentes de glucosa que se han divulgado para inducir el crecimiento fermentativo: 1%, 2% y 10% (w/v)⁹. Las culturas que muestran un fenotipo fermentativo tienen un pequeño retraso y una fase exponencial con .......

Discusión

Mucho tiempo ha pasado desde que J. Monod¹⁰ expresa que el estudio del crecimiento de cultivos bacterianos es el método básico de la microbiología. El advenimiento de las herramientas moleculares retrasa el uso y el estudio del crecimiento como una técnica. A pesar de la complejidad de crecimiento que involucra numerosos procesos relacionados entre sí, sus mecanismos subyacentes pueden describirse mediante el uso de modelos matemáticos¹¹. Se trata de un enfoque robusto que .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agitador orbital	Thermo Scientific	4353	Para incubación de inóculo o cultivos de matraces cónicos
Bioscreen	Curvas de crecimiento	C MBR	Para cultivos discontinuos en microplacas
Glucosa	Sigma	G7021	Para la preparación de caldo YPD
Peptona de caseína, digestión enzimática	Sigma	82303	Para la preparación de caldo YPD
Extracto de levadura	Sigma	09182-1KG-F	Para la preparación de caldo YPD
Agar bacteriológico	Sigma	A5306	Para la preparación de agar YPD
NaH2PO4	Sigma	S8282	Para la preparación de caldo SC
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	Para la preparación de caldo SC
Levadura base de nitrógeno sin aminoácidos y sulfato de amonio	Sigma	Y1251	Para la preparación de caldo SC
Levadura sintética drop-out medium suplementos Sigma		Y1501	Para la preparación de caldo SC
Sulfato de amonio granular	J.T. Baker	0792-R	Para un ejemplo de suplementación media
Resveratrol	Sigma	R5010	Para un ejemplo de suplementación media
Galactose	Sigma	G8270	Para un ejemplo de suplementación media
Sacarosa	Sigma	S7903	Para un ejemplo de suplementación media
Etanol Absolut	Merck	107017	Para un ejemplo de suplementación media:
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	Para un ejemplo de suplementación media
Prisma GraphPad	, Software		: Para análisis
de datos Microplacas de nido de abeja	Thermo Scientific	9502550	Para cultivos de microplacas

,,: : GraphPad