Leucemia linfocítica crónica (LLC) es la leucemia más común en el mundo occidental. Factores de transcripción NFAT son importantes reguladores del desarrollo y activación de numerosos tipos de células. Aquí, presentamos un protocolo para el uso de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en las células CLL humanas para identificar los genes de la nueva diana de NFAT2.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina para identificar los Genes Diana de novela NFAT2 en leucemia linfocítica crónica
En este artículo
Resumen
Resumen
Leucemia linfocítica crónica (LLC) se caracteriza por la expansión de clones de células B malignas y representa la leucemia más común en los países occidentales. La mayoría de los pacientes CLL muestra un curso indolente de la enfermedad, así como un fenotipo anérgico de sus células de la leucemia, refiriéndose a un receptor de la célula de B no responde al estímulo externo. Recientemente hemos demostrado que el factor de transcripción NFAT2 es un regulador crucial de anergia en CLL. Un desafío importante en el análisis de la función de un factor de transcripción en diferentes enfermedades es la identificación de sus genes diana. Esto es de gran importancia para la elucidación de los mecanismos patogénicos y posibles intervenciones terapéuticas. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es una técnica clásica para demostrar las interacciones DNA proteína y puede, por tanto, utilizarse para identificar los genes objetivo directo de factores de transcripción en células de mamíferos. Aquí, el ChIP se utilizó para identificar LCK como gene del objetivo directo de NFAT2 en células humanas de la CLL. ADN y las proteínas asociadas son reticuladas con formaldehído y posteriormente cortado por sonicación en fragmentos de ADN de aproximadamente 200-500 pares de bases (bp). Reticulado fragmentos de ADN asociados con NFAT2 son entonces selectivamente immunoprecipitated de restos celulares usando un anticuerpo αNFAT2. Después de la purificación, se detectan asociadas fragmentos de ADN mediante PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). Secuencias de ADN con evidente enriquecimiento representan regiones del genoma que están dirigidas por NFAT2 en vivo. Corte adecuado de la DNA y la selección de los anticuerpos requeridos son particularmente cruciales para la exitosa aplicación de este método. Este protocolo es ideal para la demostración de interacciones directas de NFAT2 con genes de la blanco. Su principal limitación es la dificultad para emplear viruta en ensayos a gran escala, análisis de los genes diana de múltiples factores de la transcripción en organismos intactos.
Introducción
Leucemia linfocítica crónica (CLL) representa la leucemia más común en adultos en países occidentales, exhibiendo distinta acumulación de CD19, CD23 y CD5 expresando B madura las células1. Mayoría de los pacientes presentan un curso indolente de la enfermedad, que no es necesario tratamiento específico durante muchos años. Por el contrario, algunos pacientes demuestran progresión rápida que requieren las intervenciones terapéuticas inmediatas con inmune-quimioterapia o terapias dirigidas2,3. Factor nuclear de células T activadas (NFAT) es una familia de factores de transcripción que con....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los experimentos realizados con material humano fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad de Tübingen y se obtuvo consentimiento informado de todos los pacientes que contribuyeron las muestras para este estudio.
1. aislamiento y estimulación de Jurkat células
Nota: Para optimizar el protocolo, utilice la línea de células Jurkat que conoce para expresar los niveles de NFAT2. Todas las medidas se realizan bajo campana de flujo laminar.
- Preparar 50 mL de RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS y 1% de penicilina/estreptomicina por calentamiento a 37 ° C en un baño de agua.
- Cul....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La figura 1 muestra un análisis de citometría de flujo ejemplar de un paciente CLL realizado después de la tinción con anticuerpos FITC CD19 y CD5-PE. Figura 1a muestra la compuerta de los linfocitos, que representa a la mayoría de las células en la sangre de los pacientes CLL. Figura 1b muestra la proporción de CD19+/CD5+ CLL las células, que representan el 89.03% de los linfoc.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Los pasos críticos de realizar un exitoso análisis de ChIP son la selección de un anticuerpo apropiado y la optimización de la cromatina corte proceso25. La selección de los anticuerpos αNFAT2 demostrado para ser especialmente difícil durante el desarrollo de este protocolo. Aunque existen varios anticuerpos de αNFAT2 disponibles en el mercado y la mayoría de estos funciona bien para western blot y otras aplicaciones, 7A6 clon fue el único anticuerpo que podría utilizarse con éxito para ChIP
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el DFG concesión MU 3340/1-1 y el Deutsche Krebshilfe conceden 111134 (ambos a MRM). Agradecemos a Elke Malenke excelente asistencia técnica).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 x PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Agitador de tubo de 1,5 ml Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Se puede sustituir por instrumentos similares |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehído p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Tampón de muestra | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anticuerpo anti-NFAT2 | Alexis | 1008505 | Clon 7A6 |
| Anticuerpo anti-NFAT2 | Señalización celular | 8032S | Clon D15F1 |
| Anticuerpo anti-NFAT2 Grado ChIP Abcam | ab2796 | Clon 7A6 | |
| centrífuga grande Eppendorf | 5804R | Puede ser sustituido por instrumentos similares | |
| Ratón CD19-FITC BD antihumano | 555412 | Biosciences | Clon HIB19 |
| CD5-PE ratón BD CD5 | 555353 | Biosciences | UCHT2 |
| Biocoll (Densidad 1.077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1,5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Citómetro de flujo Merck | S0615 | |
| BD Biosciences | FACSCalibur | Puede sustituirse por instrumentos similares | |
| Cóctel de inhibidores de la proteasa y la fosfatasa Halt (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| Dispositivo de transferencia de gel iBlot 2 | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Pilas de transferencia, nitrocelulosa, tamaño regular | Thermo Scientific | ||
| Kit iDeal ChIp-seq para Histonas | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomicina sal de calcio | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Burro anti-Conejo IgG (H + L), 0,5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Cabra anti-Ratón IgG (H + L), 0,1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| Sistema de imagen infrarroja LI-COR ODYSSEY | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Placa multipocillo 96, blanco | Roche | 4729692001 | Se puede sustituir por otras placas en diferentes instrumentos de PCR en tiempo real |
| Solución de lisis OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 Agua de grado AFA | Covaris | 520101 | |
| M220 Ultrasonido focalizado | Covaris | 500295 | |
| Bastidor magnético, DynaMag-15 Imán | Thermo Scientific | 12301D | Puede sustituirse por instrumentos similares |
| MEM Solución de aminoácidos no esenciales 100X | Microscopio Thermo Scientific | 11140050 | |
| Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Puede sustituirse por instrumentos similares |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer cámara de conteo mejorada | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Puede ser sustituido por instrumentos similares |
| NH4 Heparina Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Agua sin nucleasas | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15 pocillos | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Tampón de bloqueo (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicilina/Estreptomicina 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor región delantera | Sigma Aldrich | 5'- ACTCGGTGTTAGCCAGG-3' | |
| Primer CD40L región promotora inversa | Sigma Aldrich | 5'-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3' | |
| Primer IL-2 región promotora delantera | Sigma Aldrich | 5'-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3' | |
| Primer IL-2 región promotora inversa | Sigma Aldrich | 5'-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3' | |
| Primer LCK región promotora delantero | Sigma Aldrich | 5'-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3' | |
| Primer LCK región promotora inversa | Sigma Aldrich | 5'-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3' | |
| Conejo mAb IgG XP Isotipo | Señal de celda de control | # 3900S | Clon DA1E |
| Instrumento de PCR en tiempo real | Roche | LightCycler 480 | Se puede sustituir por instrumentos similares |
| Mezcladores de rodillos | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Proteína preteñida Estándar | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Agitador Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Se puede sustituir por instrumentos similares |
| pequeños Centrífuga | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Se puede sustituir por instrumentos similares |
| Piruvato de sodio | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Señalización celular | #12498 | |
| Solución de azul de tripano | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
Referencias
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
