Artículo de método

Ensayo de adhesión dinámico para el análisis funcional de las terapias anti-adherencia en enfermedad inflamatoria intestinal

DOI:

10.3791/58210

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20 de septiembre de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine 1, University of Erlangen-Nuremberg

En este artículo

Resumen

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Dinámica adhesión de células inmunes a la pared del vaso es un prerrequisito para autoguiado hacia el blanco gut. Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo funcional en vitro para el análisis del impacto de los anticuerpos anti-integrina, quimioquinas u otros factores de la adherencia de la célula dinámica de células humanas mediante capilares histórico cubierto.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gut autoguiado hacia el blanco de las células inmunes es importante para la patogenia de las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). La adhesión celular dependiente de la integrina a addressins es un paso crucial en este proceso y estrategias terapéuticas interfiere con la adherencia se han establecido con éxito. Anticuerpo integrina α4β7 anti, vedolizumab, se utiliza para el tratamiento clínico de la enfermedad de Crohn (EC) y colitis ulcerosa (Cu) y otros compuestos son propensos a seguir.

Los detalles de la adhesión y los mecanismos de acción de los anticuerpos anti-integrina aún no están claros en muchos aspectos debido a las limitadas técnicas disponibles para la investigación funcional en este campo.

Aquí, presentamos un ensayo de adherencia dinámico para el análisis funcional de la adherencia de la célula humana bajo condiciones de flujo y el impacto de las terapias anti-integrina en el contexto de la EII. Se basa en la perfusión de las células primarias humanas a través de Capillares de vidrio ultrafina histórico cubierto con análisis microscópico en tiempo real. El ensayo ofrece una variedad de oportunidades de mejoras y modificaciones y tiene potencial para descubrimientos mecanicistas y aplicaciones traslacionales.

Introducción

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Movimiento de la célula es un proceso estrechamente regulado indispensable para el desarrollo y función de organismos multicelulares, pero está también implicado en la patogenesia de una multitud de enfermedades1. Recientemente, el proceso de autodirección de las células inmunes de la sangre a los tejidos periféricos ha ganado cada vez más atención, ya que contribuye a la reposición y expansión de células patógenas en los tejidos inflamados en enfermedades inmunológico2 ,3. En particular, homing ha demostrado tener relevancia traslacional en las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). La terapéutica anti-α4β7 integrina anticuerpo vedolizumab interferir con homing gut ha demostrado eficacia en ensayos clínicos grandes4,5 y se ha utilizado con éxito en la práctica clínica del mundo real6,7 , 8. compuestos adicionales están probables que siga9,10. Del mismo modo, el anticuerpo integrina de terapéutica anti-α4, natalizumab, se utiliza para el tratamiento de la esclerosis múltiple (EM)11.

Sin embargo, nuestro entendimiento funcional del proceso autoguiados hacia el blanco en general y el mecanismo de acción de estos anticuerpos terapéuticos en particular es todavía limitada. Está bien establecido que homing consiste en varios pasos, incluyendo la inmovilización de células y que rueda con adherencia posterior de la célula hacia la detención firme seguido por trans migración endotelial12,13. Los mencionados anticuerpos neutralizan las integrinas en la superficie celular impidiendo la interacción con addressins en el endotelio de la pared del vaso. Esto se piensa para impedir firme célula adherencia14,15. Sin embargo, sólo estamos empezando a comprender la relevancia diferencial de integrinas específicas para autoguiado hacia el blanco celular de subconjuntos distintos de la célula. Además, los efectos de los anticuerpos anti-integrina en diferentes subconjuntos de células y asociaciones de dosis-respuesta son en gran parte desconocidas a un montón de preguntas abiertas en el campo de terapias autoguiados hacia el blanco y la adherencia intestinal en la EII.

Por lo tanto, se necesitan desesperadamente herramientas prácticas para abordar estas cuestiones. El efecto de los anticuerpos anti-integrina en interacción integrina-histórico predominante hasta ahora ha sido evaluado mediante la evaluación de la inhibición de la eficacia/obligatorio vinculante con citometría de flujo o a través de la adherencia estática ensayos16,17 ,18,19,20, así con aparente simplificación y desviación de la situación fisiológica. Recientemente establecimos un ensayo de adherencia dinámica para estudiar la adhesión dependiente de integrinas de las células humanas a addressins y los efectos de los anticuerpos anti-integrina bajo tensión de esquileo2. El principio de la técnica anterior se ha demostrado con células de ratón21,22. Aquí, fue adaptado y desarrollado para responder las preguntas mencionadas traslacionales, apertura nuevas avenidas para mejor comprender los mecanismos de la terapia con anticuerpos anti-integrina en vivo.

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Protocolo

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Los estudios descritos en las secciones siguientes se han realizado según aprobación de la Comisión de ética de la Universidad Friedrich-Alexander Erlangen-Nuremberg.

1. preparación de capilares

  1. Conectar tubos capilares rectangulares para el tubo de goma estirando el tubo por un lado con unas tijeras pequeñas y cuidadosamente insertar el capilar (aproximadamente 0,5 cm) en el tubo. Sellar la conexión entre tubo y tubo con película de plástico de la parafina.
  2. Capa del tubo capilar con 20 μl de la solución de control de isotipo correspondiente utilizando una pipeta de p20 o histórico (recombinante Fc quimera; histórico, por ejemplo, MAdCAM-1, en tampón de recubrimiento (NaCl 150 mM + 1 mM HEPES) de 5 μg/mL) (líquido empapará sí mismo en el capilar). Luego, sellar el lado no conectado a la tubería con la película de parafina plástica e incubar durante al menos 1 h a 37 ° C. Utilizar un capilar llenado sólo con el tampón de recubrimiento o con el control de isotipo correspondiente como control negativo.
  3. Quitar la película de parafina plástica desde la punta del tubo capilar, vaciar la capa dejando el remojo líquido fuera del capilar sobre un papel toalla y bloquear los capilares durante al menos 1 hora con 20 μl de bloquear la solución (1 x PBS con 5% BSA) a 37 ° C. Sellar el lado abierto del tubo capilar con película de plástico de la parafina. No retire la solución de bloqueo antes de proceder a la microscopía.

2. célula de aislamiento, tratamiento y preparación para microscopía

Nota: Estos pasos pueden realizarse durante la incubación períodos necesarios para la preparación capilares.

  1. Recoge 18 mL de sangre completa anticoagulada con una colección de sangre aséptica de la vena cubital del voluntariado de las personas (p. ej., pacientes de EII o controles sanos) después de consentimiento informado conforme a las normas del local Comité de ética.
    Nota: Este paso debe realizarse sólo por personal médico entrenado y experimentado según regulaciones nacionales o locales.
  2. Llenar la sangre en un tubo de 50 mL y diluir a un volumen de 35 mL con PBS 1 x. Luego la arpillera de la mezcla de sangre-PBS con 10 mL de medio de gradiente de densidad.
  3. Realizar la centrifugación gradiente de densidad por 15 min a 800 x g y 24 ° C sin freno para separar las células.
  4. Recoger las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) aspirando la capa de célula blanca de la derecha en la parte superior de la capa media gradiente de densidad (capa clara media). Transferencia de PBMCs en un nuevo tubo 50 mL, completar hasta 50 mL 1 x PBS y centrifugar 10 min a 300 x g y 10 ° C.
  5. Eliminar el sobrenadante, Resuspender el precipitado de células en 10 mL de 1 x PBS y posteriormente contar el número de células, por ejemplo, utilizando una celda de Neubauer recuento de cámara.
  6. Opcional: Para estudiar la adherencia de los granulocitos realice el siguiente procedimiento. De lo contrario, continúe con el paso 2.7 o 2.8.
    1. Reunir la granulocitos capa (más después de la centrifugación de gradiente de densidad que también contiene los eritrocitos). Resuspender las células en 40 mL de PBS 1 x. Luego añada 8 mL de 6% dextrán en PBS 1 x, mezcle suavemente y deje sedimento células durante 30 min a temperatura ambiente.
      Nota: Los eritrocitos se hundirán hasta el fondo del tubo, mientras que los granulocitos permanecerá en suspensión.
    2. Después de 30 minutos, recoger el sobrenadante, transferir a un tubo de fresca 50 mL y centrifugar durante 6 min a 300 x g a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y lisar los eritrocitos restantes añadiendo 5 mL de 0.2% NaCl en el ddH2O. Incubar durante 1 minuto.
    3. Añadir 5 mL de 1,4% NaCl en ddH2O e incube durante otro minuto. Detener la lisis hipotónica añadiendo 20 mL de 1 x PBS y centrifugar durante 6 min a 300 x g a 4 ° C.
    4. Resuspender el precipitado de células en 10 mL de 1 x PBS. Entonces, contar números de celular mediante el uso de una celda de Neubauer recuento de cámara.
  7. Opcional: Para estudiar la adhesión de subconjuntos PBMC, purifica los diferentes tipos de células o subconjuntos (por ejemplo, CD4+ y CD8+ T células o CD19+ B células) usando microesferas según protocolo del fabricante o por fluorescencia activada la célula clasificación (FACS). De lo contrario, continúe con el paso de 2.8.
  8. Centrifugar la suspensión celular por 10 min a 300 x g y 10 ° C. Deseche el sobrenadante y las células con la célula de seguimiento de tinte (por ejemplo, CFSE) según las instrucciones del fabricante de la mancha.
  9. Posteriormente, centrifugar las células durante 10 min a 300 x gy descartar el sobrenadante. Resuspender en 1 x PBS, determinar el número de células y centrifugar nuevamente por 10 minutos a 300 x g.
  10. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células teñidas en la cantidad adecuada de amortiguación de adherencia (NaCl 150 mM + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) para obtener una suspensión de 1.5 x 106 células/mL. Luego, añada la cantidad apropiada de MnCl2 para obtener una concentración final de 1 mM de 100 mM.
    Nota: Estas células están ahora listas para microscopía.
  11. Opcional: Tratar las células con citoquinas, neutralización de anticuerpos u otros compuestos. De lo contrario, continúe con el paso 3.
    1. Omita paso 2.10 y resuspender el precipitado de células teñidas de paso 2.9 en Medio RPMI (con 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina) para obtener una concentración de 1.5 x 106 células/mL.
    2. Tomar con pipeta 1 mL de esta suspensión celular en tantos pocillos de una placa de 48 pozos existen condiciones para ser analizados. Siempre preparar bien con las células no tratadas para ser perfundidos a través de un tubo capilar sin recubrimiento como control negativo y un pozo con las células no tratadas para ser perfundidos a través de un tubo capilar recubierto de histórico como control positivo.
    3. Para el tratamiento con anticuerpos anti-integrina, añadir la cantidad adecuada de anticuerpos (p. ej., 10 μg/mL vedolizumab) a la suspensión de células. Incubar durante 1 h a 37 ° C. Para el tratamiento con citoquinas, añadir la cantidad apropiada de citoquinas recombinantes (por ejemplo, 10 ng/mL CXCL10) a la suspensión de células. Incubar por 5 min a 37 ° C.
    4. Después de la incubación, cosechar células resuspender las células varias veces utilizando una pipeta p1000. Transferencia de células en un tubo de 2 mL, enjuagar bien otra vez con 1 mL de PBS 1 x y agregar al tubo 2 mL. Determinar el número de celular.
      Nota: Incubación de poblaciones de células adherentes (por ejemplo, monocitos) podría requerir medidas adicionales (por ej., tratamiento con tripsina) para separar las células de la placa.
  12. Células de centrifugar 10 min a 300 x g a 10 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en la cantidad adecuada de amortiguación de adherencia para obtener una suspensión de 1.5 x 106 células/mL. Luego, añada la cantidad apropiada de MnCl2 para obtener una concentración final de 1 mM de 100 mM. Cuando el pretratamiento con quimiocinas no agregue MnCl2 a la suspensión de células. Estas células están ahora preparadas para microscopía.
    Nota: El volumen mínimo utilizado para el análisis depende de la bomba y la tubería utilizada. En este estudio, utilizando la bomba peristáltica y la tubería especificado en la Tabla de materiales, se requiere un volumen mínimo de 400 μl. Si deseado y aplicables (dependiendo del tipo de la célula y producción), se puede aumentar la concentración de células en la suspensión para medir adherencia mayor en un período corto de tiempo.
  13. Potencial modificación: ensayo de adhesión dinámica competitiva
    1. Realice los pasos mencionados con diferentes poblaciones celulares para ser comparado con otros (por ejemplo, reglamentación y células efectoras T aisladas mediante aislamiento de grano magnético siguiendo las instrucciones del fabricante según paso 2.7).
    2. La mancha cada población con un tinte diferente (por ejemplo, CFSE y FarRed) como se describe en pasos 2.8-2.9 para ser capaces de diferenciar poblaciones celulares en microscopia.
    3. Desechar el sobrenadante y resuspender los pellets de células teñidas en la cantidad adecuada de amortiguación de adherencia (150 mM NaCl 1 mM HEPES 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) para obtener una suspensión de 1.5 x 106 células/mL.
    4. Mezclar volúmenes iguales de las suspensiones de la célula (por ejemplo, 500 μl de células de T reguladoras) y 500 μl de células efectoras T obtener un final mezcla concentración celular de 1.5 x 106 células/mL. Luego, añada la cantidad apropiada de MnCl2 para obtener una concentración final de 1 mM de 100 mM. Tales suspensiones pueden utilizarse posteriormente para el análisis de la competencia del proceso de adhesión por perfundiendo diferentes poblaciones celulares a través de los capilares mismo.

3. proyección de imagen de células de adhesión dinámico en vivo

  1. Encienda el microscopio y seleccione el filtro apropiado o con láser para excitar a la célula de seguimiento de dye(s) (p. ej., 488 nm láser de CFSE), un objetivo apropiado (por ejemplo, 40 X) y una adquisición modo propicio tiempo lapso la proyección de imagen.
  2. Retire la película de parafina plástico de la punta del tubo capilar y conecte el tubo capilar con un pedazo corto de tubería (aproximadamente 5 cm de longitud) por estirar el tubo por un lado con pequeñas tijeras y con cuidado introducir el capilar (aproximadamente 0,5 cm) en el tubo. Sellar la conexión entre el capilar y el tubo con la película plástica de la parafina.
  3. Monte el tubo capilar en una bandeja de fijación (por ejemplo, la tapa de una placa de 6 pozos con un recorte rectangular ligeramente más corto que la longitud del tubo capilar) y colocar el capilar fijo en el soporte de la bandeja del microscopio, para que el capilar está en foco y listo para microscopía.
  4. Inserte el tubo de goma en la ranura correspondiente de la bomba peristáltica y coloque el extremo no conectado al tubo capilar al tubo de muestra según que contiene la suspensión de células. Inserte el tubo corto al otro lado del tubo capilar en un tubo de 15 mL para recoger a través de flujo.
  5. Dejar el relleno de la tubería con un caudal de 500 microlitros por minuto hasta que la suspensión de células casi llega a los capilares. Que el relleno capilar con un caudal de 100 μl/min.
    Nota: Un rápido llenado del tubo capilar garantiza una distribución regular de la suspensión de células dentro del tubo capilar.
  6. Cuando el tubo capilar se llena con la suspensión de células, ajustar flujo a 10 μl/min.
    Nota: Estas tasas de flujo pueden variar cuando se utilizan tubos capilares de diferente tamaño o diferentes bombas peristálticas. En este estudio, la tasa de flujo de 10 μl/min se ha optimizado para que la bomba y tubos capilares para imitar el flujo de sangre en vivo .
  7. Capturar imágenes de Time-lapse de las células moviéndose lentamente a través de los capilares a lo largo del histórico cubierto dentro de la pared cada 2 s durante un total de 3 minutos.
    Nota: Intervalos y el tiempo total pueden variar dependiendo del tipo celular y pregunta a tratarse.
  8. Antes de descartar el tubo capilar, de la pantalla el capilar todo a través del ocular del microscopio para asegurarse de que la sección que se muestra en el video es representante. Si es necesario, hacer una segunda grabación.
  9. Libre de la tubería de la bomba y deje que el líquido restante correr hacia atrás en el tubo de 2 mL, luego desconecte el tubo capilar y los tubos de la bandeja de fijación y continúe con el siguiente tubo capilar.

4. evaluación y recuento celular

  1. Abra la secuencia Time-lapse con software apropiado y exportar las primeras tres imágenes ("principio") y las tres últimas imágenes ("End") como archivos Tiff.
  2. Abrir las tres imágenes de "Principio" en ImageJ, convertir a 32 bits ('imagen | Tipo | 32 bits ') y fotos (' imagen | Color | Combinar canales; asignar los colores rojos, verdes y azules a las imágenes diferentes). Convertir imagen en RGB (' imagen | Type-RGB') y guardarlo como archivo Tiff. Repita con las imágenes de "Fin".
    Nota: En los ensayos de adhesión dinámica competitiva con células teñidas con diferentes colores, primero dividir los canales de las imágenes para analizar la adhesión de las diferentes poblaciones celulares por separado.
  3. Contar las células blancas visibles en la imagen compuesta de "Inicio" y "Final" y restar el número de células blancas en el "principio" de las células blanco en el "fin".
    Nota: La diferencia representa el número de recién adheridas las células en el intervalo de tiempo de 3 minutos. En la imagen compuesta, las células que son visibles en el color específico que fue asignado a la respectiva estructura ya que localiza en otro lugar en el marco anterior y siguiente. Para células adherentes, las señales rojas, verdes y azules en la misma superposición punto blanco.
  4. Para visualizar mejor los resultados, compilar un vídeo de las secuencias de lapso de tiempo, por ejemplo, utilizar ImageJ.

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Resultados

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El método presentado en este manuscrito pretende simular el proceso en vivo de adhesión de células humanas a la pared endotelial lo más cerca posible a funcionalmente evaluar adhesión celular y el papel de los anticuerpos que interfieren. Por lo tanto, capilares ultrafinos son recubiertos con addressins y perfundidos con fluorescencia etiquetadas células humanas de interés utilizando una bomba de perfusión. Utilizando células vivas, la adhesión de las células humanas a la address...

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Discusión

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El protocolo de arriba describe una técnica útil para estudiar la dinámica adhesión de células inmunes humanas a ligandos endoteliales. A través de la variación de los ligandos revestidos, tipos de la célula inundada o subconjuntos, incubación con estímulos adicionales o diferentes anticuerpos neutralizantes, tiene casi ilimitadas aplicaciones potenciales. Por lo tanto, estos ensayos de adhesión dinámica pueden ser útiles para responder a dos preguntas fundamentales de investigación básica y traslacionales consultas que ...

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Divulgaciones

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N.M.F. ha servido como asesor para Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda y Boehringer. N.M.F. y S.Z. recibieron apoyo a la investigación de Takeda y Roche.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La investigación de CN, IA, SZ y NMF fue apoyada por el centro interdisciplinario de investigación clínica (IZKF) y el programa ELAN de la Universidad de Erlangen-Nuremberg, Else Kröner-Fresenius-Stiftung, la Fritz-Bender-Stiftung, de Crohn alemán y Colitis Foundation (DCCV), la investigación clínica grupo CEDER el Consejo alemán de investigaciones (DFG), el programa de tema DFG en la Microbiota, la iniciativa de campo emergente y la DFG colaboración investigación centros 643, 796 y 1181.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de 48 pocillosSarstedt833.923
Tampón de adhesión: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2Solución de
bloqueo: 1x PBS en ddH2O + 5 % BSA
Albúmina sérica bovina (BSA)ApplichemA1391,0100
CaCl2Merck2382
Capilares: Tubo rectangular de boro de 0,20 mm x 2,00 mm de diámetro interior, 50 mm de longitudCM Scientific3520-050
CCL-2, humanoImmunotools11343384
CD4-Microbeads, humanoMiltenyi Biotec130-045-101
CellTrace™ Kit de proliferación celular CFSECentrífuga ThermoFischer ScientificC34554
(Rotixa 50 RS)Hettrich
: 150 mM de NaCl + 1 mM
(TCS SP8)Leica
CXCL-10, humanoImmunotools11343884
Dextran 500Roth9219.3
EDTA KE/9 mL MonovetteSarstedt
Falcons (50 mL)Sarstedt62,547,004
Fc quimera isotipo controlR& D SystemsCaudales 110-HG
Bomba peristáltica (LabV1)Baoding Shenchen Precision Pump Company
HEPESVWRJ848-100ML
Control de isotipo de IgG humanaThermoFischer Scientific31154
Molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) Fc quimeraR& D Systems720-IC-050
LS-ColumnasMiltenyi Biotec130-042-401
MgCl2Roth
MnCl2Roth
ratón IgG control de isotipoMiltenyi Biotec130-106-545
Molécula de adhesión celular de direccionamiento vascular mucosa 1 (MAdCAM-1) Quimera FcR& D Systems6056-MC
NaClRoth3957.3
NatalizumabBiogen
Neubauer Cámara de recuentoRothT729.1
Pancoll, humanoPAN BiotechP04-601000
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) BiochromL 182-10sin Mg y Ca
Película de parafina plástica: Parafilm (PM-996)VWR52858-000
CD18 antihumano purificadoBiolegend302102
RPMI Medium 1640Gibco Life Technologies61870-010
Tubo de caucho: SC0059T Tubo LMT-55 de 3 pasos, 1,02 mm de diámetro interior, 406,4 mm de longitudIsmatecSC0059
Pipetas serológicasSarstedt861.254.025
Azul de tripánRothCN76.1
Molécula de adhesión de células vasculares 1 (VCAM-1) Fc quimeraBiolegend553706
Vedolizumab (Entyvio)Takeda
Tampón de recubrimiento Microscopio confocal HEPES

Referencias

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