Method Article

Adipo-claro: Un tejido claro método de proyección de imagen tridimensional del tejido adiposo

DOI:

10.3791/58271

⸱

July 28th, 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Metabolism, The Rockefeller University, 2Laboratory of Brain Development and Repair, The Rockefeller University, 3Laboratory of Molecular Genetics, The Rockefeller University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Debido al contenido alto de lípidos, tejido adiposo ha estado desafiando a visualizar utilizando métodos histológicos tradicionales. Adipo-Clear es un tejido de limpieza técnica que permite etiquetado robusta y alta resolución volumétrica fluorescente la proyección de imagen del tejido adiposo. Aquí, describimos los métodos para la preparación de la muestra, tratamiento previo, tinción, limpieza y montaje para la proyección de imagen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El tejido adiposo juega un papel central en la homeostasis de la energía y la termorregulación. Se compone de diferentes tipos de adipocitos, como precursores de adipocitos, células inmunes, fibroblastos, vasos sanguíneos y las proyecciones del nervio. Aunque el control molecular de la especificación del tipo de la célula y cómo interactúan estas células han sido cada vez más delineados, se logra una comprensión más completa de estas células reside en el adiposo por visualizar su distribución y arquitectura a lo largo de todo tejido. Enfoques existentes de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia para analizar la histología adiposa confían en finas secciones parafina-encajadas. Sin embargo, secciones delgadas capturan sólo una pequeña porción de tejido; como resultado, las conclusiones pueden estar sesgadas por qué porción del tejido se analiza. Por lo tanto hemos desarrollado un limpieza técnica, Adipo-claro, para permitir la visualización tridimensional completa de patrones moleculares y celulares en todo los tejidos adiposo el tejido adiposo. Adipo-clara es una adaptación del iDISCO / iDISCO +, con modificaciones específicas a eliminar los lípidos almacenados en el tejido preservando morfología de tejido propio. En combinación con la microscopía de fluorescencia de luz de hoja, aquí demostramos el uso del método para obtener imágenes en alta resolución volumétricas de un tejido adiposo todo Adipo-claro.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hasta hace poco, el tejido adiposo fue concebido como una colección amorfa de células de grasa. En las últimas décadas, nuestra comprensión ha crecido más sofisticada, con grasas, ahora reconocido como un órgano complejo que contiene diferentes tipos de adipocitos, así como precursores de adipocitos, células inmunes, fibroblastos, vasculatura y proyecciones del nervio. Interacciones entre estas células reside en el adiposo han marcado efectos sobre el tejido adiposo y la fisiología y Fisiopatología1. Aunque estudios emergentes han desentrañando importantes mecanismos moleculares subyacentes a ciertas interacciones, una comprensión más integral requiere perfiles estructurales fiables del todo tejido en tres dimensiones (3D).

Nuestro actual conocimiento de la morfología del tejido adiposo en gran parte se basa en el análisis histológico de secciones delgadas (5 μm) con la proyección de imagen relativamente alta magnificación (más de 10 X)2,3. Sin embargo, este enfoque tiene varias limitaciones importantes. Primeras, intrincadas estructuras filamentosas como los nervios simpáticos y la vasculatura que se saben para desempeñar un papel importante en la función adiposo4,5,6,7, son difíciles de evaluar a través de secciones delgadas. En segundo lugar, debido a su forma aparentemente amorfa y la falta de unidades estructurales representativas centrarse, es difícil apreciar las estructuras de tejido adiposo basadas sólo en la sección coloración. En tercer lugar, el tejido adiposo tiene un contenido de lípidos muy alto, creando dificultades en la obtención de secciones seriadas consistente que son adecuadas para la reconstrucción anatómica 3D, un método convencional utilizado para el estudio de la morfología de todo el cerebro8. Teniendo en cuenta estos factores, hay una gran necesidad de un enfoque conjunto de montaje que permiten la visualización en 3D de un depósito adiposo todo mientras todavía lograr resolución celular.

La proyección de imagen volumétrica 3D de un órgano completo es un reto debido a la ocultación de la dispersión de la luz. Una importante fuente de dispersión de la luz en los tejidos biológicos viene de interfaces lípido-acuoso. Aunque los esfuerzos para eliminar la dispersión mediante la eliminación de lípidos han sido permanente para más de un siglo, ha habido un gran número de innovaciones recientes9. Un tal método de remoción de tejido desarrollado recientemente es imágenes en 3D basados en la inmunomarcación de órganos despejó de solvente (iDISCO / iDISCO +)10,11. Sin embargo, el tejido adiposo presenta un desafío particular dado su alto nivel de lípidos y por lo tanto, modificaciones adicionales a la iDISCO iDISCO + protocolo son necesarios para extraer completamente los lípidos mientras que protege el tejido contra colapso. El protocolo modificado que hemos desarrollado, ahora se llama Adipo-claro, emplea delipidation basado en diclorometano/metanol de tejido adiposo para conseguir la óptima transparencia conveniente para la proyección de imagen volumétrica alta resolución12. Porque el delipidation paso en gran parte arrestina endógeno expresan proteínas fluorescentes GFP y RFP, visualización de tales proteínas debe lograrse por inmunomarcación. En general, este Protocolo simple y robusto se puede aplicar para estudiar la organización nivel de tejido adiposo residente células, rastreo de linaje de células progenitoras de adipocito y adiposo morfogénesis durante el desarrollo.

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Protocol

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Experimentación y cuidado de los animales se realizaron según procedimientos aprobados por el Comité de uso de la Universidad de Rockefeller y atención institucional del Animal.

1. preparación de tejido

  1. Realizar perfusión intracardiaca estándar con 20 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) a 4 ° C hasta que la sangre se extrae completamente el tejido.
  2. Cambiar la solución a 20 mL de solución fijadora (4% paraformaldehido (PFA) en PBS 1 x) a 4 ° C hasta que el cuello y la cola se refuerza significativamente.
    PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico. Evite el contacto con la piel, ojos y mucosas. Soluciones deben hacerse dentro de una campana de humos.
  3. Diseccionar las almohadillas grasas de interés cuidadosamente para quitar la almohadilla de grasa entera sin dañarlo. Use pinzas de punta Roma para evitar pellizcar o apretar el tejido. Evitar contaminar el tejido disecado con cualquier piel.
  4. -Fijar el tejido en 4% PFA en PBS 1 x durante la noche a 4 ° C. Para cada cojín gordo, después fije con ~ 10 mL de solución de fijación en un tubo cónico de 15 mL.
  5. Lavar el tejido 3 veces (1 h) con 1 x PBS a temperatura ambiente (RT).
  6. Guarde el tejido para a corto plazo (hasta 2 semanas) en PBS 1 x a 4 ° C y protegido de la luz. Para almacenamiento a largo plazo (p. ej., 1-2 años), cambiar el búfer a 1 x PBS con 0.05% de azida de sodio (como conservante).
    PRECAUCIÓN: La azida sódica es altamente tóxica cuando se ingiere por vía oral o absorbe por la piel. Concentrado de azida de sodio soluciones (al 5% o mayor) deben ser manipuladas bajo una campana de humos.

2. Delipidation y permeabilización

Tiempo: 1-2 días

  1. Preparar 20%, 40%, 60% y 80% metanol gradiente con B1n tampón (tabla 1) (v/v), por ejemplo, para 20% metanol/B1n tampón, mezclan 20 mL de metanol y 80 mL de buffer B1n. Almacenar todos los búferes a 4 ° C. Cristales de glicina precipitará de 60% y 80% metanol/B1n buffers debido a la saturación. Evitar la eliminación de los cristales; Use el líquido para los lavados siguientes.
    PRECAUCIÓN: El metanol es volátil, irritante e inflamable. Evite la piel o contacto con los ojos.
  2. Retire suavemente el pelo de la muestra bajo un microscopio de disección. Los cabellos, pelusas o restos unido a la muestra hará sombras durante proyección de imagen. Transferir la muestra limpia en un tubo nuevo.
  3. Realizar todos los pasos siguientes en hielo o a 4 ° C a menos que se indique lo contrario. Para pequeñas muestras (por ejemplo, posteriores subcutáneo/perigonadal cojines gordos de ratones jóvenes lean), utiliza tubos de microcentrífuga de 2 mL con 1.6 mL de la solución. Para muestras grandes o las muestras con contenido alto de lípidos (por ejemplo, cojines gordos de ratones obesos), utiliza tubos de 5 mL con 4 mL de la solución.
    1. Colocar los tubos con las muestras horizontalmente en un agitador orbital a ~ 100 rpm. Asegúrese de que las muestras se pueden mover libremente dentro del tubo.
  4. Deshidratar la muestra en una serie gradual de 20%, 40%, 60%, 80% y 100% metanol/B1n tampón para el tiempo indicado (tabla 2). Reducir al mínimo la solución remanente.
  5. Delipidate la muestra con 100% diclorometano (DCM) (3 veces), cada uno con el tiempo de incubación indicado en la tabla 2. La muestra debe hundirse hasta el fondo del tubo en el extremo de los lavados de DCM de segunda y terceros. Si no, prolongar el tiempo de incubación para delipidation completo (p. ej., se extiende desde 30 min hasta 1-2 h).
    PRECAUCIÓN: DCM debe manejarse dentro de una campana de humos. Utilizar envases de vidrio para tubos de microcentrífuga y almacenamiento que se hacen del polipropileno para incubaciones. Los tubos de microcentrífuga no deben utilizarse para el almacenamiento a largo plazo de DCM. Platos de Petri y pipetas que están hechas de poliestireno no son compatibles con DCM. DCM es altamente volátil. Transferir la muestra en solución fresca rápidamente para evitar la desecación.
  6. Lavar dos veces con metanol al 100% para el tiempo indicado (tabla 2).
  7. Opcional: Si la muestra no es bien perfundida, el color de la hemoglobina de los glóbulos rojos restantes podría causar fuerte autofluorescencia. Bleach con 5% H2O2 en metanol (1 volumen de 30% H2O2 a 5 volúmenes de metanol) durante la noche a 4 ° C.
  8. Rehidratar la muestra en una serie de buffer metanol/B1n invertida: 80%, 60%, 40%, 20% metanol/B1n y 100% B1n tampón (2 veces) por el tiempo indicado (tabla 2).
  9. Lavar la muestra con buffer PTxwH (tabla 1) por 2 h a TA.
  10. Almacenar la muestra de delipidated en PTxwH buffer a 4° C (hasta 1 año) o proceder de inmediato con el paso de inmunotinción.

3. todo montaje inmunotinción

Tiempo: 8-10 días

Nota: Todos los pasos siguientes deben realizarse en RT si no se indica lo contrario, con agitación y protección de la luz. Para pequeñas muestras, utilice tubos de microcentrífuga de 2 mL con 1.6 mL de solución. Para muestras grandes, use tubos de 5 mL con 4 mL de solución. Se recomienda validar primero los anticuerpos en pequeños trozos de tejido o las secciones de tejido tratado con metanol.

  1. Diluir el anticuerpo primario en buffer de PTxwH a la concentración recomendada. Centrifugue la solución de anticuerpo diluido a ~ 20.000 x g durante 10 min evitar introducir anticuerpos precipitados o agregados.
  2. Incubar la muestra de delipidated con la solución de anticuerpo primario durante el tiempo indicado (tabla 2).
  3. Lavar la muestra con buffer de PTxwH en una serie de pasos de incubación: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h y durante la noche.
  4. Diluir el anticuerpo secundario en buffer de PTxwH a la concentración recomendada. Centrifugue la solución de anticuerpo diluido a ~ 20.000 x g durante 10 min evitar introducir anticuerpos precipitados o agregados.
    Nota: Para evitar el alto fondo causada por tejido autofluorescencia, anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos que emiten luz en las regiones rojizas y far-red se recomiendan. Dependiendo del número de líneas de láser disponibles en un microscopio, hasta marcadores de 3-4 puede ser reflejada al mismo tiempo en una muestra.
  5. Incubar la muestra con la solución de anticuerpo secundario durante el tiempo indicado (tabla 2).
  6. Muestra lavado con tampón de PTxwH en una serie de pasos de incubación: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h y durante la noche.
  7. Opcional: Para los tipos de tejido que son frágiles, fijar el tejido manchado con 4% PFA en 1 x PBS durante la noche a 4 ° C para ayudar a conservar la morfología del tejido.
    Nota: Este paso puede aumentar la proyección de imagen de fondo. No es necesario realizar este paso para tejido adiposo.
  8. Lavar la muestra con PBS 1 x en una serie de pasos de incubación: 5 min, 10 min y 30 min.
  9. Suavemente Quite la pelusa de la muestra bajo un microscopio de disección.

4. tejido claro

Tiempo: 1-2 días

  1. Opcional: Embeber la muestra en agarosa para facilitar el montaje de la muestra para microscopía de luz de hoja.
    Nota: Este paso se recomienda para que el tejido adiposo estabilizar su forma durante la proyección de imagen.
    1. Prepare la solución de empotrar con agarosa al 1% en PBS x 1 (w/v). Enfríe la solución de empotrar ~ 40 ° C para evitar exponer la muestra a un calor excesivo.
    2. Coloque la muestra limpia en un molde (p. ej., placa de Petri o peso barco) y colocar en la posición deseada. Evitar cualquier arrastre de líquido. Suavemente Vierta la solución empotrada sobre la muestra. Evitar burbujas de aire.
    3. Deje que la agarosa solidificar completamente en corte de ruta hacia fuera de un bloque que contiene la muestra.
      Nota: Todos los pasos siguientes incluyendo incubaciones durante la noche deben llevarse a cabo en RT, con agitación y protección de la luz. Para pequeñas muestras, utilice tubos de microcentrífuga de 2 mL con 1.6 mL de solución. Para muestras grandes, use tubos de 5 mL con 4 mL de solución.
  2. Deshidratar la muestra en el gradiente metanol con H2O: 25%, 50%, 75% y 100% (3 veces) para el tiempo indicado (tabla 2).
    Nota: Muestra puede dejarse toda la noche en el paso de metanol al 100%.
  3. Incubar la muestra en DCM de 100% durante 1 h con agitación (3 veces). Muestra debe hundirse hasta el fondo del tubo al final de cada lavado de DCM. Si no, prolongar el tiempo de incubación para asegurar el retiro completo de metanol. Muestra se puede dejar toda la noche en el paso de DCM de 100%.
  4. Incubar la muestra en Éter dibencílico (DBE) durante una noche con suave agitación para lograr emparejar el índice de refracción.
    Nota: Muestra eventualmente se volverá transparente en luz visible.
    PRECAUCIÓN: El DBE es peligroso. Evitar cualquier contacto con la piel. Manejar dentro de una campana de humos con dos capas de guantes. Deseche los guantes tan pronto como se contamina con DBE. Utilizar envases de vidrio para tubos de microcentrífuga y almacenamiento (polipropileno) para incubaciones. Los tubos de microcentrífuga no deben utilizarse para el almacenamiento a largo plazo de DBE. Platos de Petri y pipetas que están hechas de poliestireno no son compatibles con DBE. Limpie cualquier derrame con etanol al 100%.
  5. Incubar la muestra con DBE fresca con una leve agitación para tienda de 2 h. la muestra a temperatura ambiente en la oscuridad o vaya directamente a la proyección de imagen.
    Nota: Las muestras se recomiendan ser reflejada dentro de un mes. Aunque algunos fluoróforos son más estables que otros, no se recomienda el almacenamiento a largo plazo de las muestras en esta etapa.

5. microscopía

  1. Proyección de imagen con un microscopio de luz de hoja que es compatible con DBE.
    Nota: Sólo los objetivos que son aprobados para la proyección de imagen basados en solventes orgánica y con el índice de refracción de DBE pueden utilizarse como sumergir objetivos en proyección de imagen inmerso de DBE.
    1. Montaje de la muestra de agarosa incrustada en un soporte que puede impedir el movimiento durante la proyección de imagen. Sumergir la muestra en una cámara llena de DBE.
    2. Recoger un z-stack que cubre toda la muestra (p. ej., aumentos de 1-2) para obtener tejido conjunto distribución/estructura del marcador de interés.
    3. Cambiar a un objetivo con aumento mayor (por ejemplo, aumento de X 4-12) a acercarse a las regiones de interés para obtener imágenes detalladas estructuras.
      Nota: El colágeno es una importante contribución a la matriz extracelular del tejido adiposo, que rodea todas las células de grasa13. Colágeno tiene un espectro de emisión típico que van alrededor de 400 nm a 550 nm14. Proyección de imagen la muestra con la línea de 488 láser (verde) y que recoge la luz emitida en un rango de longitud de onda que se encuentra dentro del espectro de emisión del colágeno (p. ej., 525-550 nm) proporcionará la señal de la autofluorescencia de tejido, que fue demostrada previamente para delinear el contorno de la célula grasa y general arquitectura de tejido12.
  2. La proyección de imagen con un invertido confocal o un microscopio de dos fotones.
    1. Coloque la muestra de agarosa-incrustado en una diapositiva de la cámara con un fondo de vidrio sin tocar ninguna parte de plástico (o de otra cámara de proyección de imagen de DBE-compatible que puede sellar). Asegúrese de que no salga DBE.
    2. Elegir los objetivos con largas distancias de trabajo para lograr una penetración más profunda.
      Nota: la proyección de imagen se debe hacer con un microscopio confocal o dos fotones invertido a través del fondo de cristal de la diapositiva de la cámara. Evitar el contacto directo entre la muestra y sumergir objetivos que no son sugeridos para la proyección de imagen basada en DBE.

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Results

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Adipo-claro preparado toda grasa pastillas pueden ser reflejadas en 3D para analizar cómo interacciones de tejido celular y la morfología son afectadas en los Estados obesos y magros. Este método puede aplicarse fácilmente para analizar estructura adiposa general recogiendo la señal de la autofluorescencia de tejido en el canal verde. Previamente hemos demostrado que la autofluorescencia señal en recubrimientos adiposos favorablemente con perilipin coloración, un marcador utilizado para d...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adipo-Clear es un método sencillo y robusto para la eliminación de tejido adiposo, que puede realizarse fácilmente en una configuración de laboratorio regulares. En comparación con otros métodos de limpieza basados en solventes como iDISCO iDISCO +10,11,12, Adipo-clara es especialmente optimizadas para despejar el tejido adiposo y otros tejidos con alto contenido de grasa. El paso de delipidation completamente elimina lípidos de...

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Christina Pyrgaki, Tao Tong y Alison North desde el centro de recursos de Bioimagen en la Universidad de Rockefeller para la asistencia y apoyo. También agradecemos a Xiphias Ge Zhu para la edición de la película. Este trabajo fue apoyado por el humano frontera ciencia programa organización (PC).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x solución salina tamponada con fosfatoCorning21-040-CV
ParaformaldehídoSigma AldrichP6148-1KG
Metanol Fisher ScientificA412SK-4
Triton X-100Sigma AldrichX100-500ML
Tween 20Sigma AldrichP2287-500ML
HeparinaSigma AldrichH3393-100KU
DiclorometanoSigma Aldrich270991
Peróxido de hidrógeno 30%Fisher Scientific325-100
Éter bencílicoSigma Aldrich108014
Agarosa Invitrogen16500500
Azida sódicaSigma Aldrich71289-5G
GlicinaFisher ScientificBP381-1
Conejo policlonal anti-tirosina hidroxilasaMilliporeAB152dilución 1:200
Cabra policlonal anti-CD31/PECAM-1R& D SystemsAF3628Concentración final de 2 & micro; g/mL
Rata monoclonal anti-CD68, Clon FA-11Bio-RadMCA1957Concentración final de 2 µ g/mL
Burro anti-conejo IgG (H+L) Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch711-605-152Concentración final de 5-10 y micro; g/mL
Burro anti-cabra IgG (H+L) Alexa Fluor 568InvitrogenA11077Concentración final de 5-10 µ g/mL
Burro anti-rata IgG (H+L) Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch712-605-153Concentración final de 5-10 y micro; g/mL
Cámara de imagenibidi80287
Microscopio de lámina de luzLaVision BioTecUltramicroscopio II
Software de imagenLaVision BioTecImspector
de visualización de microscopíaBitplaneImaris
software

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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