Aquí, presentamos un método en el que neutrófilos baja densidad humanos (LDN), recuperados del líquido de lavado peritoneal postoperatorio, producen enormes trampas extracelulares neutrófilos (redes) y atrapan eficientemente las células tumorales libres que posteriormente crecen.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Neutrófilos trampas extracelulares generadas por los neutrófilos de baja densidad obtienen de líquido de lavado Peritoneal mediato accesorio y el crecimiento de células tumorales
En este artículo
Resumen
Resumen
Activa neutrófilos liberación neutrófilo extracelular trampas (redes), que pueden capturar y destruir microbios. Estudios recientes sugieren que las redes están implicadas en varios procesos de enfermedad como autoinmune enfermedad, trombosis y tumor metástasis. A continuación, os mostramos una técnica detallada en vitro para detectar actividad de red durante la captura de las células tumorales libres, que crecen después de la conexión a redes. En primer lugar, se recopilaron neutrófilos de baja densidad (LDN) de líquido de lavado peritoneal postoperatorio de pacientes sometidos a laparotomies. Cultivo a corto plazo de LDN dio lugar a la masiva formación neta que fue visualizada y contratinción cromosoma nuclear verde fluorescente. Después de la incubación conjunta de líneas celulares de cáncer gástrico humano MKN45, OCUM-1 y NUGC-4 con las redes, muchas células del tumor fueron atrapadas por las redes. Posteriormente, el accesorio completamente fue abrogado por la degradación de las redes con DNasa I. Time-lapse video reveló que no murió atrapadas por las redes de las células del tumor pero en su lugar crecieron vigorosamente en un cultivo continuo. Estos métodos pueden ser aplicados a la detección de interacciones adhesivas entre redes y varios tipos de células y materiales.
Introducción
Neutrófilos nucleares polimorfo en la sangre circulante se separan típicamente de células mononucleares a través del método de preparación de gradiente de densidad. Sin embargo, algunos neutrófilos conocidas como baja densidad neutrófilos (LDN), con fenotipos de CD11b(+), CD15(+), CD16(+) y CD14(-), son co purificados con las células mononucleares. El número relativo de LDN aumenta significativamente en varias condiciones patológicas incluyendo enfermedades autoinmunes1,2, sepsis3y cáncer4,5. Estudios previos han demostrado que ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
LDN se obtuvieron de pacientes incluidos en este estudio y fueron aprobados por el institucional de Junta de Jichi Universidad médica.
1. aislamiento de LDN de lavados de la cavidad Abdominal y de detección de red
- Adquisición de la muestra
- Infunda 1.000 mL de solución salina estéril en la cavidad abdominal antes del cierre de la herida en pacientes sometidos a cirugía abdominal debido a malignidad gastrointestinal.
Nota: Las muestras se obtuvieron de pacientes que se sometieron a una gastrectomía, colectomía o esofagectomía sin prejuicios basados en edad y sexo. Solución salina fue transferida a un recipiente y vierte e....
- Infunda 1.000 mL de solución salina estéril en la cavidad abdominal antes del cierre de la herida en pacientes sometidos a cirugía abdominal debido a malignidad gastrointestinal.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
En la cultura de 2 horas, LDN CD66b(+) derivado de las estructuras de cadena mostró líquido de lavado peritoneal teñido con tinte verde fluorescente para nuclear y cromosoma (figura 1B), mientras CD66b(-) no las células mononucleares (figura 1). Sin embargo, cuando las culturas LDN fueron pretratadas con 100 U/mL la ADNasa, la estructura característica fue destruida (figura 1), indicando que fueron c.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Estudios previos han reportado que circulan las células del tumor puede quedar atrapado por sustratos NET en vivo10,11. Las células de cáncer de mama metastásico han demostrado para estimular neutrófilos e inducir la formación de redes, que ayuda en el crecimiento de células tumorales en el órgano blanco del17. Además, se encontró que las culturas a corto plazo de LDN de líquido de lavado postoperatorio producción redes masivas qu.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Agradecemos a la Sra. J. Shinohara e I. Nieda para trabajo técnico y administrativo. También, agradecemos a los Drs. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina y Kazuya Takahashi por su colaboración para la adquisición de la muestra en sala de operaciones. Este trabajo fue apoyado por una subvenciones para la investigación científica desde el Ministerio de educación, ciencia, deportes y cultura de Japón y la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (17K 10606).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SUECIA | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Sangre entera CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-059-901 | |
| MACS Solución de enjuague | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-091-222 | |
| MACS BSA Solución Madre | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-091-376 | |
| Columnas LS | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-041-306 | |
| Separador magnético MACS | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-042-501 | |
| Solución de tinción de ácido nucleico verde SYTOX de 5 mM en DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU | S7020 | |
| PKH26 Kit de enlazador de células fluorescentes rojas para el etiquetado general de membranas celulares | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluyente C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| Medio | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco' s Modified Eagle Glucosa media-alta (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU. | D8537 | |
| Solución 0.5mol/l-EDTA (pH 8.0) | nacalai tesque, Japón | 06894-14 | |
| Suero fetal bovino, calificado, regiones aprobadas por el USDA | gibco por life technologies, México | 10437-028 | |
| Suero bovino Albúmina polvo liofilizado, ≥ 96% (electroforesis en gel de agarosa) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU | A2153 | |
| Penicilina Estreptomicina | Life Technologies Japón | 15140-122 | |
| Profiláctico de plasmocina | InvivoGen, San Diego, CA-EE. UU | . ant-mpp | |
| DNasa I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| MICROPLACA recubierta de poli-L-lisina 6Well | IWAKI, Japón | 4810-040 | |
| MICROPLACA recubierta de poli-L-lisina 24Well | IWAKI, Japón | 4820-040 | |
| microscopio estereoscópico fluoresceína | BX8000, Keyence, Osaka Japón | BZ-X710 | |
| Sistema de observación de células de visión completa | Nikon, Kanagawa, Japón | BioStudio (BS-M10) | |
| Línea celular de cáncer gástrico humano MKN45 | Riken, Tukuba Japón | N/A | |
| Línea celular de cáncer gástrico humano NUGC-4 | Riken, Tukuba Japón | N/A | |
| Línea celular de cáncer gástrico humano OCUM-1 | Universidad de la Ciudad de Osaka, Japón | N/A | Regalo del Dr. M.Yashiro |
Referencias
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
