Method Article

Caracterización física de alta resolución de nanopartículas metálicas únicas

DOI:

10.3791/58257

⸱

June 28th, 2019

 ,  ,  , 
1Physical Measurement Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemical Engineering, Columbia University, 3Department of Applied Physics and Applied Math, Columbia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para detectar cúmulos de oxígeno metálico discretos, polioxometalados (POP), en el límite de molécula única utilizando una plataforma electrónica biológica basada en nanoporos. El método proporciona un enfoque complementario a las herramientas de química analítica tradicionales utilizadas en el estudio de estas moléculas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las moléculas individuales se pueden detectar y caracterizar midiendo el grado por el cual reducen la corriente iónica que fluye a través de un solo poro a escala nanométrica. La señal es característica de las propiedades fisicoquímicas de la molécula y sus interacciones con el poro. Demostramos que los nanoporos formados por la exotoxina proteica bacteriana Staphylococcus aureus alpha hemolysin (HL) pueden detectar polioxometalatos (POP, grupos de oxígeno metálico aniónico), en el límite de molécula única. Además, se miden simultáneamente múltiples productos de degradación de ácido 12-fosfotúltico POM (PTA, H3PW12O40) en solución. La sensibilidad de una sola molécula del método de nanoporos permite que los POP se caracten a concentraciones significativamente más bajas de lo requerido para la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). Esta técnica podría servir como una nueva herramienta para que los químicos estudien las propiedades moleculares de los polioxometalados u otros racimos metálicos, para comprender mejor los procesos sintéticos de POM y posiblemente mejorar su rendimiento. Hipotéticamente, la ubicación de un átomo dado, o la rotación de un fragmento en la molécula, y el estado de oxidación del metal podrían ser investigados con este método. Además, esta nueva técnica tiene la ventaja de permitir el monitoreo en tiempo real de moléculas en solución.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La detección de analitos biomoleculares a nivel de molécula única se puede realizar mediante el uso de nanoporos y la medición de modulaciones de corriente iónica. Típicamente, los nanoporos se dividen en dos categorías basadas en su fabricación: biológica (autoensamblada a partir de proteínas o o origami de ADN)1,2,3,o estado sólido (porejemplo,fabricado con herramientas de procesamiento de semiconductores)4,5. Mientras que los nanoporos de estado sólido se sugirieron como potencialmente más robustos físicamente y se pueden utilizar en una amplia gama de condiciones de solución, los nanoporos proteicos hasta ahora ofrecen una mayor sensibilidad, más resistencia a la suciedad, mayor ancho de banda, mejor selectividad, y una mayor relación señal-ruido.

Una variedad de canales de iones proteicos, como el formado por Staphylococcus aureus-hemolysin (HL), se puede utilizar para detectar moléculas individuales, incluyendo iones (porejemplo,, H+ y D+)2,3, polinucleótidos (DNA y ARN)6,7,8, ADN dañado9, polipéptidos10, proteínas (plegados y desplegados)11, polímeros (polietilenglicol y otros)12,13 , 14, nanopartículas de oro15,16,17,18,19, y otras moléculas sintéticas20.

Recientemente demostramos que el nanoporo de HL también puede detectar y caracterizar fácilmente racimos metálicos, polioxometalados (POP), a nivel de molécula única. Los POP son racimos discretos de oxígeno metálico aniónico a nanoescala que fueron descubiertos en 182621,y desde entonces, se han sintetizado muchos más tipos. Los diferentes tamaños, estructuras y composiciones elementales de polioxometalados que ahora están disponibles dieron lugar a una amplia gama de propiedades y aplicaciones, incluyendo química22,23, catálisis24, ciencia de materiales25 ,26,e investigación biomédica27,28,29.

La síntesis POM es un proceso de autoensamblaje típicamente llevado a cabo en agua mediante la mezcla de las cantidades estequiométricamente requeridas de sales metálicas monoméricas. Una vez formados, los POP exhiben una gran diversidad de tamaños y formas. Por ejemplo, la estructura de poliolano Keggin, XM12O40q- se compone de una heteroátomo (X) rodeada de cuatro oxígenos para formar un tetraedro (q es la carga). La heteroátomo se encuentra centralmente dentro de una jaula formada por 12 unidades DE MO 6 octahedrales (donde los metales de transición M en su estado de alta oxidación), que están unidos entre sí por átomos de oxígeno compartidos vecinos. Mientras que la estructura de polioxmetalados de tungsteno es estable en condiciones ácidas, iones de hidróxido conducen a la escisión hidrolítica de enlaces metal-oxígeno (M-O)30. Este complejo proceso resulta en la pérdida de una o más subunidades octáhedrticas MO 6, lo que conduce a la formación de especies monovacantes y triocupadas y, finalmente, a la descomposición completa de los POMs. Nuestra discusión aquí se limitará a los productos de descomposición parcial de ácido 12-fosfotúrtico a pH 5.5 y 7.5.

El objetivo de este protocolo es detectar cúmulos de oxígeno metálico discretos en el límite de molécula única utilizando una plataforma electrónica biológica basada en nanoporos. Este método permite la detección de racimos metálicos en solución. Múltiples especies en solución pueden ser discriminadas con mayor sensibilidad que los métodos analíticos convencionales33. Con él, se pueden esclarecer diferencias sutiles en la estructura pom, y en concentraciones marcadamente inferiores a las requeridas para la espectroscopia de RMN. Es importante destacar que este enfoque incluso permite la discriminación de formas isoméricas de Na8HPW9O341.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nota: El siguiente protocolo es específico del sistema Nanopatch DC de Electronic BioSciences (EBS). Sin embargo, se puede adaptar fácilmente a otros aparatos de electrofisiología utilizados para medir la corriente a través de membranas bicapa de lípidos planas (cámara de membrana bicapa de lípidos estándar, geometría de tubo U, microcapilares tirados, etc.). La identificación de materiales comerciales y sus fuentes se da para describir los resultados experimentales. En ningún caso esta identificación implica recomendación por parte del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología, ni implica que los materiales sean los mejores disponibles.

1. Solución y Preparación de Analitos

  1. Preparar todas las soluciones de electrolitos con agua de 18 cm de un sistema de purificación de agua tipo 1 para eliminar las especies orgánicas traza y luego filtrar todas las soluciones de electrolitos a través de un filtro de vacío de 0,22 m inmediatamente antes de las grabaciones de canal iónico.
    Nota: La calidad del agua es un factor crítico para la estabilidad y la longevidad del sistema de nanoporos de membrana.
  2. Tipo de comodín .
    1. Siga las precauciones de MSDS al manipular la proteína de toxina de HL.
    2. Mezclar polvo monomérico de tipo salvaje liofilizado S. aureus-Hemolysin (HL) con agua de 18 cm-cm a 1 mg/ml. Distribuya alícuotas de 10 a 30 l de la muestra en tubos centrífugos crioseguros, congele rápidamente el flash en nitrógeno líquido y luego guárdelas a -80 oC. Alternativamente, utilice heptérico preformado purificado aHL31.
  3. Disolver el lípido 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DPhyPC) a 0,2 mg/ml en n-decano en un vial de centelleo de vidrio de 4 ml con una tapa recubierta de politetrafluoroetileflulon. Conservar la solución a 4oC para su uso repetido durante un mes.
  4. Preparar soluciones de ácido fosfotúmicosticos.
    1. Siga las precauciones de MSDS al manipular el polvo de ácido fosfotúltico y prepare una solución de stock de ácido fosfotúlónico de 2 mM disolviendo 57,6 mg de H3PW12O40 a 10 ml de un 1 M NaCl y 10 mM NaH2PO4 solución, que constituye la solución de stock.
    2. Tome 5 ml de esta solución y ajuste el pH a 5,5 con 3 M NaOH. Ajuste el pH de los otros 5 ml de la solución en stock a 7,5 con 3 M NaOH.
      Nota: A pH 5.5, el ácido 12-fosfotúltico (PTA, H3PW12O40) se descompone principalmente en el anión monovacío [PW11O39]7-.

2. Ensamblaje de células de prueba

  1. Montar la celda de prueba según las instrucciones del fabricante.
  2. Remoje un alambre Ag/AgCl en lejía (hipoclorito de sodio) durante 10 minutos después de abradarlo con papel de lija de 600 granos. Coloque el electrodo dentro de la membrana de nanoporos de cuarzo (QNM).
  3. Coloque un electrodo de pellet agCl cilíndrico incrustado en un alambre de plata fuera del QNM.
  4. Una vez configurada la celda de prueba, encienda el programa de suministro de energía y adquisición de datos. Asegúrese de que la lectura de corriente continua es 0 pA en ausencia de solución en la célula de prueba.
  5. Utilice una jeringa conectada a la célula de ensayo a través de una línea de fluidos para añadir una solución de electrolitott tamponado por encima de la cara del QNM y para asegurarse de que la corriente iónica satura el amplificador. Si no lo hace, el QNM puede estar obstruido. Aplique una tensión de pop (1 V) y/o una presión superior a 300 mm Hg para limpiarla. Si eso funciona, reduzca el voltaje y la presión.

3. Formación de Bicapa de Lípidos

  1. Llene la solución en la celda de prueba para que el nivel de solución esté muy por encima de la cara del QNM. A continuación, baje el nivel de solución a través de la jeringa por debajo de la cara, de modo que la corriente disminuya a cero.
  2. Sumerja una punta de pipeta de 10 ml en el vial de lípidos. Empuje en el extremo posterior de la punta de la pipeta y tóquela en el lado del vial para eliminar todos los lípidos visibles.
  3. Toque la punta de la pipeta en la interfaz aire-agua de la solución en la célula de prueba cuando el nivel de solución esté por encima de la cara del QNM y espere de dos a cinco minutos para que el lípido se propague uniformemente.
  4. Bajar lentamente el nivel de solución por debajo de la cara del QNM hasta que la corriente se satura, y luego elevar lentamente el nivel de solución más allá de la cara del QNM para formar una membrana bicapa de lípidos.
    1. Una vez que una bicapa parece formarse (esdecir, cuando la corriente va a cero), intente hacer la venta venta mientras aumenta la presión y asegúrese de que el QNM no esté obstruido. Para reformar la membrana bicapa de lípidos, baje el nivel de solución por debajo de la cara del QNM y elevarlo lentamente.
  5. Si la membrana bicapa lipídica no se formó la primera vez, baje la solución por debajo de la cara y resucitele de nuevo. Si no se forma después de 3 ensayos, agregue más lípidos como se describe en 3.2 y 3.3.
  6. Después de formar una membrana, establezca el desplazamiento de corriente en cero cuando el potencial aplicado sea cero.

4. Formaciónde Poros HL

  1. Añadir 2,5 ng de la muestra de proteína heptamérica preformada purificada (o 250 ng de monomérico de HL) a la célula de ensayo (volumen de 200 ml) para permitir la formación de canales.
  2. Aumente la presión sobre la bicapa con una jeringa hermética al gas (Figura1) después de que se forme una bicapa, para expandir la membrana del QNM y facilitar la inserción de nanoporos. Elevar la contrapresión aplicada típicamente entre 40 a 200 mmHg, dependiendo de cada QNM.
    Nota: El software EBS tiene una función de inserción automatizada que aplica un sesgo más alto (normalmente de 200 a 400 mV) para inducir la formación de poros y, a continuación, reduce automáticamente el voltaje deseado al sesgo de medición una vez que se forma un solo canal.
  3. Después de que se forme un nanoporo, reduzca la contrapresión a aproximadamente 1/2 de la presión de inserción. Si se observan varios canales, retírelos reduciendo significativamente la presión.

5. Partición de racimos metálicos en el Nanopore

  1. Para tener en cuenta los desequilibrios de electrodos, ajuste la tensión de compensación de CC de tal forma que cuando el potencial aplicado se establezca en cero no haya corriente medida.
  2. Antes de agregar la muestra POM, realice un experimentode control para asegurarse de que no hay contaminantes (por ejemplo, popos de traza de un experimento anterior) en el depósito. Específicamente, adquiera un rastro de corriente iónica bajo un potencial aplicado de +120 mV a -120 mV en ausencia de cualquier POP para verificar que no hay bloqueos de corriente espontánea están presentes.
    Nota: Debido a la estructura asimétrica delcanal de HL (Figura 1), la magnitita de la corriente iónica variará para los potenciales aplicados positivos y negativos. La relación de la corriente medida por encima de esta tensión aplicada es indicativa de la orientación de la nanopora HL en la membrana.
  3. Añada la muestra POM vaciando el depósito con solución de racimo metálico a una concentración de 1 a 5 mM. Alternativamente, cargue la muestra en el capilar antes del ensamblaje celular para estudiar la partición de los POP en el otro extremo del canal de HL.
  4. Registre la corriente iónica utilizando el software del fabricante para detectar bloqueos de corriente transitorios causados por la partición de POP individuales en los nanoporos. Estimar las propiedades físicas y químicas de la molécula a partir de la profundidad del bloqueo de corriente iónica, la frecuencia del evento y la distribución del tiempo de residencia de los bloqueos.

6. Ion Channel Recordings and Data Analysis

  1. Adquiera las mediciones de la serie temporal de corriente iónica utilizando un amplificador de alta impedancia y bajo ruido y un sistema de adquisición de datos. Realice las mediciones a una tensión aplicada de -120 mV (en relación con el lado cis del canal) para cada pH.
  2. Aplique un filtro Bessel de 8 polos de paso bajo a la señal, que posteriormente se digitaliza a 500 kHz (esdecir, 2 ms/punto). Extraiga eventos de la serie temporal y analice eventos utilizando el algoritmo ADEPT en el paquete de software MOSAIC 32,33.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En las últimas dos décadas, los poros a escala nanométrica de proteínas unidas a membranas se han demostrado como versátiles sensores de una sola molécula. Las mediciones basadas en nanoporos son relativamente sencillas de ejecutar.  Dos cámaras llenas de solución de electrolitos están separadas por una nanoporo incrustada en una membrana lipídica aislante eléctricamente. Un amplificador de abrazadera de parche o una fuente de alimentación externa proporciona un potencial electrostático a...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Debido a su carga aniónica, los POP probablemente se asocian con los contracations orgánicos a través de interacciones electrostáticas. Por lo tanto, es importante identificar las condiciones adecuadas de la solución y los entornos de electrolitos adecuados (especialmente cationes en solución) para evitar la formación compleja con LOS POP. Se requiere un cuidado especial en la elección del búfer. Por ejemplo, la tasa de captura de POP con soluciones tris(hidroximetil)aminometano y tampón de ácido cítrico es significativa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos el apoyo financiero de la Organización Europea de Biología Molecular para una beca postdoctoral (a J.E.) y una subvención de la NIH NHGRI (a J.J.K.). Agradecemos la ayuda de los profesores Jingyue Ju y Serguéi Kalachikov (Universidad de Columbia) por proporcionar heptérica hl, y por inspirar discusiones con el profesor Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nanopatch DC SystemElectronic Biosciences, Inc., EBS
Millipore LC-PAKMillipore filtro
1,2-Dipitanoyl-sn- Glicero-3-fosfocolina (DPhPC)Avanti Polar Lipids, Alabastro, AL850356P
Decane, ReagentPlus, ≥ 99%,Sigma-AldrichD901
α Lista HLBiological Laboratories, Campbell, CA
Alambre de AgAlfa Aesar
2 mm Electrodo de disco Ag/AgClIn Vivo MetricE202
Sistema amplificador de alta impedanciaBiosciences Electrónica, San Diego, CA
Capilares de cuarzo Célula
de prueba de policarbonato personalizada
Procesamiento y análisis de datos MOSAIChttps://pages.nist.gov/mosaic/
Hidrato de ácido fosfotúngsticoSigma-Aldrich455970
Cloruro de sodioSigma-AldrichS3014
fosfato de sodio monobásico monohidratadoSigma-Aldrich71507
de vacío

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ettedgui, J., Kasianowicz, J. J., Balijepalli, A. Single molecule discrimination of heteropolytungstates and their Isomers in solution with a nanometer-scale pore. Journal of the American Chemical Society. 138 (23), 7228-7231 (2016).
  2. Bezrukov, S., Kasianowicz, J. Current noise reveals protonation kinetics and number of ionizable sites in an open protein ion channel. Physical Review Letters. 70 (15), 2352-2355 (1993).
  3. Kasianowicz, J. J., Bezrukov, S. M. Protonation dynamics of the alpha-toxin ion channel from spectral analysis of pH-dependent current fluctuations. Biophysj. 69 (1), 94-105 (1995).
  4. Please, T. R., Ayub, M. Solid-State Nanopore. Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , Elsevier Inc. 121-140 (2013).
  5. Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature Nanotechnology. 2 (4), 209-215 (2007).
  6. Kasianowicz, J. J., Brandin, E., Branton, D., Deamer, D. W. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13770-13773 (1996).
  7. Akeson, M., et al. Microsecond time-scale discrimination among polycytidylic acid, polyadenylic acid, and polyuridylic acid as homopolymers or as segments within single RNA molecules. Biophysical Journal. 77 (6), 3227-3233 (1999).
  8. Singer, A., Meller, A. Nanopore-based Sensing of Individual Nucleic Acid Complexes. Israel Journal of Chemistry. 49 (3-4), 323-331 (2010).
  9. Jin, Q., Fleming, A. M., Burrows, C. J., White, H. S. Unzipping kinetics of duplex DNA containing oxidized lesions in an α-hemolysin nanopore. Journal of the American Chemical Society. 134 (26), 11006-11011 (2012).
  10. Halverson, K. M., et al. Anthrax biosensor, protective antigen ion channel asymmetric blockade. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34056-34062 (2005).
  11. Oukhaled, G., et al. Unfolding of proteins and long transient conformations detected by single nanopore recording. Physical Review Letters. 98 (15), 158101(2007).
  12. Reiner, J. E., Kasianowicz, J. J., Nablo, B. J., Robertson, J. W. F. Theory for polymer analysis using nanopore-based single-molecule mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12080-12085 (2010).
  13. Robertson, J. W. F., et al. Single-molecule mass spectrometry in solution using a solitary nanopore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8207-8211 (2007).
  14. Baaken, G., Ankri, N., Schuler, A. -K., Rühe, J., Behrends, J. C. Nanopore-based single-molecule mass spectrometry on a lipid membrane microarray. ACS Nano. 5 (10), 8080-8088 (2011).
  15. Angevine, C. E., Chavis, A. E., Kothalawala, N., Dass, A., Reiner, J. E. Enhanced single molecule mass spectrometry via charged metallic clusters. Analytical Chemistry. 86 (22), 11077-11085 (2014).
  16. Astier, Y., Uzun, O., Stellacci, F. Electrophysiological study of single gold nanoparticle/alpha-Hemolysin complex formation: a nanotool to slow down ssDNA through the alpha-Hemolysin nanopore. Small. 5 (11), 1273-1278 (2009).
  17. Chavis, A. E., Brady, K. T., Kothalawala, N., Reiner, J. E. Voltage and blockade state optimization of cluster-enhanced nanopore spectrometry. Analyst. 140 (22), 7718-7725 (2015).
  18. Campos, E., et al. Sensing single mixed-monolayer protected gold nanoparticles by the α-hemolysin nanopore. Analytical Chemistry. 85 (21), 10149-10158 (2013).
  19. Campos, E., et al. The role of Lys147 in the interaction between MPSA-gold nanoparticles and the α-hemolysin nanopore. Langmuir. 28 (44), 15643-15650 (2012).
  20. Baaken, G., et al. High-Resolution Size-Discrimination of Single Nonionic Synthetic Polymers with a Highly Charged Biological Nanopore. ACS Nano. 9 (6), 6443-6449 (2015).
  21. Berzelius, J. J. Beitrag zur näheren Kenntniss des Molybdäns. Annalen Der Physik. 82 (1), 369-392 (1826).
  22. Long, D. -L., Burkholder, E., Cronin, L. Polyoxometalate clusters, nanostructures and materials: from self assembly to designer materials and devices. Chemical Society Reviews. 36 (1), 105-121 (2007).
  23. Muller, A., et al. Polyoxovanadates: High-nuclearity spin clusters with interesting host-guest systems and different electron populations. Synthesis, spin organization, magnetochemistry, and spectroscopic studies. Inorganic Chemistry. 36 (23), 5239-5250 (1997).
  24. Rausch, B., Symes, M. D., Chisholm, G., Cronin, L. Decoupled catalytic hydrogen evolution from a molecular metal oxide redox mediator in water splitting. Science. 345 (6202), 1326-1330 (2014).
  25. Dolbecq, A., Dumas, E., Mayer, C. R., Mialane, P. Hybrid organic-inorganic polyoxometalate compounds: from structural diversity to applications. Chemical Reviews. 110 (10), 6009-6048 (2010).
  26. Busche, C., et al. Design and fabrication of memory devices based on nanoscale polyoxometalate clusters. Nature. 515 (7528), 545-549 (2014).
  27. Pope, M., Müller, A. Polyoxometalates: From Platonic Solids to Anti-Retroviral Activity. 10, Springer Science & Business Media. Dordrecht. (2012).
  28. Rhule, J. T., Hill, C. L., Judd, D. A., Schinazi, R. F. Polyoxometalates in medicine. Chemical Reviews. 98 (1), 327-358 (1998).
  29. Gao, N., et al. Transition-metal-substituted polyoxometalate derivatives as functional anti-amyloid agents for Alzheimer's disease. Nature Communications. 5, 3422(2014).
  30. Pope, M. T. Heteropoly and Isopoly Oxometalates. 8, Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1983).
  31. Braha, O., et al. Designed protein pores as components for biosensors. Chemistry & Biology. 4 (7), 497-505 (1997).
  32. Forstater, J. H., et al. MOSAIC: A modular single-molecule analysis interface for decoding multistate nanopore data. Analytical Chemistry. 88 (23), 11900-11907 (2016).
  33. Balijepalli, A., et al. Quantifying Short-Lived Events in Multistate Ionic Current Measurements. ACS Nano. 8, 1547-1553 (2014).
  34. Misakian, M. M., Kasianowicz, J. J. J. Electrostatic influence on ion transport through the alphaHL channel. Journal of Membrane Biology. 195 (3), 137-146 (2003).
  35. Piguet, F., et al. Identification of single amino acid differences in uniformly charged homopolymeric peptides with aerolysin nanopore. Nature Communication. 9 (966), (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nanopore DetectionAlpha HemolysinPolyoxometalate AnalysisSingle Molecule DetectionIonic Current MeasurementLipid Bilayer FormationElectrophysiology ApparatusPhosphotungstic AcidMembrane FormationReal time Monitoring

Related Articles