Artículo de método

El método flotante para tejido parafina-encajado de seccionamiento y corte

DOI:

10.3791/58288

⸱

5 de septiembre de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Life Science, Nanchang University, 2Queen Mary School, Medical Department, Nanchang University, 3School of Life Science, Nanchang University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un protocolo para mejorar la parafina secciones. Este método combina el corte y flotando con una cámara termostática simple para evitar el proceso de transferencia requerido por el método convencional. Como resultado, la eficacia y el número de secciones de la parafina intacto mejoraron grandemente.

Resumen

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Secciones de tejido embebido en parafina es ampliamente utilizado en histología y patología. Sin embargo, es tedioso. Para mejorar este método, varias empresas han ideado sistemas de transferencia de sección compleja con fluido agua. Para simplificar esta tecnología, hemos creado un método sencillo usando equipos caseros que combina el corte y flotando dentro de una cámara termostática simple; por lo tanto, las secciones automáticamente entrar en el baño de agua en la superficie del agua. El hipocampo de cerebro de ratón adulto, los riñones de ratón adulto, cerebros embrionarios de ratón y ojos de pez cebra adulto fueron cortados usando secciones de parafina convencional y el método presentado para la comparación. El análisis estadístico muestra que nuestro método mejorado había ahorrado tiempo y produce perfiles de calidad superiores. Además, parafina de seccionamiento de la muestra entera en poco tiempo es fácil para los operadores junior.

Introducción

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Estudio morfológico es importante en la investigación biológica. Aunque la nueva tecnología ha permitido a los investigadores a observar sus objetivos directamente en el tejido entero u organismos1,2,3, cortar al espécimen de secciones delgadas, seguido por la coloración, sigue siendo el principal morfología de tejido único método fornot sino directamente en el tejido de la proteína. La microscopia ligera utiliza tres tipos de sección: parafina, congelado y SEMIFINOS. Aunque cryosectioning es común para la protección de la antigenicidad del tejido, y la preparacion es simple, la morfología de tejido retenido es pobre e inadecuado para fina seccionamiento de4,5. Secciones de la parafina es el método más frecuentemente utilizado para exhibir bien preservada morfología. Ya que las muestras deshidratadas totalmente incrustadas en la cera, los bloques de parafina pueden ser almacenados indefinidamente. Además, secciones de la parafina produce secciones delgadas que mejoran el acceso de la sonda biológica en experimentos adicionales y reducen la superposición de capas de células en la dirección Z.

Sin embargo, secciones de la parafina convencional es tedioso y exige habilidad del operador. Secciones de la parafina se someten a la fijación, deshidratación, inclusión, corte y flotante. Lo importante, transferencia de cintas de la sección de soporte de la cuchilla en el baño de agua es necesaria pero difícil para los operadores junior. Especialmente en aire seco, las cintas de la sección se tuerza debido a la electricidad estática y son difíciles de desplegar en la superficie de agua caliente. Para mejorar la sección de calidad, humedecer la superficie de tejidos expuestos entre pasadas de cuchilla microtomo, enfriamiento los bloques de cera por inmersión en agua con hielo o aumentar la humedad con un humidificador cerca el micrótomo se recomienda6,7 . Nuevos métodos para mejorar la parafina secciones incluyen híbrido inclusión en parafina, cryosectioning8y sección comercial transferencia sistema asistencia9. Aunque estos métodos mejoran parcialmente parafina secciones velocidad y calidad, hacen secciones mucho más engorroso, y sistemas de transferencia de la sección comercial son caros.

En este protocolo, demostramos cómo crear simple, barato y flexible equipo paso a paso, que puede conectarse al sujetador de la cuchilla de un micrótomo rotatorio. Este equipo está compuesto por un canal de sección, un baño de agua y un calentador con un interruptor de detección de temperatura. Después del corte, docenas de secciones de flujo en el canal de sección y entrar en el baño de agua directamente, así se despliega automáticamente. Esto mejora la eficiencia de parafina de seccionamiento y hace que esta tecnología sea más conveniente. Usando este método, más adultas secciones de hipocampo de ratón, las secciones de riñón de ratón adulto, embrionario 15,5 días de edad (E15.5) ratón secciones del cerebro y ojo de pez cebra adulto secciones fueron cosechadas en menos tiempo e intacta más morfológicamente. Este método puede utilizarse también para otras muestras de tejidos que requieren acelerado parafina secciones evitando la pérdida de distinción de la sección.

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Protocolo

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Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y el Comité de uso de la Universidad de Nanchang.

1. monta el equipo y conecte el microtomo

  1. Diseño de los parámetros conforme a los requisitos (suplementario figura 1).
  2. Enviar el parámetro a una fábrica local para la fabricación de los tableros de acrílico.
  3. Montar todas las piezas en orden: utilizar cloroformo para combinar 7 comerciales tableros de acrílico en un tanque con un baño de agua y canal de sección (figura 1).
    PRECAUCIÓN: El cloroformo produce sustancias tóxicas cuando encuentra con luz y al oxígeno. Montar el aparato en una campana de humos.
  4. Instale el elemento de calefacción tubular a través del agujero en el tablero de acrílico #1 (punta de flecha de lafigura 2A, ).
  5. Para instalar el controlador de temperatura, crear un pequeño agujero en el tablero de acrílico #2 usando un taladro eléctrico e instale el detector de temperatura (flecha de lafigura 2A, ). Instalar un termostato digital en el tanque (figura 2A).
    Nota: El detector de temperatura debe estar dentro de 1 cm por debajo de la superficie del agua.
  6. Para proporcionar acceso a energía, ajustar la tensión inferior a 24 V antes de encender el equipo.
  7. Retire la bandeja de residuos de sección del microtomo.
  8. Enlace al canal de secciones con sujetador de la cuchilla de micrótomo con sellante neutral del silicón (figura 2B).
    Nota: No borrón de transferencia cualquier sellante neutral del silicón sobre la parte superior de la hoja de manera que la hoja vieja se sustituye fácilmente.
  9. Seco durante la noche para permitir que el cloroformo y el tiempo de sellador de silicona neutra para solidificar.
  10. Instalar la hoja en el portahoja. Vierta agua en el baño de agua (figura 2). La superficie del agua sólo debe tocar la parte superior de la hoja (Figura 2D, cabeza de flecha).

2. parafina de seccionamiento

Nota: Desechos a menudo se acumulan en los bordes superiores o inferiores de la manzana de cera y la superficie del agua. Esta basura debe ser limpiado regularmente.

  1. Realizar la parafina convencional sección10.
    1. Fije a la muestra de parafina-encajado en un micrótomo rotatorio y coloque la cuchilla en un sujetador de la cuchilla.
    2. Gire el volante y la sección de la muestra.
    3. Transferencia de la cinta de parafina seccionado para el baño de agua caliente de 38,5 ° C.
    4. Pick up que las secciones en el microscopio se deslizarán de la superficie del agua después de desplegar.
    5. Seque el portaobjetos en un horno a 42 º C noche.
  2. Secciones de parafina mejorada (figura 3)
    1. Encender el equipo.
    2. Abra el calentador con interruptor de detección de temperatura y temperatura específicas entre 38,0 ° C y 40,0 ° C durante 1 hora con antelación calentar el agua.
    3. Modificar el bloque de parafina adquirido por inclusión en parafina; luego coloque el bloque de parafina en abrazadera del cassette del microtomo y bloquéela.
      Nota: Los límites superiores e inferiores del bloque de parafina deben modificarse horizontalmente para evitar que la cinta de la sección de formando un arco y ser capaz de fluir a través del canal de secciones estrechas.
    4. Acercarse rápidamente a la muestra por secciones gruesas de corte.
    5. Ajuste a un espesor de sección adecuada (10 μm para cerebro de ratón adulto, ratón adulto riñones y cerebro de ratón embrión, 4 μm para los ojos de pez cebra). Gire el volante y las secciones entrará automáticamente en el canal de las secciones y el baño.
    6. Sección de la muestra en un movimiento lento y uniforme del corte (Figura 3A).
      Nota: Thethickness del primer tramo se verá alterada tras el volante se ha detenido durante unos minutos. Las cuchillas desechables deben reemplazarse cuando las secciones tienen arañazos consecutivos.
    7. Guía de las secciones en la cámara de baño flotan en una línea (figura 3B, 3C).
      Nota: Si la parte de la cabeza se adhiere a la pared de la cámara, utilice a una guía cepillo para mantenerlo flotando.
    8. Se adhieren a las secciones sobre portaobjetos. Después de las secciones completamente se despliegan en el baño de agua, varias secciones con pinzas. Luego recogerlos desde el baño de agua sobre el portaobjetos (figura 3D).
      Nota: Secciones deben recogidas en la parte posterior de la bañera de agua, como los del canal de las secciones y la parte anterior de la bañera de agua no todavía completamente desplegados.
    9. Seque las diapositivas colocándolas en un horno de 42 ° C durante la noche. Las diapositivas entonces pueden ser almacenadas a temperatura ambiente indefinidamente.
  3. Utilizar la tinción de hematoxilina-eosina (HE) para la evaluación del método mejorado8.

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Resultados

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El método mejorado aumentó el número de secciones de la parafina intacto. Probamos este nuevo método en tejido de hipocampo de ratón adulto, los riñones de ratón adulto, cerebros embrionarios de ratón y ojos de pez cebra. Se añade agua al tanque, y la temperatura del agua se mantuvo entre 38,0 ° C y 40,0 ° C. Después de una serie preparación de las muestras de tejido, fueron seccionadas y comparados con seccionamiento convencional. El nuevo método evita la pérdida de sección y aumentó la ...

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Discusión

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Para mejorar la morfología de la sección de parafina y resolver el problema del tiempo perdido durante el seccionamiento de la parafina convencional, hemos creado una parafina mejor método que combina el corte y el despliegue de seccionamiento. Este método mejorado se basa en un equipo simple que consta de un canal de sección, un baño de agua y un calentador con un interruptor de detección de temperatura. La cinta de la sección entra en el baño de agua a través del canal de sección y se despliega automáticamente al corta...

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Divulgaciones

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Los autores tienen una patente de este dispositivo y no declaran a intereses en competencia.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Grant no. 31400936, 31460260) y la Ciencia Natural Fundación de Jiangxi provincia de China (20171BAB215020). También agradecemos al programa conjunto entre la Universidad de Nanchang y Queen Mary University of London para apoyar este trabajo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
IncubadoraBoekel Scientific133000-2
Etanol Sinopharm Reactivo Químico Co.,Tapa64-17-5
Xileno Sinopharm Chemical Reagent Co.,Tapa1330-20-7
ParaplastLeica39601006
Módulo de inclusión de parafina calentadaLeica
Tablero
TriclorometanoSinopharm Chemical Reagent Co.,Tapa67-66-3
Elemento calefactor eléctrico tubular (12 V 200 W)
Controlador de temperatura (12 V, 120 W)MingsuoXH-W3002
Microtomo rotativo Leica
silicona neutroConecte el canal de agua con el soporte de cuchillas del micrótomo
Transformador de tensiónDearllS-250-12
Cuchilla desechableAccu-Edge4689
HematoxylinBaso Diagnostics Inc.BA-4025
Eosina Baso Diagnostics Inc.BA-4025
MicroslideSail Marca7105
Bálsamo neutroSinopharm Chemical Reagent Co.,Tapa10004160
Coverslip Microscopio Citoglas10212424C
CarlZeiss
Ácido clorhídricoXilong Chemical7647-01-0
Baño de agua para secciones de parafinaLeica
HistoCore Arcadia C - Placa fríaLeica
spray repelente de parafina Thermo Scientific9990420
acrílico comercialSellador de

Referencias

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  1. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
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