Aquí se presenta un protocolo para investigar los efectos tempranos de la amiloide-β (Aß) en el cerebro. Esto demuestra que Aβ induce la endocitosis mediada por clatrina y colapso de conos de crecimiento axonal. El protocolo es útil en el estudio de efectos tempranos de Aβ en conos de crecimiento axonal y puede facilitar la prevención de la enfermedad de Alzheimer.
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Artículo de método
Visualizar el colapso del cono de crecimiento Axonal y temprano efectos β amiloidea en las neuronas de ratón cultivadas
En este artículo
Resumen
Resumen
Amiloide-β (Aβ) provoca deterioro de memoria en la enfermedad de Alzheimer (AD). Aunque la terapéutica se ha demostrado para reducir los niveles de Aß en el cerebro de pacientes con EA, estos no mejoran las funciones de memoria. Ya agregados de Aβ en el cerebro antes de la aparición de deficiencias de memoria, puede ser ineficaz para el tratamiento de pacientes con EA que ya exhiben déficits de memoria contra Aβ. Por lo tanto, aguas abajo de señalización debido a la deposición de Aβ debe bloquearse antes del desarrollo de AD. Aβ induce la degeneración axonal, conduciendo a la interrupción de las redes neuronales y problemas de memoria. Aunque hay muchos estudios sobre los mecanismos de la toxicidad Aβ, la fuente de la toxicidad Aβ sigue siendo desconocida. Para ayudar a identificar la fuente, proponemos un nuevo protocolo que utiliza la microscopia, transfección génica y celular directo imágenes para investigar cambios tempranos causados por Aβ en conos de crecimiento axonal de neuronas cultivadas. Este protocolo reveló que Aβ induce la endocitosis mediada por clatrina en conos de crecimiento axonal seguida por colapso del cono de crecimiento, demostrando que la inhibición de la endocitosis previene toxicidad Aβ. Este Protocolo será útil en el estudio de los efectos tempranos de Aß y puede llevar a más eficiente y preventivo Tratamiento AD.
Introducción
Depósitos de amiloide-β (Aβ) se encuentran en el cerebro de pacientes con enfermedad de Alzheimer (EA) y se consideran una causa crítica de AD1 redes neuronales, que conduce a deficiencias de memoria2,3,4. Muchos candidatos de clínicos de drogas han demostrado para prevenir con eficacia la producción de amiloide-β (Aβ) o eliminar los depósitos Aβ. Sin embargo, no han logrado mejorar la función de memoria en pacientes de AD5. Aβ ya se deposita en el cerebro antes de la aparición de deficiencias de memoria6....
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Protocolo
Todos los experimentos se llevaron a cabo con arreglo a las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio en el Campus de la Universidad de Toyama de Sugitani y fueron aprobados por el Comité para el cuidado Animal y uso de animales de laboratorio en el Sugitani Campus de la Universidad de Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).
1. colapso ensayo
- Capa de Poly-D-lisina
- Capa de diapositivas 8-bien cultura con 400 μL de 5 μg/mL poly-D-lisina (PDL) en tampón fosfato salino (PBS) e incube a 37 ° C durante la noche.
- Retirar la solución PDL y lavar los pocillos 3 veces con agua destilada.
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Resultados
En este protocolo, Aβ1-42 se incubó a 37 ° C durante 7 días antes de su uso, porque incubación de Aβ1-42 era necesaria para la producción de formas tóxicas27,28,30,35. Después de la incubación, se observaron formas agregadas de Aβ (figura 1A). Se ha divulgado que incubación similar de Aβ1-42 produjo la forma de fibrilla de Aβ
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Discusión
El protocolo descrito en este estudio permitió la observación de fenómenos tempranos en conos de crecimiento axonal Aβ1-42 postratamiento. Aβ1-42 inducida por endocitosis en conos de crecimiento axonal dentro de 20 min, y colapso del cono de crecimiento se observó dentro de 1 h de tratamiento. Esta endocitosis fue probablemente mediada por clatrina. Mediante este protocolo, se confirmó la inhibición de la endocitosis mediada por clatrina para evitar el colapso del cono de Aβ1-42-inducida por el crecimiento y degeneración.......
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Divulgaciones
El autor no tiene nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue parcialmente apoyado por becas de investigación de JSP (KAKENHI 18K 07389), Japón, Fundación Ciencia de Takeda, Japón y Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japón.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ddY ratones | SLC | ||
| Portaobjetos de cultivo de ocho pocillos | Falcon | 354108 | |
| poli D lisina | Wako | 168-19041 | |
| Medio de cultivo, Medio neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| suero de la casa | Gibco | 26050-088 | |
| glucosa | Wako | 049-31165 | |
| L-glutamina | Wako | 074-00522 | |
| 0,05% tripsina | Gibco | 25300-054 | |
| DNasa I | Worthington | DP | |
| inhibidor de la tripsina de soja | Gibco | 17075-029 | |
| Filtro con 70 µ m tamaño de malla, colador de celdas | Falcon | 352350 | |
| B-27 suplemento | Gibco | 17504-044 | |
| CO2 incubadora | Astec | SCA-165DS | |
| Amiloide y beta; 1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| paraformaldehído | Wako | 162-16065 | |
| sacarosa | Wako | 196-00015 | |
| Medio de montaje acuoso, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| Microscopio invertido A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Conectado con AxioCam MRm, unidad de calefacción XL S, módulo de CO2 S1 y TempModule S1 |
| Objetivo Plan-Apocromático 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
| Objetivo Plan-Apocromático 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
| Objetivo, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
| anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
| anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
| anti-amiloide y beta; anticuerpo | IBL | 10379 | clon 11A1 |
| suero de cabra normal | Wako | 143-06561 | |
| albúmina sérica bovina | Wako | 010-25783 | |
| t-octilfenoxipolietoxietanol | Wako | 169-21105 | |
| cabra anti-ratón IgG conjugada con AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
| cabra anti-conejo IgG conjugada con AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| NISSIN | NHP-M30N | ||
| cubreobjetos | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| plato de 35 mm | IWAKI | 1000-035 | |
| Silicona RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
| punzón de mano | Roper Whitney | No. | |
| Sonda de membrana de fluorescencia, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| Ca2+- y Mg2+ sin solución salina balanceada de Hanks | Gibco | 14175-095 | |
| Solución de transfección, Solución nucleofectora | Lonza | VPG-1001 | |
| Electroporador, Nucleofector I | Amaxa | ||
| Microscopio invertido B | Keyence | BZ-X710 | |
| Software de imagen, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
Referencias
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
- Dickson, T. C., Vickers, J. C. The morphological phenotype of beta-amyloid plaques and associated neuritic ....
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Reimpresiones y permisos
