Artículo de método

Visualizar el colapso del cono de crecimiento Axonal y temprano efectos β amiloidea en las neuronas de ratón cultivadas

DOI:

10.3791/58229

⸱

30 de octubre de 2018

1Division of Neuromedical Science, Institute of Natural Medicine, University of Toyama

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se presenta un protocolo para investigar los efectos tempranos de la amiloide-β (Aß) en el cerebro. Esto demuestra que Aβ induce la endocitosis mediada por clatrina y colapso de conos de crecimiento axonal. El protocolo es útil en el estudio de efectos tempranos de Aβ en conos de crecimiento axonal y puede facilitar la prevención de la enfermedad de Alzheimer.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amiloide-β (Aβ) provoca deterioro de memoria en la enfermedad de Alzheimer (AD). Aunque la terapéutica se ha demostrado para reducir los niveles de Aß en el cerebro de pacientes con EA, estos no mejoran las funciones de memoria. Ya agregados de Aβ en el cerebro antes de la aparición de deficiencias de memoria, puede ser ineficaz para el tratamiento de pacientes con EA que ya exhiben déficits de memoria contra Aβ. Por lo tanto, aguas abajo de señalización debido a la deposición de Aβ debe bloquearse antes del desarrollo de AD. Aβ induce la degeneración axonal, conduciendo a la interrupción de las redes neuronales y problemas de memoria. Aunque hay muchos estudios sobre los mecanismos de la toxicidad Aβ, la fuente de la toxicidad Aβ sigue siendo desconocida. Para ayudar a identificar la fuente, proponemos un nuevo protocolo que utiliza la microscopia, transfección génica y celular directo imágenes para investigar cambios tempranos causados por Aβ en conos de crecimiento axonal de neuronas cultivadas. Este protocolo reveló que Aβ induce la endocitosis mediada por clatrina en conos de crecimiento axonal seguida por colapso del cono de crecimiento, demostrando que la inhibición de la endocitosis previene toxicidad Aβ. Este Protocolo será útil en el estudio de los efectos tempranos de Aß y puede llevar a más eficiente y preventivo Tratamiento AD.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Depósitos de amiloide-β (Aβ) se encuentran en el cerebro de pacientes con enfermedad de Alzheimer (EA) y se consideran una causa crítica de AD1 redes neuronales, que conduce a deficiencias de memoria2,3,4. Muchos candidatos de clínicos de drogas han demostrado para prevenir con eficacia la producción de amiloide-β (Aβ) o eliminar los depósitos Aβ. Sin embargo, no han logrado mejorar la función de memoria en pacientes de AD5. Aβ ya se deposita en el cerebro antes de la aparición de deficiencias de memoria6; por lo tanto, disminuyendo los niveles de Aß en el cerebro de los pacientes que exhiben problemas de memoria pueden ser ineficaces. Depósito de Aß está presente en pacientes con EA preclínicos; sin embargo, estos pacientes rara vez presentan neuronal degeneración y memoria déficit de6. Hay un desfase de tiempo entre el depósito de Aß y debilitaciones de la memoria. Por lo tanto, una estrategia fundamental para la prevención de la EA está bloqueando la toxicidad Aβ señalización durante las etapas tempranas de la EA, antes del desarrollo de déficits de la memoria. Depósito de Aβ induce axon degeneración7,8,9,10,11,12,13, que puede conducir a una interrupción de redes neuronales y debilitación permanente de la función de memoria. Muchos estudios han investigado los mecanismos de la toxicidad Aβ; por ejemplo, los axones degenerados de los cerebros de ratones AD han demostrado aumentaron autofagia14. Activación de la calcineurina se ha divulgado como un posible mecanismo de degeneración axonal inducida por Aß15; sin embargo, la activación directa de la degeneración axonal sigue siendo desconocido.

Este estudio se centra en el colapso de las terminaciones axonales llamados conos de crecimiento. El colapso de conos de crecimiento axonal puede ser causado por repelentes de crecimiento axonal, como Semaforina 3A y efrina-A516,17,18,19,20. Colapso-como distróficos terminales axonales se han observado en los cerebros de pacientes de AD21,22. Además, un fallo de funcionamiento de cono de crecimiento puede provocar degeneración axonal23. Sin embargo, se desconoce si Aβ induce colapso del cono de crecimiento. Por lo tanto, este estudio presenta un nuevo protocolo para observar los primeros efectos del Aß en neuronas cultivadas e investigar el colapso del cono de crecimiento inducida por Aß.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los experimentos se llevaron a cabo con arreglo a las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio en el Campus de la Universidad de Toyama de Sugitani y fueron aprobados por el Comité para el cuidado Animal y uso de animales de laboratorio en el Sugitani Campus de la Universidad de Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).

1. colapso ensayo

  1. Capa de Poly-D-lisina
    1. Capa de diapositivas 8-bien cultura con 400 μL de 5 μg/mL poly-D-lisina (PDL) en tampón fosfato salino (PBS) e incube a 37 ° C durante la noche.
    2. Retirar la solución PDL y lavar los pocillos 3 veces con agua destilada.
  2. Neurona cultura24
    1. Mince recientemente aisladas cortezas cerebrales de los ratones de ddY (E14) 14 día embrionario con microscissors en medio de cultivo de neuronas que contiene suero de caballo de 12%, 0.6% de glucosa y 2 mM L-glutamina (medio A). No añadir antibióticos.
      Nota: En el presente Protocolo, se utiliza el ratón ddY. Se trata de una cepa exogámica de uso general en Japón. Este protocolo de cultura de la neurona puede ser aplicado también para las neuronas corticales de rata7,25.
    2. Centrifugue los tejidos 87 x g durante 3 minutos.
    3. Eliminar el sobrenadante. Luego el precipitado, añadir 2 mL de tripsina 0,05% e incubar por 15 min a 37° C. Mezclar golpeando cada 5 min.
    4. Añadir 4 mL de medio A y mezcla golpeando.
    5. Centrifugue los tejidos 178 x g durante 3 minutos.
    6. Quite el sobrenadante e incubar los tejidos con 600 U/mL la ADNasa I y el inhibidor de tripsina de soja de 0,3 mg/mL disuelta en PBS durante 15 min a 37 ° C. Mezclar golpeando cada 5 min.
    7. Después de la incubación, agregar 4 mL de medio A y mezcla golpeando.
    8. Centrifugue los tejidos 178 x g durante 3 minutos.
    9. Después de retirar el sobrenadante, agregar 4 mL de medio A y triturate los tejidos con una pipeta Pasteur pulido.
    10. Los tejidos triturados con una malla de 70 μm tamaño de poro del filtro. Después de la filtración, calcular la densidad de las células con un hemocitómetro.
    11. Cultura de las células en la cultura 8-bien desliza a 0.8 x 104 células/pozo con medio A y mantienen en un incubador de CO2 con un ambiente humidificado de 10% de CO2 a 37 ° C.
    12. Después de 4 h de cultivo, sustituir el medio de cultivo para un suplemento que contiene de 2% de cultura neuronal, 0.6% de glucosa y 2 mM L-glutamina (medio B).
      Nota: La pureza de las neuronas fue aproximadamente el 75%, como se describió anteriormente26.
  3. Ensayo de colapso27
    1. Disolver obtenidos comercialmente integral amiloide β1-42 (Aβ1-42) en agua destilada a una concentración de 0.5 mM e incube a 37 ° C durante 7 días. Después de la incubación, guarde la solución agregada de Aβ1-42 en un congelador de-30 ° C hasta su uso.
      Nota: La incubación es necesaria para la agregación y la toxicidad del Aβ27,28,29,30.
    2. Después de 4 días de cultivo neuronal, tratar los pocillos con 100 μL de nuevo B medio, que contiene 0,5 μM había agregado solución Aβ1-42 o vehículo (agua destilada) por 1 h.
      Nota: Efectos de Aβ1-42 fueron dosis-dependiente aumentó de 0,1 a 5 μM y alcanzó el 0,5 μM como se describió anteriormente27. Resultados similares se observan cuando por tratamiento Aβ1-42 para 1 h después de 3 días de cultivo neuronal31.
    3. Retire el medio de cultivo y fijar inmediatamente las neuronas con paraformaldehído al 4% que contiene sacarosa 4% en PBS por 1 h a 37 ° C en una placa caliente.
    4. Después de la fijación, lavar las neuronas 3 veces con PBS y montar con un medio de montaje acuoso. Seca el medio de montaje a 4 ° C durante 2 a 4 días.
    5. Captura toda la zona (7.8 x 9 mm2) de cada bien con un 20 X objetivo seco en un microscopio invertido.
    6. Clasificar el más largo neurites de cada neurona en etapa 3 o 4 como axones, como se describió anteriormente32,33.
    7. Clasificar conos de crecimiento según los siguientes criterios: conos de crecimiento 1) axonal se consideran falta lamellipodia o 2) que poseen menos de tres filopodios derrumbaron conos de crecimiento, como se describió anteriormente17.
      Nota: Conos de crecimiento saludable se anotaron como punto 0; conos de crecimiento colapsado se anotaron como 1 punto. Significa colapso puntuaciones se calculan para cada tratamiento.

2. amiloide β inmunotinción

  1. La cultura las neuronas corticales de ratón por 3 días, como se describe en el paso 1.2.
  2. Tratar con agregados Aβ1-42 (5 μM) o vehículo durante 4 h a 37 ° C en un incubador de CO2 .
  3. Sin quitar el medio, agregar un volumen igual de paraformaldehído al 4% que contiene sacarosa al 4% en PBS a cada pocillo y mantener el cultivo a 37 ° C sobre una placa caliente durante 5 minutos.
  4. Reemplazar la solución con 400 μL de paraformaldehído al 4% que contiene sacarosa al 4% en PBS y mantener a 37 ° C en la placa durante 1 hora. Este protocolo de fijación se modificó de un anterior informe34.
  5. Lavar las neuronas 3 veces con PBS.
  6. Bloque con 5% de suero normal de cabra en PBS.
  7. Incubar las neuronas con inmunoglobulina de ratón anti-amiloide β G (IgG) (1:50) y 1% albúmina de suero bovino en PBS a 4 ° C durante la noche.
  8. Lavar las neuronas 3 veces con PBS.
  9. Incubar las neuronas con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia (1: 400) y 1% albúmina de suero bovino en PBS a temperatura ambiente durante 2 h.
  10. Lavar las neuronas 3 veces con PBS y montar con un medio de montaje acuoso.
  11. Captura de imágenes de fluorescencia e imágenes de campo claro con iluminación oblicua utilizando una lente de objetivo seco 40 X en microscopio invertido B.

3. axonal Immunostaining27

  1. Lavar las neuronas 3 veces con PBS después de la fijación de neuronas cultivadas, como se describe en el paso 1.3.3.
  2. Incubar las neuronas de ratón anti-tau-1 IgG (1: 500), proteína asociada los microtúbulos de conejo 2 (MAP2) IgG (1: 500) en 5% de suero normal de cabra y 0.3% t- octylphenoxypoly-Etoxietanol en PBS a 4 ° C durante la noche.
  3. Lavar las neuronas 3 veces con PBS.
  4. Incubar las neuronas con anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia (1: 400) y 0.3% t- octylphenoxypolyethoxyethanol en PBS a temperatura ambiente durante 2 h.
  5. Lavar las neuronas 3 veces con PBS y Monte utilizando un medio de montaje acuoso.
  6. Capturar imágenes de contraste (DIC) de interferencia diferencial y fluorescencia usando una lente de objetivo seco de 20 × a. microscopio invertido

4. vivo de la célula imagen27

  1. Capa de platos a base de vidrio con 500 μL de PDL (5 μg/mL), como se describe en el paso 1.1.1.
    Nota: En este protocolo, se utilizaron los platos caseros basados en vidrio. Platos a base de vidrio disponibles en el mercado pueden utilizarse también para la proyección de imagen vivo. Platos caseros basados en vidrio se prepararon como sigue: 1) hacer un agujero aproximadamente 1,4 mm de diámetro en el centro de un plato de 35 mm con un golpe de mano y 2) Coloque un cubreobjetos de vidrio (diámetro de 22 mm) en la parte posterior del plato con silicona.
  2. Lavar las placas con agua destilada, como se describe en el paso 1.1.2 y la cultura de las neuronas corticales en el plato a base de vidrio en 3 x 104 células/plato con un medio, como se describe en el paso 1.2.
  3. Después de 4 días de cultivo celular, sustituir el medio con 2 mL de nuevo medio B y la transferencia el plato invertido microscopio A. mantener la cultura en un ambiente humidificado de 10% de CO2 a 37 ° C.

5. endocitosis experimento

  1. Las neuronas corticales de ratón de la cultura como se describe en el paso 1.2.
  2. Cuatro días más tarde, sustituir el medio con 100 μL de medio nuevo B que contiene 20 sonda de membrana μM fluorescencia durante 1 minuto.
  3. Añadir 1 μL de 0.05 mM agregado Aβ1-42 (final 0.5 μM) o vehículo (agua destilada) solución y mezclar mediante pipeteo. Incubar por 20 min.
  4. Quite el medio y lavar los pocillos dos veces con medio B que ha sido precalentado a 37 ° C.
  5. Fijar, lavar y montar las neuronas como se describe en los pasos 1.3.3 y 1.3.4.
  6. Captura de fluorescentes y DIC imágenes con 63 X aceite objetivo lente microscopio invertido a.
  7. Cuantificar la densidad de la zona de punta de prueba positiva membrana de fluorescencia en cada cono de crecimiento sano mediante un software de imagen.

6. transfección gen

  1. Preparar las neuronas corticales como se describe en el paso 1.2. Después de completar los pasos 1.2.1 a 1.2.10, Centrifugue las neuronas a 178 x g durante 3 minutos.
  2. Eliminar el sobrenadante, agregar 4 mL de Ca2 +-libre y Mg2 +-libre de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS de CMF) y mezclar mediante pipeteo.
  3. Centrifugar las células a 178 x g durante 3 minutos.
  4. Eliminar el sobrenadante, agregar 4 mL de CMF-HBSS y mezclar mediante pipeteo. A continuación, calcular la densidad celular, como se describe en el paso 1.2.10.
  5. Transferencia de 5 x 106 células a un tubo de 1.5 mL y centrifugar a 1.677 x g durante 1 minuto.
  6. Eliminar el sobrenadante, agregar 100 μL de solución de transfección con suplemento y 3 μg de plásmido de DNA codificación EGFP o EGFP AP180 c-terminal y mezclar mediante pipeteo.
  7. Transferir la solución anterior (paso 6.6) a una cubeta certificada y transfectar con un electroporator, según protocolo del fabricante.
  8. Inmediatamente después de la transfección, Añadir 500 μL de medio A en la cubeta y transferir la solución a un tubo de 1,5 mL con una pipeta de certificados. A continuación, calcular la densidad celular, como se describe en el paso 1.2.10.
  9. La cultura las células en un portaobjetos bien 8 cultura 0.8 x 104 células/pozo, como se describe en los pasos 1.2.11 y 1.2.12.
  10. Después de 4 días de cultivo celular, realice un ensayo de colapso como se describe en el paso 1.3.

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Resultados

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En este protocolo, Aβ1-42 se incubó a 37 ° C durante 7 días antes de su uso, porque incubación de Aβ1-42 era necesaria para la producción de formas tóxicas27,28,30,35. Después de la incubación, se observaron formas agregadas de Aβ (figura 1A). Se ha divulgado que incubación similar de Aβ1-42 produjo la forma de fibrilla de Aβ

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo descrito en este estudio permitió la observación de fenómenos tempranos en conos de crecimiento axonal Aβ1-42 postratamiento. Aβ1-42 inducida por endocitosis en conos de crecimiento axonal dentro de 20 min, y colapso del cono de crecimiento se observó dentro de 1 h de tratamiento. Esta endocitosis fue probablemente mediada por clatrina. Mediante este protocolo, se confirmó la inhibición de la endocitosis mediada por clatrina para evitar el colapso del cono de Aβ1-42-inducida por el crecimiento y degeneración...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El autor no tiene nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue parcialmente apoyado por becas de investigación de JSP (KAKENHI 18K 07389), Japón, Fundación Ciencia de Takeda, Japón y Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japón.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ddY ratonesSLC
Portaobjetos de cultivo de ocho pocillosFalcon354108
poli D lisinaWako168-19041
Medio de cultivo, Medio neurobasalGibco21103-049
suero de la casaGibco26050-088
glucosaWako049-31165
L-glutaminaWako074-00522
0,05% tripsinaGibco25300-054
DNasa IWorthingtonDP
inhibidor de la tripsina de sojaGibco17075-029
Filtro con 70 µ m tamaño de malla, colador de celdasFalcon352350
B-27 suplementoGibco17504-044
CO2 incubadoraAstecSCA-165DS
Amiloide y beta; 1-42Sigma-AldrichA9810
paraformaldehídoWako162-16065
sacarosa Wako196-00015
Medio de montaje acuoso, Aqua-Poly/Mountpolysciences18606-20
Microscopio invertido ACarl ZeissAxio Observer Z1 Conectado con AxioCam MRm, unidad de calefacción XL S, módulo de CO2 S1 y TempModule S1
Objetivo Plan-Apocromático 20xCarl Zeiss420650-9901
Objetivo Plan-Apocromático 63xCarl Zeiss440762-9904
Objetivo, CFI Plan Apo Lambda 40XNikon
anti-MAP2 IgGAbcamab32454
anti-tau-1 IgGChemiconMAB3420
anti-amiloide y beta; anticuerpoIBL10379clon 11A1
suero de cabra normalWako143-06561
albúmina sérica bovinaWako010-25783
t-octilfenoxipolietoxietanolWako169-21105
cabra anti-ratón IgG conjugada con AlexaFluor 594InvitrogenA11032
cabra anti-conejo IgG conjugada con AlexaFluor 488InvitrogenA11029
NISSINNHP-M30N
cubreobjetosFisher Scientific12-545-85
plato de 35 mmIWAKI1000-035
Silicona RTVShin-EtsuKE42T
punzón de manoRoper WhitneyNo.
Sonda de membrana de fluorescencia, FM1-43FXInvitrogenF35355
Ca2+- y Mg2+ sin solución salina balanceada de HanksGibco14175-095
Solución de transfección, Solución nucleofectoraLonzaVPG-1001
Electroporador, Nucleofector IAmaxa
Microscopio invertido BKeyenceBZ-X710
Software de imagen, ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
Placa calefactora XX

Referencias

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