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Artículo de método

Un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina para identificar los Genes Diana de novela NFAT2 en leucemia linfocítica crónica

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DOI:

10.3791/58270

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4 de diciembre de 2018

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1Dept. of Hematology, Oncology and Immunology, University of Tübingen, 2Dept. of Endocrinology, Diabetology, Clinical Pathology and Metabolism, University of Tübingen

En este artículo

Resumen

Leucemia linfocítica crónica (LLC) es la leucemia más común en el mundo occidental. Factores de transcripción NFAT son importantes reguladores del desarrollo y activación de numerosos tipos de células. Aquí, presentamos un protocolo para el uso de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en las células CLL humanas para identificar los genes de la nueva diana de NFAT2.

Resumen

Leucemia linfocítica crónica (LLC) se caracteriza por la expansión de clones de células B malignas y representa la leucemia más común en los países occidentales. La mayoría de los pacientes CLL muestra un curso indolente de la enfermedad, así como un fenotipo anérgico de sus células de la leucemia, refiriéndose a un receptor de la célula de B no responde al estímulo externo. Recientemente hemos demostrado que el factor de transcripción NFAT2 es un regulador crucial de anergia en CLL. Un desafío importante en el análisis de la función de un factor de transcripción en diferentes enfermedades es la identificación de sus genes diana. Esto es de gran importancia para la elucidación de los mecanismos patogénicos y posibles intervenciones terapéuticas. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es una técnica clásica para demostrar las interacciones DNA proteína y puede, por tanto, utilizarse para identificar los genes objetivo directo de factores de transcripción en células de mamíferos. Aquí, el ChIP se utilizó para identificar LCK como gene del objetivo directo de NFAT2 en células humanas de la CLL. ADN y las proteínas asociadas son reticuladas con formaldehído y posteriormente cortado por sonicación en fragmentos de ADN de aproximadamente 200-500 pares de bases (bp). Reticulado fragmentos de ADN asociados con NFAT2 son entonces selectivamente immunoprecipitated de restos celulares usando un anticuerpo αNFAT2. Después de la purificación, se detectan asociadas fragmentos de ADN mediante PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). Secuencias de ADN con evidente enriquecimiento representan regiones del genoma que están dirigidas por NFAT2 en vivo. Corte adecuado de la DNA y la selección de los anticuerpos requeridos son particularmente cruciales para la exitosa aplicación de este método. Este protocolo es ideal para la demostración de interacciones directas de NFAT2 con genes de la blanco. Su principal limitación es la dificultad para emplear viruta en ensayos a gran escala, análisis de los genes diana de múltiples factores de la transcripción en organismos intactos.

Introducción

Leucemia linfocítica crónica (CLL) representa la leucemia más común en adultos en países occidentales, exhibiendo distinta acumulación de CD19, CD23 y CD5 expresando B madura las células1. Mayoría de los pacientes presentan un curso indolente de la enfermedad, que no es necesario tratamiento específico durante muchos años. Por el contrario, algunos pacientes demuestran progresión rápida que requieren las intervenciones terapéuticas inmediatas con inmune-quimioterapia o terapias dirigidas2,3. Factor nuclear de células T activadas (NFAT) es una familia de factores de transcripción que controla varios desarrollo y procesos de activación en numerosas células tipos4,5,6. Recientemente hemos demostrado sobreexpresión y activación constitucional de NFAT2 en las células CLL de los pacientes con enfermedad indolente7. Aquí, regula un estado insensible a la estimulación de receptores de células B llamado anergia7. Para demostrar que NFAT2 se une al promotor linfocitos proteína tirosina quinasa (LCK) y regula la expresión de LCK en las células CLL humanas, un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina específicos (ChIP) fue desarrollado y empleado.

ChIP es una de las varias técnicas para investigar el papel de factores de transcripción en el gene expresión8. Expresión génica es bien orquestada de manera muy compleja por varios reguladores con factores de transcripción tomando parte insustituible en este proceso9,10,11,12. Factores de transcripción que regulan la expresión génica en un contexto espacial y temporal se han identificado en muchas especies (por ejemplo, para el desarrollo y diferenciación)13,14,15, 16,17,18. Errores en los mecanismos de control complejas que involucran factores de transcripción pueden conducir a una variedad de procesos patológicos incluyendo cáncer19,20. Por lo tanto, la identificación de factores de transcripción y sus respectivos objetivos podría ofrecer nuevas vías terapéuticas21,22. Para investigar este intrigante campo varios métodos están disponibles como ChIP, análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA), varios ensayos de pull-down de ADN y ensayos reportero8,11,12, 23 , 24.

Para demostrar que un cierto factor de transcripción interactúa con regiones específicas del genoma en vivo, ChIP es una técnica ideal25. Para ello, ADN y proteínas asociadas en las células vivas son reticuladas utilizando radiación UV o formaldehído (ChIP reticulado, XChIP). Este paso se omite para obtener ADN mejor y la recuperación de proteína en el supuesto nativo ChIP (NChIP)26. Posteriormente, los complejos DNA-proteína se esquilan por sonicación en fragmentos de aproximadamente 200-500 pares de bases (PB) y immunoprecipitated de la ruina de la célula usando un anticuerpo específico contra el factor de transcripción de interés. Los fragmentos de ADN asociados son entonces purificados y caracterizados por PCR, clonación molecular y secuenciación. Técnicas alternativas utilizan micromatrices (ChIP-on-Chip) o la secuenciación de próxima generación (ChIP-Seq) para analizar la immunoprecipitated ADN.

ChIP fue introducido por Gilmour y Lis en 1984 cuando utilizan UV de luz al ADN de reticulación covalente y enlazado a proteínas en la vida de las bacterias27. Lisis celular y la inmunoprecipitación de la ARN polimerasa bacteriana, se utilizaron sondas específicas de genes conocidos para mapear la distribución en vivo y la densidad de la ARN polimerasa. El método fue utilizado posteriormente por los mismos investigadores a analizar la distribución de la eucariota ARN polimerasa II en genes de proteínas de choque térmico en Drosophila28. El ensayo XChIP fue perfeccionado por Varshavsky y compañeros de trabajo que utilizan por primera vez formaldehído Cross-linking para estudiar la Asociación de la histona H4 con calor choque proteína genes29,30. El enfoque NChIP, que lleva la ventaja de una mejor recuperación de DNA y proteínas debido a epitopos naturalmente intacto y, por lo tanto, una mayor especificidad de anticuerpo, primero fue descrito por Hebbes y colegas en 198831.

La ventaja del ChIP en comparación con otras técnicas para analizar las interacciones DNA-proteína es en realidad, que la interacción real de un factor de transcripción puede ser investigado en vivo y sin sondas o condiciones artificiales creadas por tampones o geles son empleado8,11,12. Mediante la combinación de ChIP con secuenciación de próxima generación, pueden identificarse múltiples objetivos simultáneamente.

Principales limitaciones de esta técnica son su limitada aplicabilidad a los ensayos a gran escala en organismos intactos25. El análisis de patrones de expresión génica diferencial también pueden ser difícil usando técnicas de ChIP si las proteínas respectivas se expresan sólo en niveles bajos o durante las ventanas de tiempo estrecho. Otro factor potencialmente limitante es la disponibilidad de un anticuerpo apropiado para ChIP11.

El protocolo ChIP presentado aquí puede ser empleado para la identificación en vivo de genes diana de un factor de transcripción por PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). Específicamente, el objetivo era identificar los genes de la nueva diana de NFAT2 en CLL. ChIP fue elegido debido a su potencial para demostrar directamente el enlace de NFAT2 a las regiones promotoras de genes diferentes en condiciones naturales en células humanas del paciente CLL.

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Protocolo

Todos los experimentos realizados con material humano fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad de Tübingen y se obtuvo consentimiento informado de todos los pacientes que contribuyeron las muestras para este estudio.

1. aislamiento y estimulación de Jurkat células

Nota: Para optimizar el protocolo, utilice la línea de células Jurkat que conoce para expresar los niveles de NFAT2. Todas las medidas se realizan bajo campana de flujo laminar.

  1. Preparar 50 mL de RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS y 1% de penicilina/estreptomicina por calentamiento a 37 ° C en un baño de agua.
  2. Cultura para 1-2 d en un frasco de cultivo celular en 37 ° C y 5% de CO2 en 20 mL de RPMI 1640 suplementado con 10% FCS y 1% penicilina/estreptomicina a una densidad de aproximadamente 2 x 106 células/mL de células Jurkat (las células se cuentan con Trypan coloración azul y una Cámara Neubauer al microscopio) y cosechar por centrifugación durante 5 min a 200 x g.
  3. Quite el sobrenadante con una pipeta y resuspender las células en 10 mL de RPMI 1640 suplementado con 10% FCS y 1% de penicilina/estreptomicina. Posteriormente, contar las células con una tinción azul de trypan convencional y una cámara de Neubauer al microscopio.
  4. Centrifugar las células en el paso 1.3 por 5 min a 200 x g y eliminar el sobrenadante por aspiración. Entonces, resuspender las células en una densidad de 2 x 107 células/mL de RPMI 1640 suplementado con 10% FCS y 1% de penicilina/estreptomicina y transferir 1 mL en un tubo de 5 mL convencional nuevo mediante pipeteo.
  5. Estimular las células añadiendo 32,4 nM forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) y ionomycin 1 μm. Luego Incube las células de 16 h a 37 ° C y 5% de CO2 con la tapa del tubo abierto (para evitar la contaminación, una película permeable al aire puede ser utilizada).

2. aislamiento y estimulación de las células CLL principal de pacientes humanos

Nota: Las muestras del paciente se adquirió y estimuladas como se describió anteriormente7. Todas las medidas se realizan bajo campana de flujo laminar.

  1. Preparar el equipo necesario para extraer la sangre de los pacientes y realizar una separación del gradiente de densidad: agujas de 21 G, torniquete, NH4-heparina-sangre jeringas de colección (p. ej., S-monovettes), 1 x PBS y medio de gradiente de densidad (densidad 1,077 g/mL) .
  2. Sobre venopunción, extraer la sangre de pacientes CLL (ca. 40 mL de sangre por paciente) en las jeringas. Luego transferir la sangre en tubos cónicos de 50 mL. Lavar la jeringa con 10 mL de PBS y piscina de la sangre-PBS-suspensión en los tubos de 50 mL (ajustar el número de tubos para el volumen de sangre).
  3. Preparar 15 mL de medio de gradiente de densidad en un tubo cónico de 50 mL fresco. Posteriormente, capa 35 mL de la suspensión de sangre PBS con cuidado en el medio de gradiente de densidad. Para ello, sujete el tubo en un ángulo plano y pipeta lentamente la sangre-PBS-suspensión contra la pared inferior del tubo cónico de 50 mL. Como más de la sangre-PBS-suspensión está acumulando en el tubo cónico de 50 mL, aumentar el ángulo del tubo hasta un ángulo recto. Repita este paso según el volumen de la sangre-PBS-suspensión.
  4. Realizar la centrifugación a 560 x g durante 20 min (sin freno), a continuación extraer la fase de células mononucleares que contiene las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Para ello, recoger la interfase blanca de la separación del gradiente de densidad con una pipeta serológica de 5 mL y transferir a un tubo cónico de 50 mL nuevo.
  5. Llene la suspensión de células a 50 mL con PBS y centrifugar durante 5 min a x 360 g. Eliminar el sobrenadante por aspiración. Repita este paso con centrifugación durante 5 min a x 275 g. Entonces, la piscina las células de un paciente en 5-10 mL de PBS en un tubo cónico de 50 mL.
  6. Contar las células como se describe en 1.3.
    Nota: Depende de la proporción de células de CLL en el PBMCs aislados, si las células se pueden utilizar directamente para este procedimiento o un aislamiento de la célula de B debe llevarse a cabo, por ejemplo, por medio magnético celular clasificación (MACS). El aislamiento de la célula de B se recomienda pero puede omitirse si la proporción de células de la CLL es superior al 95% de linfocitos totales (determinados mediante citometría de flujo). Sangre de CLL pacientes es fijo y lisis según las instrucciones del fabricante. Entonces una coloración con los anticuerpos FITC CD19 y CD5-PE se realiza según las instrucciones del fabricante y las células se analizan mediante citometría de flujo. Un paciente ejemplar se muestra en la figura 1, en el que la proporción de células de la CLL es 89.03%. Así, un aislamiento de la célula de B deberá llevarse a cabo en este paciente. La proporción de células B fisiológicas es insignificante (3.72% en el ejemplo).
  7. Lavar las células con 10 mL de precalentado (37 ° C) RPMI 1640 complementado con 10% FCS, 1% de penicilina/estreptomicina, 100 mM no esenciales aminoácidos, piruvato de sodio 1 mM y 50 mM de β-mercaptoetanol durante 5 minutos a 200 x g y eliminar el sobrenadante por aspiración.
  8. Ajuste las células a 2 x 107 células/mL en RPMI 1640 suplementado con 10% FCS, 1% de penicilina/estreptomicina, aminoácidos no esenciales de 100 mM, 1 mM sodio piruvato y 50 mM β-mercaptoetanol (37 ° C) y relleno 1 mL de la suspensión de células en un tubo de 5 mL.
    Nota: El ß-mercaptoetanol se emplea para contrarrestar el estrés oxidativo.
  9. Estimular las células añadiendo 32,4 nM PMA y ionomycin 1 μm. Luego Incube las células de 16 h a 37 ° C y 5% de CO2 con la tapa del tubo abierto (para evitar la contaminación, una película permeable al aire puede ser utilizada).
    Nota: Para reducir el nivel de estrés las células pueden ser descansadas por 1 h a 37 ° C y 5% de CO2 en la incubadora antes de la 16 h de la estimulación.

3. fijación, lisis celular y corte de cromatina

Nota: Las muestras del paciente células Jurkat fijo y lisis con un kit de ChIP disponible comercialmente según las instrucciones del fabricante con modificaciones como se describe previamente7. La fijación se realiza bajo campana de flujo laminar.

  1. Preparar un tubo de 1,5 mL con 1 mL de formaldehído al 37%, un tubo de 1,5 mL con 1 mL de glicina de 1,25 M, un tubo de 5 mL con 4 mL de 1 x PBS y una caja con hielo para la fijación de las células.
  2. Después de la estimulación de las células para el tiempo de incubación respectivo en el paso 1.5 o 2.9, gira los tubos de 5 mL a 200 x g durante 5 minutos y resuspender las células en 500 μl de PBS en los tubos de 5 mL.
  3. Añadir formaldehído μm 340 (13,5 μl de formaldehído al 37%) a las células. Después de breve mezclar mediante pipeteo con cuidado hacia arriba y hacia abajo incubar la suspensión durante 2,5 minutos (células de Jurkat) o 5 minutos (muestra del paciente) a temperatura ambiente.
    Nota: Se necesita tiempo de fijación prolongada de pilas asegurar óptima de corte.
  4. Añadir glicina 125 mM (57 μl de 1,25 M glicina) para detener la fijación e incubar otro 5 minutos poner las células en hielo inmediatamente después y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por aspiración.
  5. Lavan las células dos veces con 1 mL de PBS helado a 200 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante cada vez por aspiración.
    Nota: Después de la fijación, el protocolo puede pausarse. Las células fijas deben ser almacenadas a-80 ° C. Para comprobar, si el epítopo del anticuerpo diseñado para su uso en el siguiente protocolo no se enmascara a través de la fijación, pueden utilizarse muestras adicionales para el análisis mediante electroforesis en gel de SDS-PAGE y Western blot. Estos pasos se realizan con 100 μg de proteína según las instrucciones del fabricante. Todos los anticuerpos αNFAT2 se utilizan a una dilución de 1: 1000, el anticuerpo de la GAPDH en la dilución de 1:10000. Una imagen ejemplar de muestras fijadas de células Jurkat con anticuerpos apropiados e inapropiados se muestra en la figura 2.
  6. Resuspender el precipitado de células en 5 mL de tampón de lisis disponibles comercialmente 1 transfiriendo hacia arriba y hacia abajo. Luego, coloque las muestras en el hielo en una coctelera e incúbelos durante 10 minutos agitando.
    Nota: Antes de la lisis, las células pueden ser desintegradas por 10 s en nitrógeno líquido. Esto es útil para las células de Jurkat pero debe evitarse en las muestras primarias. Para la desintegración, coloque los tubos de 5 mL durante 5 s en 5-10 mL de nitrógeno líquido en un contenedor específico. Use gafas de seguridad y guantes de seguridad apropiados.
  7. Posteriormente, centrifugar los tubos a 500 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar cuidadosamente el sobrenadante mediante pipeteo.
  8. Homogeneizar las células en 5 mL de tampón de lisis disponibles comercialmente 2 transfiriendo hacia arriba y hacia abajo e incubar por 10 min en hielo agitando. Luego centrifugar los tubos a 500 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar cuidadosamente el sobrenadante mediante pipeteo.
  9. Resuspender el precipitado de células en 500 μl (células de Jurkat) o 140 μl (muestras) de corte tampón 1 que contiene 1 x inhibidor de la proteasa (5 μl o 1,4 μL, respectivamente) e incubar la mezcla por 10 min en hielo.
  10. Para el corte de la cromatina, trasvasar 140 μl de la suspensión de células de paso 3.9 tubos sonicador (evitar la producción de burbujas de aire y repita este paso si es necesario debido al volumen de la muestra). Colocar los tubos en el ultra-sonicador enfocado a una temperatura de 7 ° C y de corte de 10 minutos (línea celular) o 7,5 minutos (muestras) con una potencia media incidente de 9.375 W para obtener fragmentos de ADN de 200-500 bp.
  11. Finalmente, centrifugar a 15700 x g durante 10 min a 4 ° C en la centrifugadora pequeña y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo de 1,5 mL.
  12. Para comprobar los tamaños de fragmento correspondiente, analizar 20 μl de la cromatina esquilada mediante electroforesis en gel de agarosa 1.5% TBE. Una imagen ejemplar de esquilado cromatina de las células de Jurkat de buena y de mala calidad se muestra en la figura 3. En este punto, el protocolo puede ser potencialmente hizo una pausa. Cromatina esquilada debe almacenarse a-80 ° C.

4. inmunoprecipitación de cromatina

Nota: La inmunoprecipitación de cromatina se realizó con un kit de ChIP disponible comercialmente según las instrucciones del fabricante con modificaciones7.

  1. Calcular el número de immunoprecipitations (70 μl (células de Jurkat) o 15 μl (muestras) de cromatina esquilada más un anticuerpo) y preparar 20 μl de perlas de proteína A cubierto por precipitación en un tubo de 1,5 mL. Lavar los granos en 40 μl de 1 x buffer ChIP 1 por precipitación mediante pipeteo arriba y abajo, dejó las cuentas descansa en un estante magnético durante 1 minuto y eliminar el sobrenadante por pipeteo. Realizar este paso cuatro veces en total. Finalmente, vuelva a suspender las cuentas en el volumen original con el tampón de viruta de 1 x 1.
  2. Para la inmunoprecipitación de sí mismo, usar 10 μg de anticuerpo αNFAT2 (7A6) para capturar NFAT2 con sus secuencias diana encuadernado. Utilizar 2,5 μg de un anticuerpo de IgG de conejo (DA1E) como un control de IgG. Preparar las reacciones en tubos de 1,5 mL fresco como se indica en la tabla 1.
    Nota: Es importante utilizar un anticuerpo monoclonal con alta afinidad cuya epitopo no es enmascarado durante la fijación de este protocolo. Anticuerpos policlonales introducen un nivel adicional de variación, lo que es significativamente más difícil de interpretar adecuadamente los resultados recibidos.
  3. Incubar la mezcla del paso 4.2 durante la noche a 4 ° C en un disco giratorio a 6 rpm.
  4. En el siguiente día girar los tubos durante 5 s a x 7.000 g en la centrífuga pequeña, incubar en un estante magnético durante 1 minuto y eliminar el sobrenadante por aspiración. Lavar los granos una vez con cada uno de la tampones de lavado 1, 2, 3 y 4 consecutivamente.
  5. Para ello, vuelva a suspender las cuentas en 350 μl de tampón de lavado e incubar por 5 min a 4 ° C en un disco giratorio a 6 rpm.
  6. Después de eso, girar los tubos durante 5 s a 7000 x g en la centrifugadora pequeña. Luego, colocarlos durante 1 min en una rejilla magnética, quite el sobrenadante y agregar el siguiente tampón de lavado.
  7. Después el último paso del lavado, retirar el sobrenadante mediante pipeteo, tomar los granos en 100 μl de tampón de elución 1 e incubar por 30 min en un disco giratorio a 6 rpm.
  8. Girar los tubos poco (5 s a 7000 x g en la centrifugadora pequeña) y colocarlos en un estante magnético durante 1 minuto.
  9. Transfiera el sobrenadante mediante pipeteo a un nuevo tubo de 1,5 mL y agregar 4 μL de tampón de elución 2.
  10. Para crear el control de entrada, mix 1 μl de la cromatina esquilada con 99 μl de elución buffer 1 y 4 μL de tampón de elución 2 (en esta configuración, hay tres tubos por paciente: una entrada de control, un control de IgG y una muestra de αNFAT2).
  11. Incubar las muestras durante 4 horas a 65 ° C y 1300 rpm en un agitador de tubo de 1,5 mL. Añada 100 μl de isopropanol al 100%, vortex y vuelta las muestras durante 5 s a 7000 x g en la centrifugadora pequeña.
  12. Suspender las bolas magnéticas disponibles por fondo Vortex, añadir 10 μl de los granos a cada muestra e incubar durante 1 h a temperatura ambiente en un disco giratorio a 6 rpm.
  13. Después de la incubación, girar los tubos durante 5 s a 7000 x g en la pequeña centrífuga y colocarlos durante 1 min en una rejilla magnética. Eliminar el sobrenadante por aspiración.
  14. Resuspender los granos en 100 μl de tampón de lavado 1. Invierta los tubos para mezclar e incubar 5 min a temperatura ambiente en un disco giratorio a 6 rpm.
  15. Girar los tubos durante 5 s a 7000 x g en la centrífuga pequeña, coloque durante 1 min en una parrilla magnética y quite el sobrenadante mediante pipeteo. Repita los pasos 4.13-4.14 con tampón de lavado 2.
  16. Posteriormente, retirar el tampón de lavado por aspiración, suspender los granos en 55 μl de tampón de elución e incubar por 15 min a temperatura ambiente en la rueda giratoria a 6 rpm a fin de eluir el ADN precipitado. Finalmente, girar los tubos durante 5 s a 7000 x g en la centrífuga pequeña, colocar durante 1 min en una rejilla magnética y transferir el sobrenadante a nuevos tubos de 1,5 mL.
    Nota: Aquí el protocolo puede ser potencialmente una pausa. El ADN eluído entonces debe almacenarse a-20 ° C.

5. detección de genes de la blanco NFAT en las células CLL.

  1. Llevar a cabo la reacción de qRT-PCR por duplicado para cada muestra como se indica en la tabla 2.
    Nota: Para la detección de genes de la blanco una PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) se lleva a cabo empleando una mezcla de qRT-PCR comercialmente disponibles con un instrumento de PCR en tiempo real.
  2. Utilice las placas blancas de 96 pocillos de reacción para las reacciones y el instrumento de RT-PCR. Las condiciones de ciclismo son las siguientes: 95 ° C por 30 s, [95 ° C durante 5 s, 60 ° C para 30 s] x 40 ciclos.
    Nota: Una dilución seriada de la entrada (sin diluir o diluido 1:10, 1: 100 y 1: 1000 en agua libre de nucleasas) se utiliza para calcular el enriquecimiento relativo. En células Jurkat, IL-2 fue utilizado como un control positivo de32. CD40L, un objetivo bien conocido de NFAT2 en las células de B, se utilizó como control positivo en las células CLL y LCK como ejemplo para un gene de la novela destino de NFAT2 en CLL33,34. Los cebadores para la región del promotor CD40L, la IL-2 y LCK se describen en la tabla de reactivos específicos y equipos.

6. normalización y análisis de datos

Nota: El enriquecimiento relativo de las regiones promotoras de interés (IL-2, CD40L o LCK) se calcula usando el control de IgG para la normalización.

  1. En primer lugar, determinar valores de Ct (ciclo umbral) para la dilución serial entrada, IL-2, CD40L y la región del promotor LCK mediante el software de evaluación de datos de qRT-PCR.
  2. Definir una curva estándar de las concentraciones por dilución seriada de la entrada. Con esta curva estándar calcule la concentración de IL-2, CD40L y la región del promotor LCK por cada duplicado de cada muestra.
  3. A continuación, calcular la media de los duplicados. A continuación, establezca la muestra de la inmunoprecipitación de IgG como referencia. Definir el enriquecimiento relativo de este ejemplo como 1.0 y comparar la muestra (de la inmunoprecipitación NFAT2) a esta referencia.
  4. Por último, calcular el enriquecimiento relativo dividiendo la concentración de las muestras por la concentración de la referencia de IgG.

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Resultados

La figura 1 muestra un análisis de citometría de flujo ejemplar de un paciente CLL realizado después de la tinción con anticuerpos FITC CD19 y CD5-PE. Figura 1a muestra la compuerta de los linfocitos, que representa a la mayoría de las células en la sangre de los pacientes CLL. Figura 1b muestra la proporción de CD19+/CD5+ CLL las células, que representan el 89.03% de los linfoc...

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Discusión

Los pasos críticos de realizar un exitoso análisis de ChIP son la selección de un anticuerpo apropiado y la optimización de la cromatina corte proceso25. La selección de los anticuerpos αNFAT2 demostrado para ser especialmente difícil durante el desarrollo de este protocolo. Aunque existen varios anticuerpos de αNFAT2 disponibles en el mercado y la mayoría de estos funciona bien para western blot y otras aplicaciones, 7A6 clon fue el único anticuerpo que podría utilizarse con éxito para ChIP

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el DFG concesión MU 3340/1-1 y el Deutsche Krebshilfe conceden 111134 (ambos a MRM). Agradecemos a Elke Malenke excelente asistencia técnica).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 x PBSSigma AldrichD8537
Agitador de tubo de 1,5 ml Themomixer comfortEppendorf5355 000.011Se puede sustituir por instrumentos similares
10X Bolt Sample Reducing AgentThermo ScientificB0009
20X Bolt MES SDS Running BufferThermo ScientificB0002
37 % Formaldehído p.a., ACSRoth4979.1
4X Bolt LDS Tampón de muestraThermo ScientificB0007
Anticuerpo anti-NFAT2Alexis1008505Clon 7A6
Anticuerpo anti-NFAT2Señalización celular8032SClon D15F1
Anticuerpo anti-NFAT2 Grado ChIP Abcamab2796Clon 7A6
centrífuga grande Eppendorf5804RPuede ser sustituido por instrumentos similares
Ratón CD19-FITC BD antihumano555412BiosciencesClon HIB19
CD5-PE ratón BD CD5555353BiosciencesUCHT2
Biocoll (Densidad 1.077 g/ml)MerckL 6115
DNA LoBind Tube 1,5 mLeppendorf22431021
FBS superiorCitómetro de flujo MerckS0615
BD BiosciencesFACSCaliburPuede sustituirse por instrumentos similares
Cóctel de inhibidores de la proteasa y la fosfatasa Halt (100X)Thermo Scientific78440
Dispositivo de transferencia de gel iBlot 2Thermo ScientificIB21001
iBlot 2 Pilas de transferencia, nitrocelulosa, tamaño regularThermo Scientific
Kit iDeal ChIp-seq para HistonasDiagenodeC01010059
Ionomicina sal de calcioSigma AldrichI3909
IRDye 680LT Burro anti-Conejo IgG (H + L), 0,5 mgLI-COR Biosciences926-68023
IRDye 800CW Cabra anti-Ratón IgG (H + L), 0,1 mgLI-COR Biosciences925-32210
Sistema de imagen infrarroja LI-COR ODYSSEYLI-COR BiosciencesB446
LightCycler 480 Placa multipocillo 96, blancoRoche4729692001Se puede sustituir por otras placas en diferentes instrumentos de PCR en tiempo real
Solución de lisis OptiLyse BBeckman CoulterIM1400
M220 Agua de grado AFACovaris520101
M220 Ultrasonido focalizadoCovaris500295
Bastidor magnético, DynaMag-15 ImánThermo Scientific12301DPuede sustituirse por instrumentos similares
MEM Solución de aminoácidos no esenciales 100XMicroscopio Thermo Scientific11140050
Axiovert 25Zeiss451200Puede sustituirse por instrumentos similares
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mmCovaris520045
Neubauer cámara de conteo mejoradaKarl Hecht GmbH &                       Co KG40442012Puede ser sustituido por instrumentos similares
NH4 Heparina MonovetteSarstedt02.1064
Agua sin nucleasasPromegaP1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15 pocillosThermo ScientificNP0323BOX
Odyssey® Tampón de bloqueo (TBS) 500 mLLI-COR Biosciences927-50000
Penicilina/Estreptomicina 100XMerckA2213
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuanta Bio95072-012
PMASigma AldrichP1585
Primer CD40L promotor región delanteraSigma Aldrich5'- ACTCGGTGTTAGCCAGG-3'
Primer CD40L región promotora inversaSigma Aldrich5'-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3'
Primer IL-2 región promotora delanteraSigma Aldrich5'-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3'
Primer IL-2 región promotora inversaSigma Aldrich5'-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3'
Primer LCK región promotora delanteroSigma Aldrich5'-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3'
Primer LCK región promotora inversaSigma Aldrich5'-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3'
Conejo mAb IgG XP IsotipoSeñal de celda de control# 3900SClon DA1E
Instrumento de PCR en tiempo realRocheLightCycler 480Se puede sustituir por instrumentos similares
Mezcladores de rodillosPhoenix InstrumentRS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementThermo Scientific61870010
Safety-Multifly-needle 21GSarstedt851638235
SeeBlue Plus2 Proteína preteñida EstándarThermo ScientificLC5925
Agitador Duomax 1030Heidolph Instruments543-32205-00Se puede sustituir por instrumentos similares
pequeños CentrífugaThermo ScientificHeraeus Fresco 17Se puede sustituir por instrumentos similares
Piruvato de sodioThermo Scientific11360070
ß-MercaptoethanolThermo Scientific21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X)Señalización celular#12498
Solución de azul de tripanoSigma Aldrich93595-50ML
humano clon de IB23001

Referencias

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