Artículo de método

Fabricación de dispositivos emparejados de índice refractivo para microfluidos biomédica

DOI:

10.3791/58296

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10 de septiembre de 2018

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1Department of Chemical Engineering, University of Utah, 2Huntsman Cancer Institute, University of Utah

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe la fabricación de dispositivos microfluídicos de MY133-V2000 para eliminar los artefactos que se presentan a menudo en microcanales debido a los índices de refracción une mal entre estructuras de microcanales y una solución acuosa. Este protocolo utiliza un sostenedor de acrílico para comprimir el dispositivo encapsulado, mejorar la adherencia tanto química como mecánicamente.

Resumen

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El uso de dispositivos microfluídicos ha surgido como una herramienta definitoria para aplicaciones biomédicas. Cuando se combina con técnicas de microscopía moderna, estos dispositivos pueden implementarse como parte de una plataforma robusta capaz de hacer mediciones simultáneas de complementarias. El principal reto creado por la combinación de estas dos técnicas es el desequilibrio en el índice de refracción entre los materiales tradicionalmente utilizados para hacer que los dispositivos de microfluidos y las soluciones acuosas en biomedicina. Este desajuste puede crear artefactos ópticos cerca de los bordes del canal o dispositivo. Una solución es reducir el índice de refracción del material utilizado para fabricar el dispositivo mediante el uso de un polímero fluorado como MY133-V2000 cuyo índice de refracción es similar a la del agua (n = 1.33). Aquí, se demuestra la construcción de un dispositivo de microfluidos de MY133-V2000 mediante técnicas de litografía blanda, utilizando plasma de O2 en conjunto con un sostenedor de acrílico para aumentar la adherencia entre el dispositivo de MY133-V2000 fabricado y el sustrato de polidimetilsiloxano (PDMS). El dispositivo entonces es probado por lo lleno de medios de cultivo celular de 24 h demostrar la capacidad del dispositivo para mantener condiciones de cultivo de células en el transcurso de un experimento típico de proyección de imagen incubando. Por último, la microscopia fase cuantitativa (QPM) se utiliza para medir la distribución de masa dentro de las células adherentes vivo en la MCP. Así, la mayor precisión, de fabricación del dispositivo de un polímero de bajo índice de refracción como MY133-V2000 sustituyen a materiales tradicionales litografía blanda como PDMS, está demostrada. En general, este enfoque para la fabricación de dispositivos microfluídicos puede integrarse fácilmente en flujos de trabajo existentes de litografía blanda para reducir artefactos ópticos y aumentar la precisión de la medida.

Introducción

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El desarrollo de la tecnología de microfluidos ha permitido una amplia gama de nuevas técnicas biomédicas que aprovechan la única física de flujos de escala microscópica1,2. Esto incluye las técnicas diagnósticas construidas sobre plataformas de microfluidos que cuantifican biomarcadores clínicamente relevantes, incluyendo célula rigidez3, marcadores de superficie4y crecimiento5. Mediante la manipulación de las células, dispositivos microfluídicos también pueden utilizarse para medir la heterogeneidad de biomarcadores, por ejemplo como indicador de la malignidad6. La capacidad de combinar aplicaciones de microfluidos con microscopía ha aumentado aún más la utilidad de estas plataformas permitiendo dispositivos que miden los múltiples biomarcadores simultáneamente7.

QPM es una técnica de microscopía que mide el desplazamiento de fase como la luz pasa a través e interactúa con la materia dentro de las muestras transparentes. La masa de células individuales puede calcularse medidas de QPM, usando la conocida relación entre el índice de refracción y la densidad de biomasa8,9. Trabajo previo ha demostrado que el QPM es capaz de medir parámetros clínicamente relevantes como célula crecimiento10,11 y célula propiedades mecánicas mediante trastorno fuerza12. Cuando se combina con la microfluídica, QPM se puede potencialmente utilizar para medir el comportamiento de la célula en un ambiente altamente controlado en vitro. Uno de los principales retos de combinación de QPM con la microfluídica es el alto índice de refracción de los polímeros más utilizados para construir microfluídicos canales via litografía blanda13.

Un importante reto frente a la combinación de la microfluídica con diversas técnicas de microscopía es el desajuste entre el índice de refracción del material necesario en relación con el índice de refracción de agua14,15. Un método para tratar esto es mediante el uso de un polímero de bajo índice de refracción como CYTOP16 o V2000 MY13313. Este último es un fluorados ultravioleta (UV)-polímero de acrilato curado que tiene un índice de refracción similar al agua (n = 1.33) y que es compatible con técnicas de litografía blanda, lo que permite una integración suave en microfluidos establecido muchos flujos de fabricación del dispositivo. Esto hace no sólo conveniente para la fabricación de dispositivos microfluídicos MY133-V2000, pero también le permite combinarse fácilmente con QPM y otros enfoques de la microscopia, para medir el comportamiento de la célula en la Colonia y en una escala unicelular. MY133-V2000 elimina artefactos debido a fase desenvolver produciendo poco, si cualquiera, cambio de fase como la luz pasa a través de la interfaz agua-MY133.

Aunque eliminar el desequilibrio en el índice de refracción, uno de los desafíos principales asociado a los dispositivos fabricados con polímeros fluorados, como MY133-V2000, es la baja adherencia a otros materiales como el vidrio o PDMS. El presente trabajo muestra la fabricación de un dispositivo de microfluidos MY133 V2000 usando litografía blanda. Con O2 de plasma para el tratamiento de la superficie del canal y el PDMS sustrato combinado con un soporte de acrílico fabricados costumbre asegura que el dispositivo se adhiere al sustrato, creando un canal cerrado. Este dispositivo es adecuado para el cultivo celular y QPM para medir la masa de células en el canal, que tiene aplicaciones importantes para medir el crecimiento de células vivas y el transporte intracelular de la biomasa celular, los que tienen relevancia clínica en el diagnóstico descubrimiento de la medicina y de la droga.

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Protocolo

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1. fabricación de la negativa de polidimetilsiloxano

  1. Preparación de polidimetilsiloxano
    1. Medida 18 g de elastómero de silicona PDMS y 1,8 g de reactivo endurecedor. Verter el reactivo endurecedor en un bote de medición con el elastómero.
    2. Mezclar el elastómero y el reactivo endurecedor vigorosamente por 1 minuto y poner la mezcla en una cámara de vacío durante 30 minutos.
    3. Retire el PDMS del vacío, vierta 15 g sobre el negativo con un cortador de galletas (radio = 3,8 cm) para impedir el PDMS corriendo fuera de la cara y cubrir la mezcla restante de PDMS.
    4. Poner el molde que contiene el PDMS en la cámara de vacío durante 10 minutos.
    5. Retire el molde que contiene el PDMS de la cámara de vacío, colóquelo en un plato caliente a 150 ° C por 60 min a curar y cubrir con papel de aluminio.
    6. Vierta el restante PDMS en un placa de Petri (10 cm de diámetro), de vidrio invertido usando otro cortador de la galleta como un molde, para crear una almohadilla de PDMS. Ponerlo en la cámara de vacío hasta que la negativa PDMS está completamente curada.
    7. Transferencia de la caja Petri con el PDMS de la aspiradora a la placa precalentada para curar a 150 ° C durante 60 min.
  2. Tratamiento superficial del plasma de polidimetilsiloxano
    1. Inserte una hoja de afeitar afilada por debajo de los PDMS y el cortador de la galleta para extraer cuidadosamente el PDMS de los negativos.
    2. Utilice un cuchillo agudo de la manía para cortar lo negativo de la pieza más grande de PDMS; deben cortarse con suficiente área de almacenador intermediario para colocar otro pedazo de PDMS en la parte superior sin obstruir la negativa.
    3. Inserte una hoja de afeitar afilada debajo el PDMS curado con la negativa a extraer con cuidado el PDMS de la caja Petri.
    4. Uso un cuchillo de la manía para cortar un pedazo de PDMS de la almohadilla que es del mismo tamaño que la pieza cortado para la negativa. Luego, cortar un rectángulo de nuevo pedazo de PDMS con espacio suficiente para encajar alrededor de la MCP cuando se coloca encima de la negativa.
    5. Pon dos trozos de PDMS (el negativo y el rectángulo) sobre un sustrato plano (como una diapositiva de cristal, cuarzo, poliestireno u otros materiales) e insertarlos en un plasma de radio frecuencia (RF) limpiador. Cierre la puerta y la cámara del sello de evacuar el aire con una bomba de vacío. Inyectar aire hasta una presión de 400 mTorr usando un regulador de presión de vacío digital.
      Nota: Si el sustrato utilizado para la limpieza del plasma no se ha utilizado en el plasma de la aspiradora, poner en el plasma limpiador por sí mismo antes de s 60 para el tratamiento de la negativa, para evitar que la capa base de acrílico se adhiera al sustrato.
    6. Gire el ajuste de RF a altas, y un plasma de aire rosa debe aparecer en la ventana de visualización. Plasma-tratar las dos piezas de PDMS para 30 s, luego apague el ajuste de RF. Permitir que el aire para volver a entrar poco a poco la cámara para evitar un flujo de aire turbulento de alterar el contenido de la cámara.
    7. Quitar el PDMS del plasma limpiador y colocarlo en un banco. Luego, cuidadosamente invertir el rectángulo PDMS en la negativa y presione hacia abajo con un par de pinzas. Déjela en reposo durante 10 minutos permitir que las dos piezas de PDMS se adhieran entre sí.
  3. Tratamiento superficial Fluorosilane de la negativa de polidimetilsiloxano
    1. Uso un gotero para poner 2 gotas de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-octilo) silano (PFOTS) en un pequeño pesar barco e introducirlos en una cámara de vacío de vidrio.
    2. Invertir el PDMS en un pedazo de papel de aluminio (de modo que la negativa de microchannel caras hacia arriba) y ponerlo en la cámara de vacío de vidrio. Luego, evacuar la cámara continuamente durante 24 horas.

2. fabricación de los microcanales de MY133

  1. Formación de la estructura de microchannel MY133 V2000
    1. Llene el PDMS negativo con 400 μL de MY133-V2000.
      Nota: El negativo debe ser un poco demasiado lleno.
    2. Coloque el PDMS MY133-V2000-llenado negativo en la cámara de vacío por 2 h para eliminar las posibles burbujas.
    3. MY133-V2000 Quite el vacío y presione lentamente un portaobjetos de vidrio contra la parte superior del sobrellenado ligeramente negativo para crear una superficie plana de MY133-V2000 y para evitar que el oxígeno inhibe la polimerización.
      Nota: PDMS, en la superficie de la canal, parcialmente inhiben la polimerización, lo que permite la vinculación en las etapas posteriores. El portaobjetos de cristal tiene una transparencia de UV ligeramente reducida (35%) en comparación con el cuarzo, que ayuda a prevenir cualquier coloración amarillenta en el dispositivo de curado.
    4. Inserte MY133 V2000 en un horno UV W 400 y la radiación UV al 50% de la intensidad máxima de 300 s para curar la MCP MY133 V2000.
      Nota: La longitud de onda máxima se utiliza para curar el dispositivo es aproximadamente 375 nm con un ancho de banda de aproximadamente 25 nm. Aproximadamente 4.500 mJ/cm2 de la energía fue utilizada para curar el MCP, que es un poco más que doble el mínimo curado Potencia recomendada por el fabricante.
  2. El sostenedor de acrílico del edificio
    1. Dibujar la capa base acrílica usando un software de dibujo vectorial. Asegúrese de que la capa base es un rectángulo de 1,5 mm de espesor, 75 mm largo y 25 mm de ancho, con un rectángulo centrado que mide 25 x 11 mm.
    2. Dibujar la capa intermedia acrílico usando un vector software de dibujo. Asegúrese de que la capa intermedia es un rectángulo (espesor 1,5 mm, 75 mm de largo y 25 mm de ancho) con un cuadrado centrado (5 mm x 5 mm) y dos círculos (ambos con un diámetro de 3 mm) separados por 15 milímetros.
    3. Extraer la capa superior acrílico usando un vector software de dibujo. Asegúrese de que la capa superior es un rectángulo (3 mm de espesor, 30 mm de largo y 25 mm de ancho) con un cuadrado centrado (5 mm x 5 mm) y dos círculos (ambos con un diámetro de 3 mm) separados por 15 milímetros.
    4. Recortar los diseños de dispositivo creados en el software de dibujo vectorial con un cortador láser. Use el ajuste de la muestra del 100% de potencia y un 30% de velocidad. Ejecute el programa dos veces para asegurarse de que se corta el acrílico.
    5. Golpear los agujeros en la capa superior acrílico usando un tamaño M5 0.80 mm taladradora.
    6. Limpie las piezas de acrílico con acetona para eliminar marcas residuales o quemaduras.
  3. Unión de MY133-V2000 en el sostenedor de acrílico
    1. Coloque la capa base de acrílico en el substrato de vidrio con un adhesivo, como el pegamento de cianocrilato. Coloque dos gotas pequeñas en los bordes de acrílico y luego usar una herramienta disponible para extender uniformemente el pegamento. Coloque el sustrato de vidrio sobre el acrílico y deje que el pegamento se seque con el peso del vidrio para mantener en su lugar.
    2. Cubrir el vaso expuesto con 100 μl de PDMS con una pipeta de desplazamiento positivo; Luego, inserte un recubridor spin vacío a la capa base y set a 1.500 rpm por 2 min cubrir uniformemente el vidrio con una capa PDMS aproximadamente 10 μm grueso.
    3. Eliminar la capa de base de la máquina de pintar de spin y cuidadosamente Limpie cualquier exceso PDMS que cubrió el acrílico con acetona y papel toalla. Tenga cuidado de no disturbar el PDMS no curada.
    4. Cueza al horno la capa base con PDMS en un horno a 65 ° C por 2 h para curar el PDMS.
    5. Pipetear 1 mL de PDMS en un portaobjetos de vidrio y, a continuación, utilice otro portaobjeto para extender uniformemente el PDMS hasta que comience a exudar hacia fuera los lados. La curación esta en un plato caliente a 150 ° C durante 10 minutos.
    6. Cortar el PDMS curado en un rectángulo con las mismas dimensiones que el dispositivo de MY133-V2000 y, luego, usando la capa intermedia del acrílico como un molde, perforar los agujeros para el depósito y cortar un cuadrado de ventana de visualización en el PDMS para hacer la Junta PDMS.
    7. Coloque el V2000 MY133 canal hacia arriba, en el mismo o un substrato plano similar según lo utilizado para el tratamiento de plasma de los PDMS de paso 1.2.5. Coloque la capa base acrílica que contiene el sustrato PDMS curado junto con el canal de MY133-V2000 en el plasma de2 O limpiador. La presión de vacío a 200 mTorr y RF a alto nivel y superficie-tratar el sustrato de vidrio y canal para 30 s.
    8. Utilizando pinzas, coloque inmediatamente el canal de MY133-V2000 hacia abajo en un corte rectangular de acrílico de la capa base tales que el PDMS en contacto con el MY133-V2000.
    9. Coloque el empaque PDMS en la parte superior del dispositivo de MY133-V2000, alineando los orificios en la junta con los embalses en el dispositivo.
    10. Coloque el dispositivo inacabado sobre una plataforma elevada sobre el Banco para proporcionar una superficie de sujeción para el montaje del dispositivo.
    11. Extraer 3 mL de cemento acrílico utilizando una jeringa. Distribuir suficiente cemento acrílico sobre la capa base para proporcionar una capa delgada. Hacen el abrigo como posible y no deje que el material escurrirse en el canal.
    12. Coloque la pieza de acrílico de capa intermedia sobre el acrílico de capa base. Asegúrese de que los orificios se alineen con los embalses del canal MY133-V2000.
    13. Utilice 3 pinzas para sujetar la capa base y mediados capa como rigurosamente posible por 2 min mientras que el cemento acrílico endurece, para adherir las piezas de acrílico junto. Asegúrese de que los depósitos no estén obstruidos durante este paso para evitar que el aire está atrapado debajo del dispositivo de MY133-V2000.
    14. Retire la presión del dispositivo y coloque el cemento acrílico en la capa intermedia en los lugares de contacto anticipado con la capa superior de acrílico.
    15. Coloque la capa superior de acrílico en la pieza de la capa intermedia de acrílico, asegurándose que los orificios estén alineados con los embalses y deje que se resto en el Banco por 2 min hasta que se seque el cemento acrílico.

3. prueba y uso del dispositivo MY133-V2000

  1. Prueba de fugas
    1. Pruebe el dispositivo de MY133-V2000 añadiendo 10 μl de colorante de comida o agua desionizada en uno de los agujeros del depósito para comprobar la adherencia y el flujo.
    2. Introduzca un tubo (con un diámetro exterior de 1/8 pulg) en el depósito y conecte el otro extremo a una trampa de vacío. Gire el vacío a tirar el tinte o el agua a través del canal para asegurar que se crea un dispositivo exitoso.
    3. Ver bajo un microscopio para no verificar que haya fugas en el canal o embalse, llene el tanque con etanol y permitir el etanol para sentarse a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, jale el etanol mediante el uso de la aspiradora, limpiar el tinte o agua por el canal.
    4. Rocíe el canal con etanol y ponerlo en un recipiente de poliestireno estéril. Envuelva bien con parafilm y almacenar en un ambiente estéril hasta que se necesite.
      Nota: en este punto, el dispositivo debe manipularse asépticamente para evitar la contaminación. Cuando esté listo para utilizar el dispositivo, el exterior del contenedor debe esterilizarse utilizando etanol y en un gabinete antes de abrir el recipiente de bioseguridad.
  2. Placas de células MCF7 en el dispositivo de MY133-V2000
    1. Cultivar células MCF7 en platos de Petri de 10 cm en un medio de comunicación completo que consta de mínimo medio esencial de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero fetal bovino, penicilina-estreptomicina, glutamina y aminoácidos no esenciales, en una incubadora de cultivo celular que mantiene una atmósfera húmeda con 5% CO2 y el 20% O2 a una temperatura de 37 ° C. Crecen las células a aproximadamente 80% de confluencia antes de sembrar en la MCP.
    2. En primer lugar, rocíe el plato de poliestireno que contienen el microchannel con etanol al 70%. A continuación, ponerla en el gabinete antes de retirar el parafilm protegiendo el canal del medio ambiente laboratorio de bioseguridad.
    3. Inmovilizar derivados de plasma humano de fibronectina en la superficie de microcanales por diluir en suero salino de Dulbecco tamponada con fosfato (DPBS) a 10 μg/mL. Entonces, inyectar 20 μl de esta solución en el canal e incubar a 20 ° C por 45 min.
    4. Lavar la solución de la fibronectina de la canal por inyectar 20 μl de medio de cultivo celular en el canal y déjelo incubar a 20 ° C durante 10 minutos.
    5. Lavar las células con 10 mL de DPBS y trypsinize las células añadiendo 1 mL de tripsina 1 x. Incube las células a 37 ° C por 7 min neutralizar la tripsina con 9 mL de medios completo.
    6. Inyectar 20 μl de las células en el canal e incúbelos a 37 ° C por 45-120 min permitir la fijación al sustrato antes de la proyección de imagen.

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Resultados

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Este protocolo describe la fabricación de MY133-V2000, un polímero fluorado con un bajo índice de refracción la del agua que. Una característica clave de este protocolo es cómo superar la falta de adherencia que es característica de los polímeros fluorados mediante plasma de oxígeno y por fabricar el dispositivo dentro de un sostenedor de acrílico para proporcionar la fuerza extra mecánica requerida para sellar el canal contra el sustrato PDMS (figura 1). El ...

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Discusión

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MY133-V2000 puede utilizarse como alternativa a los materiales de fabricación tradicional litografía blanda como PDMS. Trabajo previo ha demostrado que los materiales con un alto índice de refracción, como PDMS, introducen artefactos importantes cerca de las paredes del canal debido a los índices de refracción une mal entre el material de fabricación y la solución acuosa dentro del canal 13. MY133-V2000 permite emparejar el índice de refracción del dispositivo de microfluidos para las soluciones a...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por la Universidad de Utah, el Vicerrectorado de investigación, así como por los fondos junto con grant CA042014 P30 otorgado al Instituto de cáncer Huntsman y CRR al programa en el Instituto de cáncer Huntsman.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
MY133-V2000MY PolímerosMY133-V2000
Sylgard 184Ellsworth Adhesivos184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Portaobjetos de microscopio Fisher PremiumFisher Scientific12-544-4.118
" (3.0mm) x 12" x 12" Lámina acrílicaUnited States Plastic Corp44290.060
"(1.5mm) x 12" x 12" Lámina acrílicaUnited States Plastic Corp44200
SCIGRIP 3 Cemento acrílico de fraguado muy rápidoUnited States Plastic Corp45735
Papel de aluminio estándar (.6 mm de grosor)VWR89107-726
Toallitas Kim FisherScientific06-666
Insta-Cure+ Super GlueBob Smith IndustriesBSI-109
1/8" Tubo de PVCMcMaster Carr5231K55
McCormick Colorante AlimentarioTarget13353207
X-Acto #1 Cuchillode precisión X-ActoX3201
X-Acto #18 Hoja de cincelado para madera de alto gramajeX-ActoX218
VWR Hojas de afeitar VWRVWR55411-055
Platos de cultivo celular tratados en superficieFisher ScientificFBO12922
Fibronectina Plasma HumanoSigma-AldritchF0895-1MG
Tripsina-EDTA 10xFisher Scientific15-400-054
Corning Dulbecco's Phosphate Buffered SalineFisher ScientificMT21030CM
Gibco Penicilina-EstreptomicinaFisher Scientific15-140-148
HyClone Aminoácidos No Esenciales 100xFisher ScientificSH3023801
Suero Fetal BovinoOmega ScientificFB-12
Corning DMEM con L-glutamina y glucosaFisher ScientificMT10013CV
Tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silanoSigma-Aldritch448931Reacciona violentamente con el agua
Etanol, 200 pruebas Decon LabsFisher Scientific04-355-223
AcetonaFisher ScientificA18P-4
Bel-Art 42025 Desecador de plásticoCole-ParmerEW-06514-30
Epilog Fusion Laser Cutter, 120 WEpilog Laser EpilogFusion M2 32 Laser
Isotemp Stirring HotplateFisher ScientificSP88850200
Ateco 14111 Cortador de acero inoxidable de 1,5 pulgadasAteco14111
Pyrex Plato de cultivo celularde vidrio Fisher Scientific08-747B
Limpiador de plasma de radiofrecuenciaHarrick PlasmaPDC-32GUtilizado con gas oxígeno
Laboratorios de agujeros negros DigivacLaboratorios de agujeros negros Modelo215
Intelli-Ray Horno ultravioletaUvitronUVO338
recubrimiento por centrifugaciónMTI CorporationVTC-100A
Horno Isotemp de la marcaFisher Fisher Scientific15-103-0510Convección de aire forzado
Gilson Pipeta de desplazamiento positivo P1000Fisher ScientificFD10006G
HeraCell VIOS 160iFisher Scientific13 998 212PM
Máquina compacta de

Referencias

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