Aquí presentamos un protocolo detallado para hacer eficiente el homo - y heterografts entre sandía y calabaza de botella, además de métodos de muestreo de tejido, generación de datos y análisis de datos para la investigación de microRNAs sensible al frío.
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Artículo de método
Generación de Homo - y Heterografts entre sandía y calabaza de botella para el estudio de MicroRNAs sensible al frío
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Resumen
Resumen
MicroRNAs (miRNAs) son endógenas pequeño no-codificación RNAs de unos 20-24 nt, conocido por desempeñar un papel importante en el desarrollo de las plantas y la adaptación. Hay una acumula evidencia que demuestra que las expresiones de ciertos miRNAs se alteran al injertar, una práctica agrícola utilizada por los agricultores para mejorar cultivos tolerancia a estreses bióticos y abióticos. Calabaza de botella es un cultivo inherentemente resistente al clima en comparación con muchas otras cucurbitáceas importantes, incluyendo sandía, haciéndola uno de los portainjertos más utilizados para este último. El reciente avance de las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento ha proporcionado grandes oportunidades para investigar miRNAs sensible al frío y sus contribuciones a la ventajas de heteroinjertos; sin embargo, los procedimientos experimentales adecuados son un requisito previo para ello. Aquí, presentamos un protocolo detallado para la eficiente generación de homo - y heterografts entre la sandía fría-susceptibles y la calabaza de botella tolerantes al frío, además de métodos de muestreo de tejido, generación de datos y análisis de datos. Los métodos presentados son también útiles para otros sistemas de injerto de planta, para interrogar a miRNA regulaciones bajo diversas presiones ambientales, tales como calor, sequía y salinidad.
Introducción
Injerto durante mucho tiempo se ha empleado como una técnica agrícola para mejorar la producción de cultivos y la tolerancia a estreses bióticos y abióticos1,2,3. En los sistemas de heterografting, portainjertos elite pueden mejorar la absorción de agua y nutrientes de las plantas, fortalecer la resistencia a patógenos del suelo y limitar los efectos negativos del metal toxicidad4,5, que puede conferir un mayor los injertos el vigor de crecimiento y mayor tolerancia a estrés ambiental. En muchos casos, heterografting también puede afectar calidad de fruta en plantas hortícolas, hacia la fruta mejor sabor y mayor contenido de compuestos relacionados con la salud6,7. Se ha encontrado que la transferencia interurbana de fitohormonas, RNAs, péptidos y proteínas entre el portainjerto y el injerto es un mecanismo fundamental modulando el crecimiento y desarrollo reprogramación de scion plantas8,9 ,10. El injerto se ha utilizado ampliamente en estudios de señalización de larga distancia y transporte en relación con la adaptación al medio11. Experimentos de injertos son especialmente potentes para la detección inequívoca de moléculas de transmisión en la recepción de tejidos o sap vascular y activación o supresión de dianas moleculares debido a la señal de transmisión12.
Non-coding RNAs, una gran clase de ARN que ejercen importantes funciones reguladoras en células, se han divulgado para desempeñar un papel en facilitar la adaptación de plantas a estrés abiótico13. miRNAs son endógenas pequeño no-codificación RNAs de unos 20-24 nt. estudios han puesto de manifiesto el papel regulador de miRNAs en diversos aspectos de las actividades de la planta, tales como disparar el crecimiento lateral raíz formación14,15,16, absorción de los nutrientes, metabolismo del sulfato y homeostasis17y respuestas a biótico y abiótico estrés18. Recientemente, fueron relacionados con la expresión de miRNAs y sus genes diana sal tolerancia al estrés en las plantas de semillero de pepino heterografted19. En los injertos intervariety de uva, las respuestas de expresión de miRNA a estrés de sequía fueron encontradas para ser dependiente del genotipo20.
El rápido desarrollo y disminuir el costo de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento han proporcionado una gran oportunidad para el estudio de normas miRNA de plantas agronómicas. Sandía (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), un cultivo de cucurbitáceas importantes en todo el mundo, es susceptible a las bajas temperaturas. Botella de calabaza (Lagenaria siceraria [Molina] (Standl.) es una cucurbitáceas más resistente al clima utilizados por los agricultores al injerto con sandía. El objetivo principal del presente estudio es establecer un estándar, eficiente y un método conveniente para hacer heterografts entre sandía (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) y botella de calabaza (Lagenaria siceraria [Molina] Standl). Este protocolo también ofrece un plan experimental detallado y procedimientos analíticos para el estudio de la regulación de miRNA expresiones tras el injerto, que es útil para revelar los mecanismos que subyacen ventajas heterografting.
Los materiales de planta usados en este estudio incluyen el cultivar de sandía y el calabaza de botella landrace. Cultivo de sandía es un cultivo comercial con alto rendimiento pero susceptibles a las bajas temperaturas. Calabaza de botella landrace es una popular portainjertos para injertar con sandía, pepino y calabaza de botella, debido a su excelente tolerancia de bajas temperaturas21.
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Protocolo
1. esterilización y germinación de la semilla
- Para la esterilización superficial, remojar las semillas de la calabaza de botella en un vaso de precipitados de 500 mL llenado de agua a 58 ° C con agitación ocasional, hasta que la temperatura del agua a 40 ° C.
- Mientras tanto, poner 3 kg de suelo de turba en una bolsa de nylon y, al esterilizar, autoclave a 120 ° C/0.5 MPa durante 20 minutos.
- Mantener a remojo las semillas de la calabaza de botella para 4-5 h más de no agitar.
- Una vez que el agua llegue a temperatura ambiente, enjuagar las semillas 2 x - 3 x con agua destilada.
- Drenar el exceso de agua y deje que las semillas a germinar en una bolsa de Gasa a 28 ° C en una cámara de crecimiento en la oscuridad.
- Después de la germinación, sembrar las semillas en macetas de plástico (6 cm de diámetro) con suelo de turba esterilizada.
- Cuando las plántulas de calabaza de botella han desarrollado dos cotiledones aplanados, repita los pasos 1.1-1.3 con semillas de la sandía.
Nota: Esta gestión del tiempo asegura que el tamaño del injerto y portainjerto coincidir bien para injerto exitoso.
2. plántulas crecimiento e injerto
- Crecer las plántulas en una cámara de crecimiento con un ciclo oscuro de 16 h luz /8-h, manteniendo la temperatura a 28 ° C durante el día (luz) y a 22 ° C durante la noche (oscura). Regar las plántulas mediante la adición de agua 1 x al día en horas de la tarde.
- Utilice el método injerto de corte22 para hacer heterografts cuando las plantas de semillero de la calabaza de botella (rizoma) se encuentran en una hoja de verdad y los cotiledones de la sandía (scion) han surgido (aplanados).
- Corte los hypocotyls de las plántulas de sandía en 2-3 cm por debajo de los cotiledones y hojas de la parte superior de las plántulas de calabaza de botella en el sitio justo encima de la verdad.
- Utilice un palillo de dientes para hacer un agujero en la parte superior de las plántulas de calabaza de botella recortada. Inserte las plántulas de sandía cortada en los agujeros de las plántulas de calabaza de botella para hacer heterografts.
- Utilizar un método similar que se presenta en el paso 2.2 para hacer homoinjertos.
Nota: Combinaciones de Homo - y heterografting deben realizarse siempre al mismo tiempo (figura 1), que, en este caso, se traduce en lo siguiente: calabaza de sandía/botella (WB, heteroinjertos), Sandia/sandia (WW, homoplastia) y calabaza de botella /bottle calabaza (BB, homoplastia).
Figura 1: ilustración de las combinaciones de injerto y las estructuras de la planta injertada. WB = heterografting de calabaza sandía/botella; WW = homografting Sandia/Sandia; BB = calabaza de botella/bottle gourd homo injertos; WB-S = hojas de scion de las heterografts de calabaza sandía/botella que fueron muestreados; WB-R = hojas del rizoma de las heterografts de calabaza sandía/botella que fueron muestreadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. postgrafting administración, tratamiento de frío y toma de muestras
- Envolver las plántulas injertadas con bolsas de polietileno transparente para mantener una humedad relativamente alta y mantener por 7 d en condiciones ambientales de 16 h luz/8-h oscuros ciclos, manteniendo la temperatura a 28 ° C durante el día (luz) y a 22 ° C durante el noche (oscuridad).
- Descubrir las bolsas de polietileno transparente en el 7mo día. Deje que las plantas crecen para un 7-10 días en las mismas condiciones.
- El uniforme plántulas sanas se dividen en dos grupos, uno para tratamiento de frío (tensionado) y uno de control (no tensionado). Para el grupo control, dejar las plántulas en la misma cámara de crecimiento (a 28 ° C) para un 48 h adicional, mientras que para el grupo frío-tensionado, transferir las plantas de semillero a una cámara de crecimiento con una temperatura constante a 6 ° C, con condiciones de luz/oscuridad como se describe en el paso 2.1.
- Muestra las hojas del injerto y el portainjerto de los injertos (figura 1). Congelar las muestras inmediatamente en nitrógeno líquido y almacenarlas a-70 ° C hasta su uso.
4. Biblioteca elaboración y secuenciación de alto rendimiento
- Transferir las muestras congeladas a un tubo de microcentrífuga de 2 mL en nitrógeno líquido.
- Coloque una capa de acero inoxidable (5 mm de diámetro) a cada tubo que contiene los tejidos.
- Homogeneizar los tejidos a un polvo fino usando un homogeneizador de molino de grano para 30 s.
- Para cada combinación de injerto, tome cantidades iguales (0.1 g) de muestra de tierra de diez plantas y mezclarlas en un tubo de centrífuga de 10 mL. Agregar una cantidad apropiada del reactivo de clorhidrato guanidínicos (Tabla de materiales) basado en las sugerencias del fabricante correspondiente al peso del tejido.
- Eliminar contaminaciones de ADN genómicos mediante la adición de RNA libre DNasa I a 150 U/mL a 37 ° C durante 1 hora.
- Determinar el total de número de cantidad de RNA en un sistema de electroforesis de microcapillary para asegurar la integridad del RNA > 7.0.
Nota: Un RIN > 7.0 asegura una alta integridad de las muestras de RNA. - Preparar pequeñas bibliotecas de RNA utilizando un kit comercial (Tabla de materiales) según las instrucciones del fabricante. Utilizar 1 μg de ARN total por muestra para iniciar.
- Descongele la biblioteca normalización reactivos y adaptadores según las instrucciones del fabricante. Ligar RNAs pequeño con los adaptadores de 5′ y 3′ y eluir y purificarlos. Entonces, revés transcribir el 5′ y 3' ligarse RNAs pequeño siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Realizar la amplificación por PCR según protocolo del fabricante. Evaluar la calidad y cantidad de las bibliotecas de cDNA utilizando un sistema de electroforesis microcapillary.
- Carga 1 μl de una biblioteca de RNA en un sistema de electroforesis de microcapillary para asegurar el RIN > 7.0.
- La secuencia de las pequeñas bibliotecas de RNA en un instrumento de secuenciación de alto rendimiento como se describe en otra parte23.
5. miRNA y predicción de genes blanco
- Para cada combinación de injerto, utilice UEA sRNA workbench versión 2,4-planta24 de código abierto para eliminar secuencias de mala calidad y recortar secuencias adaptador de lecturas raws. Deseche las secuencias que son menores de 18 años nt o superior de 32 nt.
- Comparar las secuencias de "limpias" de alta calidad a la base de datos de código abierto 11.0 Rfam para reconocer y eliminar lecturas de rRNA, tRNA, snoRNA y otros snRNAs.
- Alinee las lecturas restantes a los genomas de referencia con una secuencia corta de leer alineación herramienta25. En este paso no se permite ningún desajuste.
Nota: La Asamblea del genoma "97103" de sandía V126 fue utilizado para la alineación con las lecturas de lo scion y la calabaza de botella "HZ" genoma Asamblea V127 fue utilizado para lecturas de portainjerto. - Comparar las lecturas restantes contra conocido miRNAs maduros en el código abierto miRBase 22.028. Dice que es homólogas a conocido miRNAs se clasifica como miRNAs conservado.
- Comparar las secuencias que no coinciden con los precursores conocidos miRNA con la secuencia del genoma. Utilizar el algoritmo de29 MIREAP para detectar miRNAs novela potencial en la configuración por defecto.
6. diferencial expresión y análisis de la ontología génica
- Comparar los niveles de expresión de miRNAs basan sus cuentas leerlas. miRNAs con un P-valor (prueba exacta de Fisher) < 0.05 y un registro absoluto2 valor > 2 se consideran que se expresan diferencialmente.
- Utilizar un oligonucleótido antisentido destino sitio selección herramienta (TargetFinder)30 para predecir potenciales mRNAs complementarios (genes de miRNA Diana) a los miRNAs diferencialmente expresados bajo parámetros por defecto.
- Utilizar la ontología gene (vaya) patrones de enriquecimiento herramienta analítica31 para revelar la ontología de genes target de miRNA (ir) en un P- umbral valor de 0.05 de significancia estadística.
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Resultados
Figura 2: fenotipos de varios injertos a temperatura ambiente y condiciones de frío-tensionado. (a) este panel muestra homo - y heterografted plantas a temperatura ambiente como el control. (b) este panel muestra homo - y heterografted plántulas después de 48 h de tratamiento en frío.
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Discusión
En este protocolo describe en detalle un método altamente eficaz y reproducible para homo - y heterografts entre sandía y calabaza de botella. Este método, que requiere ningún equipamiento específico, es muy fácil de operar y por lo general tiene una tasa muy alta de supervivencia del injerto. El método también puede ser utilizado para hacer injertos de otras cucurbitáceas, como entre sandía, pepino y calabaza.
Cabe señalar que el tamaño relativo (edad) del portainjerto y el injerto es esencia...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar. Los datos de la secuencia de RNA pequeño se depositan en el GenBank bajo el número SRP136842.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31772191), el proyecto de investigación de interés público en la provincia de Zhejiang (2017C 32027), la llave de la ciencia proyecto de fitomejoramiento en Zhejiang (2016C 02051) y el programa nacional de el apoyo de primera categoría jóvenes profesionales (PX).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| DNasa I libre de ARN | Takara | D2270A | |
| Truseq Kit de preparación de muestras de ARN pequeño | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| ADN polimerasa | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench versión 2.4 plantas (software) | NA | NA http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ | |
| Base de datos Rfam 11.0 ( sitio web) | NA | NA http://rfam.janelia.org | |
| miRBase 22.0 ( sitio web) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder ( software) | NA | NA http://targetfinder.org/ |
Referencias
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