Artículo de método

Pinza de fuerza espectrométricas para la caracterización de Hidrogeles basados en proteínas

DOI:

10.3791/58280

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21 de agosto de 2018

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1Department of Physics, University of Wisconsin-Milwaukee

En este artículo

Resumen

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Una nueva técnica de espectrométricas de fuerza-abrazadera se utiliza para investigar las propiedades mecánicas de muestras de bajo volumen basados en proteína hidrogel ancladas entre un motor de bobina de voz y un sensor de fuerza. Un analógico proporcional-integral-derivado (PID) sistema permite la fijación de la fuerza experimentada en el protocolo deseado.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, describimos un método de espectrométricas de fuerza-abrazadera para caracterizar las propiedades biomecánicas de Hidrogeles basados en proteínas. Este método utiliza un análogo proporcional-integral-derivado (PID) sistema para aplicar protocolos de fuerza controlada en muestras cilíndricas hidrogel basado en proteína, que están ancladas entre un motor de bobina de voz lineal y un transductor de fuerza. Durante la operación, el sistema PID ajusta la extensión de la muestra de hidrogel para seguir un protocolo predefinido fuerza reduciendo al mínimo la diferencia entre las fuerzas medidas y punto. Este enfoque único de Hidrogeles basados en proteínas permite el tethering de hidrogel de muy bajo volumen de muestras (< 5 μl) con concentraciones diferentes de proteínas. Bajo protocolos de la rampa de la fuerza, donde la tensión aplicada aumenta y disminuye linealmente con el tiempo, el sistema permite el estudio de las elasticidad e histéresis comportamientos asociados con el (des) plegamiento de las proteínas y la medida del elástico estándar y parámetros de la viscoelástica. Bajo fuerza constante, donde el pulso de fuerza tiene una forma escalonada, la respuesta elástica, debido al cambio en la fuerza, está desconectada de la respuesta viscoelástica, que proviene del dominio de la proteína despliegue y refolding. Debido a su bajo volumen de muestra y versatilidad en la aplicación de varias perturbaciones mecánicas, fuerza-abrazadera espectrométricas está optimizado para investigar la respuesta mecánica de proteínas bajo fuerza usando un acercamiento a granel.

Introducción

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Además de tener características físicas únicas, Hidrogeles basados en proteína mantenga la promesa de revolucionar la espectroscopia de fuerza por lo que permite la medición de varios mil millones moléculas en un 'jale', permitiendo el estudio de proteínas en ambientes de hacinamiento, similares a los encontrados en la piel y otros tejidos. Dominios de la proteína siendo doblados dentro de hidrogeles, que permite el estudio de la respuesta biomecánica a la fuerza, enlace de socios y condiciones químicas. Además, la respuesta biomecánica de los dominios de la proteína dentro de los hidrogeles se asemeja a la respuesta considerada técnicas de espectroscopia de fuerza de una sola molécula. Por ejemplo, desnaturalizantes químicos y agentes oxidantes disminuyen la estabilidad del estado doblado, a la única proteína dominio nivel1,2,3 y en el nivel macroscópico4,5 , 6 , 7. Asimismo, osmolitos aumentan la estabilidad de las proteínas solo8,9, llevando a una disminución de la respuesta viscoelástica de hidrogeles, para la misma fuerza condiciones7,10.

Varios acercamientos se han aplicado para sintetizar Hidrogeles basados en proteínas, ya sea mediante interacciones físicas11,12 o covalentes entrecruzamiento4,13. Reacciones covalentes permiten lugares fijos del cross-linking y estos hidrogeles pueden recuperar el estado inicial a un retiro de las perturbaciones mecánicas o químicas. Un método exitoso para reticulación covalente se basa en formar enlaces covalentes carbono-carbono entre aminoácidos tirosina expuestas con persulfato de amonio (APS) como un oxidante y una sal de rutenio (II) como un iniciador (figura 1)14. Con la exposición a luz blanca, una solución de proteínas concentradas puede transformarse en un hidrogel. Mediante el control cuando la reacción se inicia, la mezcla de proteína-APS se puede inyectar en cualquier forma de fundición, como el politetrafluoroetileno (PTFE) tubos (figura 1B y 1C), permitiendo el uso de una solución extremadamente pequeño volumen15. Además, el uso de luz blanca para desencadenar la reacción de entrecruzamiento produce un blanqueamiento limitada de proteínas fluorescentes y permite la formulación de compuestos hidrogeles con marcadores fluorescentes (figura 1). Otros métodos de formación del hidrogel basado en proteína utilizan Cross-linking basada en la interacción covalente de SpyCatcher SpyTag16, Amina Cross-linking via glutaraldehído13o biotina-estreptavidina interacciones17.

Análisis mecánico dinámico (DMA) es actualmente una técnica ampliamente utilizada para estudios basados en polímeros hidrogeles13,18. Mientras que el DMA puede aplicar protocolos de fuerza constante con biomateriales, requiere módulos de Young sobre 10 kPa, muestra grandes volúmenes y de más de 200 μL19. Debido a estas limitaciones, hidrogeles de proteína generalmente son demasiado blandos ser investigados por esta técnica. Como ingeniería poliproteínas son más difíciles de sintetizar que polímeros, puesto que necesitan un sistema de vida para producir, tales altos volúmenes son ineficientes, en el mejor de4,15. Además, la mayoría de los tejidos biológica es más suave que 10 kPa. Varios métodos fueron desarrollados para muestras biológicas, especialmente en el estudio del músculo elasticidad20,21. Estas técnicas también puede funcionar bajo regeneración al aplicar una fuerza constante pero se optimizan para las muestras con diámetros pequeños (en el rango de micrones) expuestos a la fuerza de muy corto tiempo (normalmente menos de 1 s).

Los hidrogeles basados en proteína con éxito fueron estudiados con técnicas espectrométricas modificado. Por ejemplo, el hidrogel del bastidor en forma de anillo permite el uso de extensional espectrométricas para medir el cambio en la fuerza de la experiencia en función de la extensión4,22. Otros enfoques para el estudio de las propiedades reológicas de Hidrogeles basados en proteína utilizan espectrométricas controlados de tensión de esquileo. Estas técnicas también pueden alcanzar volumen de muestra bajo y tolerar materiales blandos. Sin embargo, estos métodos falta la capacidad para imitar la tracción fuerza causa la proteína despliegue en vivo, y módulo de Young se calcula en base a teorías complejas que requieren varios supuestos y correcciones23.

Nos han informado recientemente de un nuevo enfoque que utiliza una pequeña cantidad de proteínas, polimerizada dentro de tubos con diámetros < 1 mm. Nuestra primera aplicación de esta técnica fue funcionando en modo de pinza de longitud, donde se extendió el gel siguiendo el protocolo deseado15. En este método, las proteínas experimentan un cambio continuo en la extensión y fuerza mientras que revelan los dominios, haciendo complicado la interpretación de los datos. Recientemente, nos hemos informado de una nueva técnica fuerza abrazadera espectrométricas, donde un lazo de regeneración puede exponer hidrogeles de proteína de bajo volumen a una fuerza predefinida protocolo7 (figura 2). Un sistema PID analógico compara la fuerza medida por el sensor de fuerza con el set point en el ordenador y la extensión de gel ajusta moviendo la bobina para reducir al mínimo la diferencia entre las dos entradas. Esta sujeción de la fuerza permite nuevos tipos de experimentos para medir la biomecánica de hidrogeles de proteína.

En el modo de rampa de la fuerza, un hidrogel de proteína atada experimenta un constante aumento y disminución de la fuerza con el tiempo. El PID compensa las deformaciones viscoelásticas cambiando la extensión de una manera no lineal, dependiendo del tipo de formulación de proteína y de hidrogel. La principal ventaja de la rampa de la fuerza es la que permite la cuantificación de parámetros estándar, como módulo de Young y disipación de energía, debido a un unfolding y refolding de dominios de la proteína.

En el modo de fuerza constante, la fuerza aplicada cambia de manera escalonada. En este modo, el gel se extiende y contratos elásticamente cuando la fuerza es aumentar o disminuir, respectivamente, seguido de una deformación dependiente del tiempo. Esta deformación viscoelástica, llevando a cabo mientras el gel experimenta una fuerza constante está directamente relacionada con dominio desplegado/refolding. De forma simplificada, esta extensión puede verse como el equivalente de varios rastros de sola molécula millones como promedio y mide a la vez. Protocolos de constante de fuerza pueden utilizarse para estudiar la fluencia y relajación de hidrogeles de proteína en función de la fuerza y el tiempo. En función de la fuerza, para hidrogeles de proteína BSA, hemos demostrado recientemente que existe una dependencia lineal entre la extensión elástica y viscoelástica y retroceso con la tensión aplicada7.

Aquí detallamos el funcionamiento de un reómetro de fuerza-abrazadera utilizando geles compuestos de una mezcla de proteína L (8 dominios24, representado como L8) y una construcción de la proteína L-eGFP (L-eGFP), que hace el general hidrogel fluorescente y fáciles de demostrar.

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Protocolo

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1. reactivos solución preparación

  1. Preparar una solución de proteína a partir de disolución/dilución de la proteína de interés para la concentración deseada, usando un tampón de Tris [20 mM tris (hidroximetil) aminometano y 150 mM NaCl, pH 7.4].
    Nota: La concentración de proteína más pequeña para que conduce Cross-linking de los hidrogeles depende de la proteína utilizada y suele ser > 1 mM.
  2. Preparar acciones de persulfato de amonio (APS) (1 M) y cloruro de tris(bipyridine)ruthenium(II) ([bpy3]2 +) soluciones (6,67 mM) disolviendo APS y [bpy3]2 + polvos en el tampón de Tris.

2. a base de proteínas síntesis de hidrogel

  1. Fijar una aguja de 23 G en una jeringa de 1 mL con un émbolo presionado.
  2. Cortar un tubo de politetrafluoroetileno (PTFE) de 10 cm (con un diámetro interno de 0.022 en y un diámetro exterior de 0.044 en) usando una cuchilla de afeitar. Coloque la aguja y la jeringa en un extremo del tubo PTFE.
  3. Inserte el segundo extremo del tubo en una solución de silano y llenar el tubo por retraer el émbolo de la jeringa. Dejar el tubo durante 30 minutos.
  4. Retirar la solución de silano y seque el tubo con aire comprimido.
    Nota: Asegúrese de que todos los de la solución de silano se seca y ningún residuo en el tubo.
  5. Mezclar la solución de proteína con APS y [Ru (bpy) 3]2 + en un tubo de 1,5 mL usando una proporción de volumen constante [p. ej., 15:1:1 o 15:0.5:0.5 (v: v: v)].
  6. Vórtice la solución fotoactivas hasta que se mezcle completamente.
  7. Centrifugar la mezcla a velocidad máxima (p. ej., 14.000 x g) para quitar las burbujas de la solución.
  8. Inserte el extremo abierto del tubo PTFE tratado en la mezcla fotoactivas y dibujan la solución en el tubo por retraer el émbolo de la jeringa.
  9. Coloque el tubo cargado ~ 10 cm de distancia una lámpara de mercurio de 100 W para evitar calentamiento y mantenerlo allí hasta 30 min a temperatura ambiente (figura 1B).
    Nota: En algunos casos, el tiempo de exposición a la luz puede ser tan bajo como 30 s. tiempos más cortos de congelación se utilizan aquí para geles fluorescentes, para limitar el fotoblanqueo.
  10. Retire el tubo de la aguja y corte los bordes del tubo cerca de los extremos de hidrogel con una cuchilla de afeitar.
  11. Utilice una aguja 24 G romas para sacar el hidrogel en la solución de Tris (figura 1).
    Nota: Se usan agujas romas para evitar cualquier muescas o daño a la muestra de hidrogel.
  12. Inspeccione visualmente los geles defectuosos que pueden formar durante la extrusión o debido a las burbujas y deseche los geles con defectos.

3. proteína a base de hidrogel accesorio y fuerza-abrazadera reómetro configuración

  1. Inicie el programa de control del instrumento. Encienda el motor de bobina de voz. Ajuste la posición de la bobina en un valor hacia el final de la gama (p. ej., 7,5 mm).
    Nota: Se recomienda la posición de la bobina de voz que hacia el final del rango de movimiento máximo, para maximizar la posible extensión de la hidrogel.
  2. Desplazar los ganchos en el z-dirección y alinearlos en la curva en x-dirección (que es la coordenada tracción; ve figura 2B). Registrar los valores de las tuercas de medición para la x-dirección.
  3. 2 Suturas estériles cortar hebras de igual longitud (2-3 cm; Ver Figura 3A y B).
  4. Ate un nudo suelto doble en cada uno de los hilos y colocar los 2 bucles en el gancho conectado al sensor de fuerza (figura 3 y 3D).
  5. Llene la cámara experimental con tampón Tris y transferir la muestra de hidrogel en la cámara de llenado utilizando pinzas médicas.
  6. Coloque la bobina de voz y fuerza ganchos sensor cerca de la superficie de la solución y alinee los ganchos en todas las direcciones usando el x/y/z-posicionamiento manipuladores.
  7. Uso de pinzas médicas, ambos lados de la muestra de proteína hidrogel en los ganchos conectados a la voz de la bobina y sensor (figura 3) la fuerza de la caída.
  8. Ajuste 1 lazo de sutura alrededor de la muestra de hidrogel en el gancho de la bobina de voz sosteniendo ambos extremos del lazo de sutura con las pinzas médicas y tirando de ellos simultáneamente (figura 3D).
  9. Repita el paso 3.8 para el bucle conectado al sensor de fuerza (figura 3D).
    Nota: Evitar un endurecimiento extremo de las suturas para evitar cualquier daño estructural y corte transversal de la muestra de hidrogel.
  10. Apretar los lazos de la sutura de las curvas de cada gancho para evitar cualquier desliz; uso puntos de estas curvas como referencia para encontrar el cero de separación entre los ganchos en el paso 3.2. Corte la longitud excesiva de las suturas con tijeras médicas (figura 3D).
  11. Mover el hidrogel adjunto usando z-manipuladores a lo largo de z-eje hacia la cámara experimental para sumergir el hidrogel en la solución experimental.
  12. Alinee la muestra de hidrogel en y-z con los manipuladores que el gel no está bajo presión.
  13. Cero el sensor de fuerza y separar los dos ganchos usando el x-micrómetro etapas hasta que el gel comience a fuerza de experiencia. Una vez que esto sucede, gire ligeramente hacia atrás el tornillo micrométrico en x-dirección.
  14. Registrar la posición de ambos manipuladores para el sensor y el motor de bobina de voz y utilizar la diferencia entre estos valores y los medidos en el paso 3.2 para calcular la separación exacta entre los ganchos tethering al inicio del experimento.
  15. Establecer el intervalo de la curva de parafina a ~1.5 - 2 mm y medir la holgura de gel (Figura 4A).
    Nota: Para cada medida de la holgura, intente mantener el inicio del régimen de parafina junto a la posición de la bobina de voz inicial, permitiendo un número óptimo de puntos de datos para los 2 regímenes (Figura 4A). La longitud del gel puede ser determinada con una resolución de micras utilizando la separación entre los ganchos y la intersección entre los 2 regímenes de la holgura de la curva (véase también paso 5.1). Como el sensor de fuerza podría derivar con el tiempo debido a las variaciones en las condiciones experimentales, la parte de la curva de holgura que el gel no es bajo fuerza informes sobre esta posible deriva. El programa controla el instrumento compensa automáticamente esta diferencia al enviar el comando de punto de ajuste para el lazo de PID (recuadro de laFigura 4A ).

4. basados en proteína hidrogel caracterización mediante rampa de fuerza controlados y las medidas de fuerza constante

  1. Experimentos de fuerza-rampa
    1. Para realizar un ciclo de fuerza-rampa incrementando la fuerza en la velocidad de carga deseada (p. ej., manganeso 0.01/s), entrada de las fuerzas de partida y finales y la duración del Protocolo como una "V" volteada. Mantenga el gel en 0 mN (o fuerza de baja) para s > 200 permitir que los dominios de la proteína para replegar y la elasticidad del gel para recuperar.
    2. Guardar el rastro.
  2. Experimentos de fuerza constante
    1. Realizar un protocolo de fuerza constante aplicando una fuerza de baja (por ejemplo, 0.1 mN) para 30 s y entonces aumentar la fuerza a una fuerza constante (por ejemplo, 1 mN) para una cantidad definida de tiempo (por ejemplo, 120 s), seguido de Temple bajo la fuerza a la misma valor (por ejemplo, 0.1 mN) > 300 s permitir que los dominios de la proteína para replegar y la elasticidad del gel para recuperar.
    2. Tras el primer pulso, ajustar los parámetros del PID para maximizar el tiempo de respuesta de la retroalimentación del lazo (ver Figura 2D).
      Nota: Para geles rígidos y pequeños cambios en la fuerza, el tiempo de respuesta del lazo está limitado por la electrónica del sensor de fuerza y el tiempo de respuesta de la bobina y puede ser tan bajo como 5 ms7. Para geles más suaves y grandes cambios en la fuerza, el tiempo de respuesta es dictado por la elasticidad de los hidrogeles (Figura 2D).
    3. Guardar el rastro.

5. Análisis de datos

  1. Utilizando la separación medida entre los ganchos y la posición de la bobina calculada, cuando el gel comienza a experimentar la fuerza (Δx en el prospecto Figura 4A ), calcular la longitud del gel L utilizando la ecuación:
    L = L0 + ∆x
    Aquí, L0 es la separación entre los ganchos, medido desde la posición de los tornillos del micrómetro antes del experimento (paso 3.14).
    Nota: Para los geles con concentraciones bajas en proteína que no resultan en una reticulación completa, la longitud medida cambiará de rastro del rastro. También, durante largos períodos de tiempo, las proteínas dentro de los hidrogeles pueden sufrir envejecimiento efectos25, que dan lugar a un alargamiento general del gel.
  2. Normalizar la extensión medida a la longitud del gel para obtener la cepa.
  3. Normalizar la fuerza medida de la superficie transversal utilizando el diámetro interno del tubo utilizado para la polimerización.

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Resultados

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Figura 1A se muestra el esquema de la reacción fotoactivos utilizada para sintetizar el hidrogel de8 L-EGP/L. Figura 1B muestra la mezcla de hidrogel en el tubo PTFE antes y después de la fotoactivación. Figura 1 presenta el extruido L-eGFP-L8 hidrogel dentro de una solución de Tris. La muestra de hidrogel tiene ningunos defectos estructurales tales como muescas. Hidrogeles con ...

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Discusión

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Aquí, describimos una técnica de espectrométricas de fuerza-abrazadera para investigar la respuesta biomecánica de Hidrogeles basados en proteína de bajo volumen. Además, se proporciona un protocolo para sintetizar una muestra de hidrogel de proteína de bajo volumen cilíndrico uniforme. También se presenta un protocolo que describe cómo hacer diferentes tipos de Hidrogeles basados en proteína con diferentes elasticidades sin causar daño a las muestras de hidrogel basado en proteína o deslizamiento del gel ni deformación ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reconocemos el apoyo financiero de la iniciativa de crecimiento investigación (premio no. 101 X 340), National Science Foundation, programa de instrumentación de investigación principales (Grant no. PHY-1626450), Greater Milwaukee Foundation (Premio de Shaw) y sistema de la Universidad de Wisconsin (beca de investigación aplicada).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Transductor de fuerza SI-KG4AWorld Precision Instruments (WPI)SI-KG4A Soluciones de
equipamiento de motor de bobina de voz linealLFA2010
Albúmina sérica bovinabiológicos de las Montañas Rocosas (RMBIO)BSA-AAF-1XG / 100 g
TrizmaSigma-AldrichT1503-1KG
Cloruro de sodioSigma-AldrichS7653-1KG
Persulfato de amonioSigma-Aldrich248614-100G
Cloruro de tris (bipiridina) rutenio (II)Sigma-Aldrich544981-1G
SUMINISTROS MÉDICOS EXPRESOS  6-0 SUTURA DE NYLON 12/PKFisher ScientificNC0395626
Jeringa de 1 ml solamente,309628
SigmacoteSigma-AldrichSL2-25ML
Tubo de PTFE de microdiámetro, 0.022" de diámetro interno x 0.042" de diámetro exterior, 100 pies/rolloCole-ParmerEW-06417-21
Aguja hipodérmica, calibre 23Suministros para el cuidado de la salud Profesionales 305194
Jensen Global JG24-1.5X Red IT Puntas de Dispensación - Calibre 24KIMCOJG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W Lámpara de Mercurio de Arco CortoALBUSH-103D Pinzas
Tijeras
Médicas Olympus
El código informático y el diseño CAD de las piezas personalizadas pueden ponerse a disposición del autor correspondiente previa solicitud.
Productos silano con punta Luer-Lok, Médicas USHIO

Referencias

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Force Clamp RheometryProtein Based HydrogelsPID Control SystemVoice Coil MotorForce TransducerForce Ramp ProtocolConstant Force ProtocolHydrogel Sample PreparationElasticity MeasurementViscoelastic Analysis

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