Pinza de fuerza espectrométricas para la caracterización de Hidrogeles basados en proteínas

Resumen

Una nueva técnica de espectrométricas de fuerza-abrazadera se utiliza para investigar las propiedades mecánicas de muestras de bajo volumen basados en proteína hidrogel ancladas entre un motor de bobina de voz y un sensor de fuerza. Un analógico proporcional-integral-derivado (PID) sistema permite la fijación de la fuerza experimentada en el protocolo deseado.

Resumen

Aquí, describimos un método de espectrométricas de fuerza-abrazadera para caracterizar las propiedades biomecánicas de Hidrogeles basados en proteínas. Este método utiliza un análogo proporcional-integral-derivado (PID) sistema para aplicar protocolos de fuerza controlada en muestras cilíndricas hidrogel basado en proteína, que están ancladas entre un motor de bobina de voz lineal y un transductor de fuerza. Durante la operación, el sistema PID ajusta la extensión de la muestra de hidrogel para seguir un protocolo predefinido fuerza reduciendo al mínimo la diferencia entre las fuerzas medidas y punto. Este enfoque único de Hidrogeles basados en proteínas permite el tethering de hidrogel de muy bajo volumen de muestras (< 5 μl) con concentraciones diferentes de proteínas. Bajo protocolos de la rampa de la fuerza, donde la tensión aplicada aumenta y disminuye linealmente con el tiempo, el sistema permite el estudio de las elasticidad e histéresis comportamientos asociados con el (des) plegamiento de las proteínas y la medida del elástico estándar y parámetros de la viscoelástica. Bajo fuerza constante, donde el pulso de fuerza tiene una forma escalonada, la respuesta elástica, debido al cambio en la fuerza, está desconectada de la respuesta viscoelástica, que proviene del dominio de la proteína despliegue y refolding. Debido a su bajo volumen de muestra y versatilidad en la aplicación de varias perturbaciones mecánicas, fuerza-abrazadera espectrométricas está optimizado para investigar la respuesta mecánica de proteínas bajo fuerza usando un acercamiento a granel.

Introducción

Además de tener características físicas únicas, Hidrogeles basados en proteína mantenga la promesa de revolucionar la espectroscopia de fuerza por lo que permite la medición de varios mil millones moléculas en un 'jale', permitiendo el estudio de proteínas en ambientes de hacinamiento, similares a los encontrados en la piel y otros tejidos. Dominios de la proteína siendo doblados dentro de hidrogeles, que permite el estudio de la respuesta biomecánica a la fuerza, enlace de socios y condiciones químicas. Además, la respuesta biomecánica de los dominios de la proteína dentro de los hidrogeles se asemeja a la respuesta considerada técnicas de espectroscopia de fuerza de....

Protocolo

1. reactivos solución preparación

1. Preparar una solución de proteína a partir de disolución/dilución de la proteína de interés para la concentración deseada, usando un tampón de Tris [20 mM tris (hidroximetil) aminometano y 150 mM NaCl, pH 7.4].
   Nota: La concentración de proteína más pequeña para que conduce Cross-linking de los hidrogeles depende de la proteína utilizada y suele ser > 1 mM.
2. Preparar acciones de persulfato de amonio (APS) (1 M) y cloruro de tris(bipyridine)ruthenium(II) ([bpy₃]^{2 +}) soluciones (6,67 mM) disolviendo APS y [bpy₃]^{2 +} polvos en el tampón de Tris.

Resultados

Figura 1A se muestra el esquema de la reacción fotoactivos utilizada para sintetizar el hidrogel de₈ L-EGP/L. Figura 1B muestra la mezcla de hidrogel en el tubo PTFE antes y después de la fotoactivación. Figura 1 presenta el extruido L-eGFP-L₈ hidrogel dentro de una solución de Tris. La muestra de hidrogel tiene ningunos defectos estructurales tales como muescas. Hidrogeles con .......

Discusión

Aquí, describimos una técnica de espectrométricas de fuerza-abrazadera para investigar la respuesta biomecánica de Hidrogeles basados en proteína de bajo volumen. Además, se proporciona un protocolo para sintetizar una muestra de hidrogel de proteína de bajo volumen cilíndrico uniforme. También se presenta un protocolo que describe cómo hacer diferentes tipos de Hidrogeles basados en proteína con diferentes elasticidades sin causar daño a las muestras de hidrogel basado en proteína o deslizamiento del gel ni deformación .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Transductor de fuerza SI-KG4A	World Precision Instruments (WPI)	SI-KG4A Soluciones de
equipamiento de motor de bobina de voz lineal		LFA2010
Albúmina sérica bovina	biológicos de las Montañas Rocosas (RMBIO)	BSA-AAF-1XG / 100 g
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503-1KG
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Persulfato de amonio	Sigma-Aldrich	248614-100G
Cloruro de tris (bipiridina) rutenio (II)	Sigma-Aldrich	544981-1G
SUMINISTROS MÉDICOS EXPRESOS  6-0 SUTURA DE NYLON 12/PK	Fisher Scientific	NC0395626
Jeringa de 1 ml solamente,		309628
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML
Tubo de PTFE de microdiámetro, 0.022" de diámetro interno x 0.042" de diámetro exterior, 100 pies/rollo	Cole-Parmer	EW-06417-21
Aguja hipodérmica, calibre 23	Suministros para el cuidado de la salud Profesionales 305194
Jensen Global JG24-1.5X Red IT Puntas de Dispensación - Calibre 24	KIMCO	JG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W Lámpara de Mercurio de Arco Corto	ALB	USH-103D Pinzas
Tijeras
Médicas Olympus
El código informático y el diseño CAD de las piezas personalizadas pueden ponerse a disposición del autor correspondiente previa solicitud.