Generación humana Primordial células germinales-como las células en la superficie de cuerpos de Embryoid de pluripotencia cebada inducida por células madre pluripotentes

Resumen

Células de germen primordiales (PGCs) son precursores comunes de espermatozoides y óvulos. Se especifican PGCs embrionarias humanas de células del epiblasto pluripotentes a través de interacciones de citoquinas. Aquí, describimos un protocolo de 13 días de inducir transcriptomally células humanas que se asemejan a PGCs en la superficie de embryoid cuerpos de células madre pluripotentes de cebada-pluripotencia inducida.

Resumen

Células de germen primordiales (PGCs) son precursores comunes de todas las células del germline. En embriones de ratón, una población fundadora de ~ 40 PGCs son inducidos de las células del epiblasto pluripotentes por exposición orquestada a citoquinas, incluyendo la proteína morfogenética ósea 4 (Bmp4). En embriones humanos, las PGCs más tempranas se han identificado en la pared endodérmico del saco vitelino alrededor del final de la semana 3^rd de la gestación, pero poco se sabe sobre el proceso de especificación de PGC humana y su desarrollo temprano. Para evitar las barreras técnicas y éticas de estudiar PGCs embrionarios humanos, sustituto de la célula cultura modelos se han generado recientemente de células madre pluripotentes. Aquí, describimos un protocolo de 13 días para la producción de robusta de células PGC-Like humanas (hPGCLCs). Células de madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSCs) mantenidas en el estado de pluripotencia preparado son incubadas en la ingenua 4i reprogramación medio de 48 horas, disociar a las células y embaladas en los micropocillos. Mantenimiento prolongado de hiPSCs en el estado de pluripotencia ingenuo provoca aberraciones cromosómicas significativas y debe evitarse. hiPSCs en los micropocillos se mantienen por 24 horas en el medio de 4i organismos embryoid forma (EBs), que luego adicionales cultivan en recipientes de plástico de baja adherencia bajo una condición oscilante en el medio de inducción de hPGCLC que contiene una alta concentración de BMP4 humana recombinante. EBs se cultivan más un máximo de 8 días en la condición oscilante, no adherente para obtener rendimientos máximos de hPGCLCs. Por inmunohistoquímica, hPGCLCs se detectan fácilmente como las células fuertemente OCT4 en casi todos EBs exclusivamente en su superficie. Cuando EBs son enzimáticamente disociado y sometidos al enriquecimiento de la FACS, hPGCLCs puede recogerse como células CD38 +, con hasta un 40-45% rendimiento.

Introducción

Células de germen primordiales (PGCs) son precursores comunes de todas las células del germline en ambos sexos. La mayoría de nuestro conocimiento sobre el desarrollo de las PGCs en embriones de mamíferos se ha obtenido a través del estudio de^1,de ratones de laboratorio². En el día embrionario 6.0-6.5 de embriones de ratón, 6 o similar una pequeña cantidad de precursores PGC se encuentra en el epiblasto y una población fundadora de ~ 40 que PGCs son inducidos de ellos de una manera dependiente de proteínas morfogenéticas óseas Bmp2 y Bmp4 secretada de adyacentes células. Las PGCs humanas más tempranas hasta ahora identificadas en embriones estaban en la pared endodérmico del saco vitelino en alrededor del final de la tercera semana de gestación³. Porque este es el mismo lugar como PGCs migratorias son observados en embriones de ratón, es probable que las PGCs humanas observadas fueron en el camino de la migración pero no la población fundadora. Sin embargo, los estudios remonta a etapas anteriores de PGCs o PGC precursores en los embriones humanos se ha estado perdiendo.

PGCs embrionarios humanos es desafiante debido a obstáculos técnicos y éticos. Para superar estos obstáculos, los modelos de cultura de célula PGC-como se han generado recientemente de las células de vástago pluripotent humanas (PSCs). Pluripotencia es la capacidad celular para diferenciarse en la línea germinal y tres capas germinales embrionarias⁴. Mientras que PSC humano mantenido en el medio de mTeSR1 (un medio listo para su uso, disponible en el mercado formulado para el mantenimiento de PSCs humanas en el estado de pluripotencia cebada) en platos recubiertas con la proteína de matriz extracelular tiene preparado estado pluripotencia ⁴, en el 2013 laboratorio de Jacob Hanna demostró que las células de pluripotencia preparado pueden convertirse en un estado de pluripotencia de ingenuo al exponer al medio de células madre humanas ingenuo (NHSM) que contienen inhibidores químicos para proteínas quinasas ERK1/2, GSK3, JNK, roca, PKC, p38 MAPK como factores de crecimiento LIF, TGF, bFGF⁵. Desde el PSC humano ingenuo pluripotencia, en 2015 un grupo de investigación dirigido por Hanna y Azim Surani logra la primera producción sólida de las células PGC-Like humanas (hPGCLCs) del PSC⁶. Varios otros laboratorios, incluyendo el nuestro, informaron más tarde, generación de hPGCLCs de PSCs utilizando protocolos ligeramente diferente^7,8,9,10. Nuestro estudio proporciona evidencia de que hPGCLCs mediante diferentes protocolos (que se resumen en la tabla S1 de nuestro estudio previamente publicado¹⁰) son transcriptomally similar a¹⁰. La evidencia disponible apoya la semejanza del PGCLCs humanos a humanos PGCs embrionarios inicial antes de proceder al borrado epigenética global⁷ o migración quimiotáctica¹⁰.

Estudios del ratón embrionarios PGCs, ratón PGCLCs y PGCLCs humanas (pero con sólo un acceso muy limitado a PGCs humanos) han revelado que los mecanismos moleculares de la especificación de PGC difieren significativamente entre ratón y humano^{1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17}. Por ejemplo, Prdm14 juega un papel crítico en la especificación de PGC en embriones de ratón, pero su papel en la especificación de PGC humana parece limitada^1,15. En contraste, la inducción de SOX17 por EOMESODERMIN es esencial para PGC especificación^6,11,14, considerando que estos factores de transcripción parecen prescindibles para ratón PGC especificación¹⁵. Estos logros iniciales de los estudios con hPGCLCs fuertemente apoyan la importancia de este modelo de cultivo celular como sustituto de PGCs embrionarios humanos.

Estudios recientemente publicados, que implica evaluación de secuenciación profunda de nuestro laboratorio de análisis genomic DNA copia número, han demostrado que el mantenimiento prolongado del PSC en el estado de pluripotencia ingenuo aumenta significativamente el riesgo de inestabilidad cromosómica y anomalías estructurales. Este fenómeno fue observado con ratón¹⁸ y humana¹⁹ PSCs. El protocolo original de producción de hPGCLC por Hanna/Surani fue desarrollado para PSC humano mantenida en medio de pluripotencia 4i ingenuo para por lo menos 2 semanas⁶. Para preservar el normal karyotype diploide de PSC y PGCLCs humanos, hemos desarrollado un protocolo modificado que PSCs humanas están expuestos al medio 4i por solamente 72 horas¹⁰, que se presenta en este artículo. Humanos iPSCs (hiPSCs) se mantienen en el estado de pluripotencia preparado. Inmediatamente antes de la formación de EB, las células se incuban en el medio de la reprogramación de la ingenua 4i (un medio modificado de NHSM) durante 48 horas. Las células son entonces disociadas y embaladas en los micropocillos para formar EBs por 24 horas en el medio de 4i. EBs se mantienen en medio de inducción de hPGCLC que contiene una alta concentración de BMP4 humana recombinante bajo una condición oscilante para cultura no-accesorio para hasta 8 días para obtener el máximo rendimiento de hPGCLCs. Después de 8-EB cultura, hPGCLCs puede ser aislada de células disociadas de EB por FACS como células CD38 +, con ~ 40% de rendimiento en FACS-ordenar suspensión unicelular. Mientras que otro publicado métodos^7,8,9, incluido el protocolo original antes de la modificaciones⁶, generar típicamente hPGCLCs en agregados de células formadas espontáneamente sin específico localización, hPGCLC de nuestro protocolo se observan en la superficie de los cuerpos de embryoid (EBs).

Protocolo

1. célula cultura hiPSCs en el estado de pluripotencia pintado

1. Preparación de platos de cubierta de proteína de matriz extracelular
   1. Descongelar el Matrigel (proteína de matriz extracelular) en el hielo en un refrigerador o cuarto frío durante la noche (No descongele a temperatura ambiente o utilizando un baño de agua caliente). Proteína de la matriz alícuota (~ 200 μL; el volumen de una parte alícuota es determinado por el fabricante para cada lote e indicado en la etiqueta del frasco) en tubos de centrífuga estériles de vínculo de baja o tubos de criopreservación de células en el hielo. Es importante mantener la matriz extracelular proteína helada durante la distribución para evitar la solidificación. Almacenar las alícuotas a-80 ° C.
   2. Para cubrir los platos de plástico de cultivo celular con proteínas de matriz extracelular, diluir una alícuota con 25 mL helado DMEM/F12 y la extensión a tres platos de 10 cm (~ 8 mL/plato). Incubar platos a temperatura ambiente durante al menos 1 hora. Después de la capa, platos se pueden sellar con Parafilm y almacenados a temperatura ambiente por hasta una semana.
   3. Aspire el medio de los platos inmediatamente antes de la inoculación de pluripotencia preparado hiPSCs. No es necesario lavar los platos recubiertos con medio o solución salina tampón fosfato libre de calcio/magnesio [PBS(-)].
2. Iniciación de hiPSC cultura en el estado de pluripotencia preparado
   1. Añadir 2 μl de 50 mM Y27632 [inhibidor de la cinasa de la proteína Rho (roca)] a 10 mL de medio de mTeSR1 en un tubo de centrífuga de 15 mL. Preparar dos tubos de medio de roca suplementada con inhibidor de 10 mL para iniciar el cultivo de células en un plato de 10 cm de 1 mL celular caldo congelado. Utilice suplementada con Y27632 medio el mismo día. Medio de suplementada con Y27632 precalentamiento en baño de agua de 37 ° C durante 5 minutos.
      Nota: Este protocolo funciona bien con hiPSCs mantenidas en mTeSR1. Cuando hiPSCs se mantienen en otros medios de crecimiento humano de PSC con diversos grados de cebada, o ingenuo pluripotencia, rendimiento de hPGCLCs puede variar significativamente.
      Nota: La vida útil de mTeSR1 completa es 2 semanas a 4 ° C y 6 meses a-20 ° C, pero volver a congelación causas de bajo rendimiento. Congelan alícuotas de 40 mL de mTeSR1 a-20 ° C hasta su uso.
   2. Descongelar un vial de pluripotencia preparado hiPSC (1.0-3.0 x 10⁶ células en medio de la crioconservación de 1 mL) de caldo congelado utilizando un baño de agua de 37 ° C. Inmediatamente después de la terminación de deshielo, transferir todo el contenido de un vial en un tubo (10 mL) de precalentado medio suplementada con Y27632.
   3. Suspensión de células de centrifugar a temperatura ambiente, 300 x g para min 8 descartar el sobrenadante y resuspender el pellet celular con 10 mL precalentado suplementada con Y27632 desde el otro tubo.
   4. Distribuida uniformemente la suspensión celular en un plato de 10 cm recubierta de proteínas de matriz extracelular. Coloque el plato en una incubadora al tri-gas CO₂ (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂). Mantener la cultura hiPSC bajo una presión de oxígeno baja.
   5. Medio de cambio (mTeSR1 sin Y27632) todos los días. El inhibidor de la roca (Y27632) es crítico para la supervivencia de hiPSC inmediatamente después de la disociación de las células. Una vez hiPSCs se adhieren en la superficie de cubierta de proteína de matriz extracelular como agregados pequeños uniformemente distribuidos con > 10% confluencia (que típicamente se completa dentro de 16 horas después de la inoculación), Y27632 es prescindible. Cambio medio demasiado pronto después de la inoculación de hiPSCs disociada sin Y27632 puede causar muerte celular casi completa.
3. Passaging cebada pluripotencia hiPSCs
   Nota: Paso había preparado pluripotencia hiPSCs cuando colonias ocupan ~ 80% de la superficie de crecimiento eficaz. Densidades y procedimientos correctos pases es importante para la reproducibilidad experimental. Hemos visto que eficacia de la inducción de hPGCLC no es significativamente diferente entre culturas hiPSC 6 días después de la iniciación de un stock congelado (con uno o dos pasos) o un mes (con > 10 pasos). Inducción de hPGCLC fue realizada con éxito de hiPSCs mantenido durante más de dos meses, aunque la eficiencia no se evaluó cuantitativamente.
   1. Tomar 4 mL de mezcla de enzimas de la disociación de células en un tubo de centrífuga de 15 mL y alcancen la temperatura ambiente durante 5 minutos.
   2. Tubo de PBS(-) en una centrífuga de 15 mL de precalentamiento 10 mL para > 5 min a 37 ° C en un baño de agua.
   3. Añadir 2 μl de 50 mM Y27632 (inhibidor de la roca) a medio mTeSR1 de 10 mL en un tubo de centrífuga de 15 mL. Preparar dos tubos de medio ROCK suplementada con inhibidor de 10 mL y use el mismo día. En otro tubo de centrífuga de 15 mL, tomar 5 mL mTeSR1 sin agregar Y27632. Precaliente el medio +/-Y27632 en un baño de agua de 37 ° C durante 5 minutos.
      Nota: Todas las alícuotas medio preparadas en el paso 1.3.3 pueden contener Y27632.
   4. Aspire el medio viejo de una células 10 cm plato y enjuague una vez con precalentado 10 mL PBS(-). Descarte PBS(-) y añadir 4 mL de enzima de disociación al plato. Coloque el plato en un incubador de CO₂ (incubadora tri-gas funciona, pero no es necesario) ~ 4 minutos hasta que las células se separan de la parte inferior. Células de pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo para hacer la suspensión unicelular.
   5. Transferir la suspensión unicelular de hiPSC al tubo precalentado que contiene 5 mL medio sin Y27632 (volumen total en un tubo de 15 mL es de unos 9 mL). Centrifugar la suspensión a temperatura ambiente, 300 x g por 8 min.
   6. Deseche el sobrenadante y resuspender el sedimento con 10 mL del medio mediano precalentado con Y27632 celulares.
   7. Agregados de células usando un tamiz de 40 μm células y determine la densidad de la célula usando un contador Coulter.
   8. Diluir la suspensión celular con precalentado medio suplementada con Y27632 lograr 3.0 x 10⁶ células en 10 mL para inocular un plato de 10 cm recubierta de proteínas de matriz extracelular. Coloque el plato inoculado en una incubadora al tri-gas CO₂ (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂).
   9. Medio de cambio (mTeSR1 sin Y27632) todos los días.

2. generación de hPGCLCs

Nota: Iniciar los siguientes pasos cuando hiPSC células en un plato de 10 cm (mTeSR1 media, recubierta de proteínas de matriz extracelular) llega a la confluencia de ~ 80% (aproximadamente 10⁷ células).

1. Preparación de platos de cubierta de proteína de matriz extracelular (día 1)
   1. Descongelar una alícuota de la proteína de matriz extracelular en el hielo y diluir en 25 mL de DMEM/F12 helada.
   2. Suministrar proteínas de matriz extracelular diluida para placas de 6 pocillos (1 mL/pocillo). Una alícuota es suficiente para cubrir 24 pozos (4 platos). Incubar las placas a temperatura ambiente durante al menos 1 hora. Placas cubiertas sin usar pueden ser selladas y almacenadas a temperatura ambiente por hasta una semana.
   3. Aspire el medio de las placas inmediatamente antes de la inoculación de pluripotencia preparado hiPSCs. No es necesario lavar los platos recubiertos con medio o PBS(-).
2. Inoculación de pluripotencia preparado hiPSCs en placas recubiertas de proteínas de matriz extracelular (día 1)
   1. Tomar 4 mL de enzima de la disociación de células en un tubo de centrífuga de 15 mL y alcancen la temperatura ambiente durante 5 minutos.
   2. Tubo de PBS(-) en una centrífuga de 15 mL de precalentamiento 10 mL para > 5 min a 37 ° C en un baño de agua.
   3. Añadir 7 μl 50 mm Y27632 (inhibidor de la roca) a medio mTeSR1 de 35 mL en un tubo de centrífuga de 50 mL. Utilice medio Y27632 complementado en el mismo día. Hacer dos tubos de 70 mL total suplementada con Y27632 medio y precaliente el medio en un baño de agua de 37 ° C durante 15 minutos.
   4. Aspire el medio viejo de una células 10 cm plato y enjuague una vez con precalentado 10 mL PBS(-). Descarte PBS(-) y añadir 4 mL de enzima de disociación celular al plato. Coloque el plato en un incubador de CO₂ (incubadora tri-gas funciona, pero no es necesario) ~ 4 minutos hasta que las células se separan de la parte inferior. Células de pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo para hacer la suspensión unicelular.
   5. Transferir solo hiPSC-suspensión al tubo precalentado que contiene 10 mL suplementada con Y27632 medio. Centrifugar la suspensión a temperatura ambiente, 300 x g por 8 min.
   6. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet celular con medio suplementada con Y27632 precalentado de 10 mL.
   7. Filtrar la suspensión celular a través de un colador celular (tamaño de poro de 40 μm) para eliminar agregados de células y contar las células utilizando un contador Coulter.
   8. Diluir la suspensión unicelular hiPSC 5.0 x 10⁶ células en medio suplementada con Y27632 precalentado de 50 mL.
   9. Inocular la suspensión de células de 2 mL (2.0 x 10⁵ células) en cada pocillo de las placas de 6 pozos revestidas (4 platos, 24 pozos). Asegúrese de que las células se distribuyen uniformemente en cada pozo. Colocar placas de cultivo de células en una incubadora al tri-gas CO₂ (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂).
      Nota: La densidad de inóculo celular y distribución uniforme en cada bien es fundamental. Debido a la inoculación de hiPSCs en platos de 10 cm puede producir significativamente mayor densidad celular que otras áreas. Incluso la densidad celular de hiPSCs unicelular puede lograrse más fácilmente con las placas de 6 pozos.
   10. Cambiar el medio con 2 mTeSR1 mL/pozo (sin Y27632) en 24 horas después de la inoculación.
3. Conversión de la pluripotencia preparado estado hiPSCs a las células pluripotentes de 4i-ingenuo (ERK-independiente) (día 3 y día 4)
   1. Preparar medio de pluripotencia 4i ingenua completa en un tubo de centrífuga de 50 mL como sigue (día 3 y día 4): 50 mL de medio basal 4i, 5 μl de 30 mM CHIR99021, 5 μl de 10 mM PD0325901, 5 μl de 20 mM BIRB796, 5 μl de 50 mM SP600125 y 5 μl de 50 mM Y27632.
      Nota: Almacenar medio basal 4i a-80 ° C y descongelar en el refrigerador durante la noche. Preparar el medio completo fresco 4i inmediatamente antes del uso. Evite la exposición de los productos químicos 4i (CHIR, PD, BIRB y SP) a la luz fuerte. No almacene 4i completa medio a 4 º C o congelados durante la noche o más.
   2. Medio completo de tibia 50 mL 4i en un lote de agua de 37 ° C por medio de cambios de 15 minutos con precalentado medio completo 4i (2 mL/pocillo) a las 48 y 72 horas después de la inoculación. Momento exacto del cambio medio es importante para lograr la hPGCLC alto rendimiento y reproducibilidad experimental.
      Nota: Densidad de la cultura de hiPSC 4i es alto bajo esta condición y convertirse en confluente en 48-72 horas después de la inoculación, pero esto es normal.
4. Formación de EB con placas de pocillos (día 5)
   1. Preparar 50 mL de medio completo 4i en un tubo de centrífuga de 50 mL y precaliente en un baño de agua de 37 ° C de ~ 15 minutos antes de su uso.
   2. Precaliente 35 mL DMEM/F12 en un tubo de centrífuga de 50 mL en un baño de agua de 37 ° C de ~ 15 minutos antes de su uso.
   3. Preparar una placa de micropocillos
      1. Añadir detergente al 5% (w/v) filtro esterilizado Pluronic F-127 en 8 pozos activos de una placa de micropocillos (véase Tabla de materiales; 0,5 mL/pocillo).
      2. Centrifugar la placa de micropocillos a temperatura ambiente, 1.000 x g, durante 5 minutos los micropocillos examine con un microscopio invertido para asegurar la ausencia de burbujas de aire. Deje la placa de micropocillos de 30 min a temperatura ambiente para cubrir los micropocillos con detergente.
      3. Deseche la solución de detergente de los pozos de la placa de micropocillos por pozos de pipetear y enjuague con DMEM/F12 precalentado (2 mL/pocillo).
      4. Centrifugar la placa de micropocillos a temperatura ambiente, 1.000 x g durante 5 minutos los micropocillos examine con un microscopio invertido para asegurar la ausencia de burbujas de aire.
         Nota: Cuando todavía se observan burbujas de aire en los micropocillos, examinar si la hoja de micropocillos se pega firmemente a la parte inferior del pozo.
      5. Deseche el DMEM/F12 de pozos de la placa de micropocillos de pipetear y enjuague de los pozos con DMEM/F12 precalentado (2 mL/pocillo).
      6. Repita los pasos 2.4.3.3 - 2.4.3.4.
      7. Añadir medio completo 4i en el enjuagado pocillos de la placa de micropocillos (1 mL/pocillo). Mantenga el resto 4i el medio completo en un baño de agua de 37 ° C.
      8. Centrifugar la placa de micropocillos a temperatura ambiente, 1.000 x g durante 5 minutos los micropocillos examine con un microscopio invertido para asegurar la ausencia de burbujas de aire.
      9. Coloque la placa de micropocillos de una incubadora de tri-gas (37 º C, 6,5% O₂, 5% CO₂) hasta que la inoculación de hiPSCs 4i.
   4. Inoculación de iPSCs 4i en una placa de micropocillos de
      1. 13 mL de enzima de la disociación de células en un tubo de centrífuga de 15 mL y alcancen la temperatura ambiente durante 5 minutos.
      2. Precalentamiento 50 mL PBS(-) en una centrífuga de 50 mL tubo para > 5 min a 37 ° C en un baño de agua.
      3. Aspirar viejos medio de 24 pozos de ingenuo hiPSC célula cultura y enjuague las células una vez con 2 mL precalentado/bien PBS(-). Descarte PBS(-) y agregue 0.5 mL/pocillo disociación enzima. Coloque las placas de cultivo celular en un incubador de CO₂ (37 ° C) ~ 4 minutos hasta que las células se separan de la parte inferior. Células de pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo para hacer la suspensión unicelular.
      4. Transferir solo hiPSC-suspensión a precalentado 20 mL 4i medio completo. Centrifugar la suspensión a temperatura ambiente, 300 x g por 8 min.
      5. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet celular con medio completo de precalentado 4i 5 mL.
      6. Filtrar la suspensión celular a través de un tamiz celular (tamaño de poro de 40 μm) para remover agregados de células. Lave el filtro celular 3 veces con 1 mL precalentado 4i completo medio. Contar las células utilizando un contador Coulter.
      7. Diluir la suspensión única de 4i ingenuo hiPSCs a 27.0 32.4 x 10⁶ células en medio completo de 9 mL precalentado 4i. Tenga en cuenta que medio completo 4i ya contiene Y27632.
      8. Quite la placa de pocillos que contienen 1 mL de medio completo 4i 8 de una incubadora de tri-gas (2.4.3.9). Inocular la suspensión de 1 mL 4i ingenuo hiPSC (3.0-3.6 x 10⁶ células/pozo) en cada pocillo. Esta densidad celular es fundamental. Asegúrese de que las células se distribuyen uniformemente en cada pozo mediante pipeteo suave.
      9. Centrifugar la placa de micropocillos a temperatura ambiente, 100 x g durante 3 minutos.
      10. Coloque la placa de micropocillos en una incubadora al tri-gas CO₂ (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂). No molestar las células peleteadas en los micropocillos. Incube las células durante 24-30 horas. Una incubación durante la noche (~ 16 horas) es típicamente insuficiente para la formación de EBs apretado.
5. Transferencia de EBs a las placas de fijación baja de oscilación cultura (día 6)
   1. Preparar el medio completo hPGCLC en un tubo de centrífuga de 50 mL como sigue (día 6 - día 13):
      medio basal del hPGCLC de 20 mL, 4 μL de 2-Mercaptoetanol de 500 mM, 50 μL de ácido L-ascórbico de 20 mg/mL, 4 μL de 50 mM Y27632, 50 μL de 100 μg/mL BMP4 humana recombinante, 4 μL de 500 μg/mL SCF humano, 4 μL de EGF humano de 250 μg/mL y 8 μL de 250 μg/mL humano LIF.
      Nota: Preparar el medio completo fresco hPGCLC inmediatamente antes de su uso y evitar la exposición a la luz. No almacene hPGCLC completa medio a 4 º C o congelados durante la noche o más.
      Nota: La concentración de BMP4 es muy alta. La concentración óptima de BMP4 puede diferir entre lotes de BMP4. La diferencia de lote a lote de BMP4 afectan fuertemente la producción de hPGCLC. En la ausencia de BMP4 en el medio de hPGCLC completa, rendimiento de hPGCLCs es muy bajo⁶. La importancia de otras citoquinas en el medio de hPGCLC completo fue descrita por Hanna/Surani⁶.
      Nota: En el presente Protocolo, la concentración final de LIF humana en el medio de hPGCLC completa es 100 ng/mL^6,10. La concentración final de la LIF en estudios previamente publicados, incluyendo el nuestro, fue de 1 μg/mL. Cuando la actividad específica del humano reactivo LIF es > 10.000 unidades/μg (ED₅₀ < 0.1 ng/mL), LIF de 100 ng/mL es suficiente para respaldar la generación de hPGCLC de EBs.
   2. Transferencia de EBs
      1. Precaliente el medio basal de la hPGCLC de 5 mL y 20 mL hPGCLC medio completo para > 5 min a 37 ° C en un baño de agua.
      2. Con cuidado coloque un colador celular boca abajo encima de un tubo cónico de polipropileno 50 mL.
      3. Pipeta de cada pozo de pocillo muy suavemente placa placa para separar EBs de micropocillos. Filtrar todo el contenido de cada pocillo con el colador de la célula a eliminar las células que no incorporadas en EBs.
      4. Lavar EBs retenidas en el tamiz de la célula con 1 mL de medio basal hPGCLC precalentado. Suavemente repita lavado 5 veces.
      5. EBs lavado ahora son retenidos en la membrana de un colador, que se encuentra en un tubo cónico de 50 mL boca abajo. Coloque un fresco tubo cónico de 50 mL en el colador de la célula para que el filtro de la celda se coloca normalmente en el tubo de nuevo. Luego invierta rápidamente el colador de la celda con el tubo de nuevo. La alcachofa de la célula y el tubo están ahora en las posiciones normales, y EBs están por debajo de la membrana del filtro de la célula.
      6. Recoger EBs en el tubo cónico mediante la adición de medio completo de 18 mL hPGCLC precalentado desde arriba de la membrana de filtro de la célula. Así, medio iremos a través de la membrana y recoger EBs conectado en la parte inferior de la membrana hasta la parte inferior del tubo de centrífuga.
      7. Suspensión de la placa de EBs en los pocillos de una placa de 6 pozos de accesorio de baja (3 mL/pocillo).
      8. Coloque la placa de fijación de baja en un eje de balancín balancín-se mueven en una incubadora de tri-gas (37 º C, 6,5% O₂, 5% CO₂). Ajustar la velocidad oscilante en ~ 20 vueltas por minuto.
         Nota: No aplique movimiento que remolina porque agregado de EBs en el centro de los pozos y fusible. Cuidadosamente ajuste velocidad oscilante para que EBs no agregado. Demasiado vigoroso balanceo dañará físicamente EBs.
         Nota: La presión de oxígeno baja se recomienda cultivo EB.
6. Generación de hPGCLCs en la superficie de EBs (día 7 - día 13)
7. Recién preparar el medio completo de la hPGCLC de 20 mL cada día. Sin oscilación, EBs se hunden en el fondo de los pozos en ~ 1 min quitar medio viejo sin secado EBs (~0.2 mL/pocillo medio viejo puede permanecer) y añadir el medio completo fresco hPGCLC cada día (3 mL/pocillo).

3. inmunohistoquímica tinción de EBs (día 10-día 13)

1. Incrustación de EBs en bloques de la proteína de matriz extracelular para formaldehído-fijo, parafina-encajado (FFPE) immunostaining
   1. Para identificar hPGCLCs como OCT4⁺ EBs de la cosecha de células, en un tubo de microcentrífuga de vínculo de baja 1,5 mL. Que EBs se hunden hasta el fondo o brevemente Centrifugue (2 segundos) a temperatura ambiente y descartar el medio. Enjuague el EBs con PBS(-) helada.
   2. Quitar PBS(-) e incubar EBs en 1 mL de 1%(w/v) helada de azida de sodio en PBS(-) durante 5 minutos en hielo. Que EBs se hunden hasta el fondo o centrifugar brevemente (2 segundos) a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y enjuague EBs con PBS(-) helada.
      Nota: Además de azida de sodio disminuye la degradación de proteínas intracelulares y transcritos de RNA.
   3. Descongelar 200 μL de proteínas de matriz extracelular en el hielo y añadir al tubo de microcentrífuga con EBs. Dejar el tubo a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos hasta que el gel se solidifica.
   4. Añadir 1 mL de formaldehído al 4% en PBS(-) e incubar a temperatura ambiente durante 15 min con suave balanceo.
      Nota: Ambos EBs y proteína de la matriz extracelular son fijos durante este paso. Sin la fijación, los bloques de gel pueden descomponerse durante el proceso de deshidratación. Si EBs prefijados están integrados en el bloque de gel, EBs se fijan otra vez con el bloque de gel y puede ser demasiado fijo.
   5. Deseche el formaldehído y enjuague EBs una vez con PBS(-) helada. Añadir 1 mL de etanol al 70%. Gel integrado EBs puede almacenarse en etanol al 70% a 4 ° C durante una semana.
   6. Proceso de la EBs embebido en gel con un protocolo estándar de FFPE. Preparar 5 μm diapositivas FFPE de espesor. Deje seca durante la noche y guardarlos a temperatura ambiente hasta immunostaining.
      Nota: Nuestro protocolo FFPE rutina es la siguiente: etanol al 70%, dos cambios, 1 hora cada una; 80% de etanol, uno de los cambios, 1 hora; etanol al 95%, un cambio, 1 hora; etanol al 100%, tres cambios, 1,5 horas cada uno; xileno, tres cambios, 1,5 horas cada uno; cera de parafina (58-60 ° C), dos cambios, 2 horas cada una. Los tejidos deshidratados son incrustados en bloques de parafina y cortados en 3-10 μm (típicamente de 5 μm).
   7. Para la tinción, completamente secar las muestras en horno de 56 ° C durante al menos 30 min Deparaffinize e hidratar diapositivas con xilenos y series graduales de alcohol. Luego lavar portaobjetos en agua durante 5 minutos.
   8. Para inactivar peroxidasas endógenas, Incube los portaobjetos rehidratados con solución de bloqueo de BLOXALL a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego lavar el portaobjetos con PBS durante 5 minutos.
   9. Bloque se desliza con suero de caballo Normal (o sera normal de otros anticuerpos secundarios de especies generadas) a temperatura ambiente durante 20 minutos.
   10. Incube los portaobjetos con un anticuerpo primario anti-OCT-3/4 cabra diluido con 0.1% de BSA en PBS(-) a 4 ° C durante la noche (optimizar las condiciones de disolución y de incubación para cada anticuerpo primario). Luego lavar el portaobjetos con PBS(-) tres veces a temperatura ambiente, 5 minutos cada uno.
   11. Incube los portaobjetos con la anti-cabra IgG (rábano peroxidasa conjugado anticuerpo secundario generado por caballo; véase Tabla de materiales) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego lavar el portaobjetos con PBS(-) tres veces a temperatura ambiente, 5 minutos cada uno.
   12. Mezclar cantidades necesarias dad tinción sustratos (véase Tabla de materiales) inmediatamente antes del uso e Incube los portaobjetos en DAB completa coloración solución a temperatura ambiente durante 5 minutos Monitor DAB que manchaba usando un microscopio invertido y detener la reacción Cuando OCT4⁺ se visualizan células aclarando rápidamente diapositivas en agua corriente del grifo.
   13. Deshidratar el portaobjetos con series graduales de alcohol y xilenos. Las diapositivas están listas para Microdisección láser captura. Preparar diapositivas, FFPE permanentes utilizando los medio de montaje (véase Tabla de materiales) para observaciones microscópicas de alta resolución.

4. enriquecimiento FACS de hPGCLCs de EBs (día 10-día 13)

1. Preparación de mezcla de enzima de Embryoid Kit de disociación del cuerpo
   1. Preparar 1 mezcla de enzima mediante la adición de 50 μl enzima P a 1.900 μl de tampón de X y de vortex. Precaliente 1 mezcla de enzima en un baño de agua de 37 ° C durante 15 minutos.
   2. Preparación de enzima Mix 2 añadiendo 10 μl enzima A 20 μl Buffer Y.
   3. Mezclar mezclas de enzima 1 y 2 para preparar la mezcla de enzima de disociación de EB completa.
2. Disociación de EBs
   1. EBs de la cosecha de las placas de fijación baja y centrifugar a temperatura ambiente en un tubo de centrífuga de 15 mL, 300 x g durante 2 min descartar sobrenadante y resuspender EBs con 10 mL PBS(-). Centrifugar nuevamente.
   2. Deseche el sobrenadante y resuspender EBs con EB completa disociación mezcla de enzima (4.1.3). Incubar suspensión EB en un baño de agua de 37 ° C durante 15-20 min hasta que EBs son disociados. Durante la incubación, pipetee suavemente EBs en cada 3-5 min para facilitar la disociación. Como alternativa, utilice un disociador automatizado con Embryoid disociación programa.
   3. Agregar helado 8 mL PBS(-) a suspensión de células disociada EB. Filtrar la suspensión de células a través de un tamiz de 40 μm celular. Filtro de lavado celular con 1 mL PBS(-) helada tres veces.
   4. Contar las células en suspensión filtrada utilizando un contador Coulter.
   5. Centrifugue la suspensión de células a 4 ° c, 300 x g por 8 min y descartar el sobrenadante. Resuspender el pellet celular con helado 10 mL PBS(-).
   6. Suspensión de células se dividen en dos tubos, uno para el control de no-manchando (~ 10⁵ células) y el otro para anti-CD38 (todas las células restantes) la coloración.
   7. Centrifugar los dos tubos a 4 ° C, 300 x g por 8 min.
3. La coloración anti-CD38 y FACS enriquecimiento de hPGCLCs
   1. Resuspender el precipitado de células control no-manchando con 200 μL helada 3% (p/v) BSA y azida sódica al 1% (p/v) en PBS(-). Coloque en hielo hasta la citometría de flujo.
      Nota: Además de azida de sodio disminuye la internalización de CD38 de superficie de la célula.
   2. Resuspender el precipitado de células por tinción con helada 3% (p/v) BSA y azida de sodio 1% (p/v) en PBS(-) a 1 x 10⁶ células por 100 μl de anti-CD38.
   3. Añadir 10 μl por 1 x 10⁶ células de FACS-grado, anticuerpo anti-CD38 conjugado con APC. Cubrir el tubo con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Incubar a 4 ° C por 45 min con suave balanceo.
   4. Añadir 5 mL helado PBS(-) y centrifugar a 4 ° C, 300 x g por 8 min descartar sobrenadante y resuspender células de pellets con 5 mL PBS(-) helada. Repetir el lavado con PBS(-) tres veces en total.
   5. Resuspender el precipitado de células con azida de sodio de 500 μL helada 3% (p/v) BSA y el 1% (p/v) en PBS(-) a una densidad celular adecuada para FACS.
   6. Enriquecen hPGCLCs como CD38⁺ las células que normalmente forman la población claramente distinguido de la célula. Utilice el control de manchas no para garantizar la identificación de CD38⁺ las células. Rendimiento típico de hPGCLCs son 1-5% de todos FACS examinó células de EBs de 10 días y 20-40% del día 13 EBs.

Resultados

La placa de micropocillos utilizada aquí es en el formato de 24 pocillos y tiene 8 pocillos con las hojas de pocillos, cada uno de ellos apoya formación de hasta 1.200 EBs. De aproximadamente 24 millones de células de pluripotencia 4i ingenuo, esta placa de micropocillos de genera normalmente ~ 8.000 EBs de ~ 3.000 células por EB. Durante la cultura de no adherente de EBs con oscilación constante, el número de EBs intacto disminuye gradualmente debido a la espontánea uno mismo-desmontaje y ~ 3.000 EBs sobrevivir hasta el día 13 del protocolo. La mayoría de estos sobrevivientes EBs tiene 50-200 hPGCLCs en su superficie (estimado por la detección de immunohistochemical de OCT4 + células en secciones seriadas de EBs; vea la figura 8), rendimiento ~ 100.000 OCT4 + hPGCLCs en total. Digestión enzimática de EBs en las células es un proceso relativamente ineficiente, reduciendo el rendimiento de FACS-enriquecido CD38 + hPGCLCs a 9.000-47.000 células. En nuestras manos, un promedio de seis lotes independientes pero consecutivos de experimentos fue de 14.038 ± 5.731 (media ± SEM). Porque células CD38-negativa EB expresan OCT4 mRNA (qPCR) o proteína (inmunohistoquímica) solamente muy débil, si no totalmente ausentes, de todas las células de la EB fuertemente expresan la proteína OCT4 equivalen prácticamente a toda la población de CD38 + hPGCLCs.

El parámetro crítico de este protocolo incluye la densidad celular. Cuando 2.0 x 10⁵ iPSCs humano se inoculan en una matriz extracelular proteína cubierta de placa de cultivo celular 6-pozo (área de² 9,60 cm crecimiento por pozo) con medio de suplementada con Y27632 2 mL (2.2.9), las células alcanzarán a unos 20-30% confluency en 24 horas después de la inoculación (figura 1). Después de una cultura de 24 horas adicional en el medio mTeSR1 en la ausencia de Y7632, agregados de células y forma colonias, ocupando un ~ 30% de la zona de crecimiento (figura 2). Las células son luego cultivadas en medio reprogramación 4i (2.3.2). Después de 24 horas de cultura en el confluente de células se convierten en medio, 4i (figura 3). Una cultura adicional de 24 horas en el medio de 4i hace que las células densamente poblado (figura 4). El momento exacto del cambio medio (cada 24 horas +-4 horas) y las densidades de célula son cruciales para el éxito formación de EBs y hPGCLCs.

Después de 48 horas cultura en el medio de 4i, las células son disociadas e inoculadas a la placa de micropocillos, que tiene pozos 400 μm en tamaño (2,4). Aunque esta placa de micropocillos de disponible en el mercado es cubierta por baja adherencia por el fabricante, fresco decubrir con detergente (2.4.3) se recomienda para reducir el riesgo de adherencia de células no deseadas. 800 μm micropocillos dio lugar a la producción reducida de hPGCLCs, lo que sugiere la importancia del tamaño de EB para diferenciar correctamente dirigida. Células inoculadas en el medio de 4i forman EBs en los micropocillos a 24-30 horas, que puede ser observados con un estándar, invertido fase microscopio de contraste (figura 5). El contorno circular del EBs se hacen claramente visibles en y después de 24 horas de incubación. EBs de la cosecha en un tiempo anterior (por ejemplo, 16 horas después de la inoculación) antes de que su contorno circular es claramente visible no se recomienda porque tal EBs son muy vulnerables a los daños mecanicistas y desmontar fácilmente. Tenga en cuenta que cantidades significativas de hiPSCs ingenuo no se incorporan en EBs, que es normal. Estas células no incorporadas serán arrastradas antes de la iniciación de la oscilante cultura de EBs en adherente de baja superficie (2.5.2). También tenga en cuenta que, en nuestro protocolo, EBs se forman en el medio de pluripotencia de ingenuo 4i - no en el medio hPGCLC. La formación de sólidos EBs en el medio de 4i antes de la exposición al medio hPGCLC es importante para la distribución de hPGCLCs en la superficie de EBs.

EBs se mantuvo en el medio hPGCLC en una mecedora, condición no adherente cultura mantendrá su forma esférica sin agregación o fusión (figura 6 y figura 7). Demasiado débil oscilación condición causará EB la agregación y fusión, pero demasiado dura condición desmantelará EBs. PGCLCs humanos emergen como OCT4-expresar las células en la superficie de EBs después tan pronto como la cultura de 5 días en el medio de hPGCLC y su número aumenta hasta la cultura de 8 días (figura 8). Incubación más de EBs puede provocar desmantelamiento de EBs y la pérdida de hPGCLCs. PGCLCs humanos pueden ser enriquecidas de células disociadas enzimáticamente de EB después de 5 a 8 días de cultivo en el medio hPGCLC por FACS como células CD38 + (figura 9).

Figura 1: cultivo de células humanas iPSC en suplementada con Y27632 medio 24 horas después de la inoculación. Densidad celular es aproximadamente un 20-30% confluente. En presencia del inhibidor de la roca Y27632, las células tienden a propagarse con elongación largo, como spike. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: cultivo de células iPSC humanas 48 horas después de la inoculación. Agregado a las colonias de forma, ocupando un ~ 30% del área de crecimiento de las células. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: cultivo de células iPSC humanas incubadas en medio reprogramación 4i durante 24 horas. Las células llegar a confluencia. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: cultivo de células iPSC humanas incubadas en medio reprogramación 4i durante 48 horas. Las células confluentes son densamente pobladas. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: iPSC humana EBs formado en los micropocillos después de 24 horas de incubación en el 4i reprogramación medio. El contorno circular del EBs se hacen visibles a las 24-30 horas después de la inoculación. Cuando el contorno es confirmado bajo el microscopio de contraste de fase, EBs está listo para la transferencia a una condición oscilante de la cultura. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: iPSC humana EBs se incubaron durante 24 horas en el medio de hPGCLC. EBs en gran parte mantienen su forma esférica. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: iPSC humana EBs se incubó durante 192 horas en el medio de hPGCLC. EBs se agrandan en comparación con su aspecto en cultivo de 24 horas, pero aún mantienen esféricas sin agregación o fusión. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: PGCLCs humanos expresan OCT4 se localizan en la superficie de hiPSC EBs se incubó durante 192 horas en el medio de hPGCLC. EBs se incorporado en la proteína de matriz extracelular y procesados para la coloración de immunohistochemical FFPE diapositiva de OCT4 (sustrato DAB). Barra de escala = 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: PGCLCs humanos están enriquecidas de células disociadas enzimáticamente de EB por FACS como CD38⁺ células. Después de incubación en el medio de hPGCLC 5-8 días, EBs puede ser disociado por digestión enzimática para preparar suspensión unicelular. hPGCLCs puede ser enriquecido como CD38⁺ de las células por FACS (puntos rojos). Las células de la EB que no expresan CD38 (puntos azules) también deben ser recopilados como control negativo. Puertas de FACS de células CD38 positivas y CD38-negativas deben estar separados con un amplio margen (puntos verdes) para evitar la contaminación de cada tipo de células. Los paneles superiores e inferiores muestran perfiles de FACS sin o con anticuerpos anti-CD38 coloración, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Producción robusta de hPGCLCs utilizando el protocolo descrito aquí fue confirmada con tres clones independientes de iPSCs humana con el karyotype diploide normal¹⁰. Estos clones de iPSC se derivan de la misma piel cutánea neonatal humana fibroblastos célula cultura¹⁰. Se proporcionará por los autores de este artículo a los investigadores a petición y bajo acuerdo de transferencia de materiales apropiados y envío a disposición de las células humanas vivas. Es actualmente desconocido si el karyotype normal es necesario para producción de hPGCLC robusto usando nuestro protocolo o los reportados por otros laboratorios.

Estudios recientes han demostrado que la producción de hPGCLCs de hiPSCs¹¹ o CES¹⁴ utilizando un protocolo descrito por grupo de Saitou de la Universidad de Kyoto⁸ es dependiente en la expresión de EOMESODERMIN, un factor de transcripción T-box requeridos para inducción de SOX17. SOX17 parece funcionar como el linaje principal determinar el factor de la transcripción en línea germinal diferenciación de las células de vástago de pluripotent humana⁶. EOMESODERMIN es codificada por el gen EOMES , CRISPR/Cas9 nocaut de EOMES causado ausencia casi completa de la inducción de SOX17 en la hPGCLC producir condición¹¹y expresión de otros genes siguió el mismo patrón de la Células SOX17-null nocaut. La sobreexpresión de EOMESODERMIN de un vector inducible en EOMES-células null nocaut durante cultura de inducción hPGCLC rescataron eficientemente la hPGCLC robusta producción así como la inducción de genes de línea germinal, incluyendo SOX17. Por el contrario, sobreexpresión inducida SOX17 también rescató la robusta producción PGCLC pero sin inducir EOMES. Así, EOMESODERMIN es un inductor crítico aguas arriba de SOX17, y esto parece el solo papel más importante de EOMESODERMIN en hPGCLC inducción de células madre pluripotentes humanas. Nuestro protocolo induce SOX17 en hiPSCs¹⁰, pero su dependencia sobre la inducción de EOMESODERMINE espera para determinarse.

Este protocolo convierte pluripotencia cebada iPSCs humano mantenida en el medio mTeSR1 a ERK-independiente ingenuo pluripotencia durante 96 horas en el 4i reprogramación media⁶, que es un ingenuo modificado células madre humanas medio (NHSM)⁵. Nuestros intentos de generar hPGCLCs a partir de los mismos clones de iPSC humanas pero mantenido en otros medios de crecimiento de iPSC humanas disponibles en el mercado antes de la cultura en el 4i reprogramación medio dio lugar a diversos grados de un menor rendimiento de hPGCLC. Aunque si adaptación a largo plazo en otros medios mejora la producción de hPGCLC o no sigue siendo determinar en estudios futuros, esta observación sugiere que el estado exacto de la pluripotencia preparado de iPSCs humana antes de la 4i reprogramación significativamente formación de EB de impactos en el medio de 4i y diferenciación de EB en medio de hPGCLC.

Producción de hPGCLCs de hiPSCs siguiendo nuestro protocolo es robusto y altamente reproducible, en parte debido a la utilización de las placas de pocillos que permiten la producción eficiente de un gran número de EBs (~ 8.000 EBs por lote) con un tamaño uniforme (3.000 hiPSCs por EB). El número de EBs fácilmente producido en un único lote de experimento usando nuestro protocolo puede ser mucho mayor que los métodos usando los pozos de cultura regulares de fondo U celular. Producción de un gran número de igual tamaño EBs uniforme tachonado con hPGCLCs puede proporcionar oportunidades únicas de exámenes químicos de alto rendimiento para identificar pequeñas peso molecular activadores o inhibidores que afectan a la especificación del PGC o sus características biológicas tales como reprogramación epigenética. Tal EBs también puede ser útil para la evaluación toxicológica de un gran número de sustancias tóxicas de células germinales, incluyendo no sólo los contaminantes ambientales sino también clínico prescritos medicamentos como agentes quimioterapéuticos.

Los factores críticos de la producción robusta y reproducible de hPGCLCs usando el protocolo presentado incluyen (i) el uso de hiPSCs saludable mantenidas en mTeSR1 en la proteína de matriz extracelular, (ii) para inocular a un número exacto de células especificadas y estrictamente Siga los tiempos de cambio medio y subcultura, (iii) seleccionar mucho buena BMP4 recombinante humano y (iv) para minimizar los daños físicos de EBs en la cultura rock. Es nuestra experiencia que el mejor lote del reactivo de BMP4 trabajó en concentración de 100 ng/mL mientras que otro lote de reactivos de BMP4 había requerido 2 X o mayor dosis. Por otro lado, producción de hPGCLCs producción usando el mejor lote de BMP4 algo disminuido en dosis más altas de BMP4 (p. ej., 200 ng/mL). Recomendamos probar varios lotes distintos de recombinante humano BMP4 reactivos obtenidos de múltiples proveedores para su desempeño en el apoyo a generación de hPGCLC y para garantizar una gran cantidad del mejor lote.

Una característica única de nuestro protocolo de hPGCLC es que hPGCLCs se localizan en la capa superficial externa de EBs¹⁰ (figura 8), mientras que otros protocolos pueden generar hPGCLCs en el medio celular agregados^6,8. Embryoid cuerpos tienden a formar múltiples capas distintas tales como superficie, exterior, cáscara interna y base, y las regiones centrales son a menudo necróticas debido al limitado suministro de nutrientes, oxígeno, así como forma de factores de crecimiento previstos pro-sobrevivir la cultura medio de difusión²⁰. Localización de hPGCLCs en la superficie de EBs sin restricciones posible debido a la limitada difusión hacia el centro de EBs puede ser beneficioso para, controlada por la dosis y el tiempo la exposición directa de hPGCLCs a drogas o sustancias tóxicas para el farmacológico o estudios toxicológicos.

Mientras que el ratón PGCLCs Mostrar robusto genoma desmetilación del ADN que implican la impresión controlar regiones al menos en parte^7,19,20, el grado de desmetilación global gDNA en hPGCLCs parece más débil que el ratón PGCLCS o PGCs^6,7. Perfiles de Transcriptomal sugieren que hPGCLCs puede asemejarse a una etapa anterior de PGCs embrionarias de ratón PGCLCs¹⁰. Se ha informado de que cultura prolongada del EBs con la condición de la producción de hPGCLC causó un grado creciente de gDNA desmetilación⁷; sin embargo, si un largo período de la cultura de hPGCLCs en EBs o como células aisladas puede alcanzar etapas más avanzadas de la diferenciación de la línea germinal debe ser determinada por estudios futuros.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Primed pluripotence hiPSC culture
			200 μ L). Utilice tubos fríos. Almacenar a -80 ° C
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	21041-025	Tienda a las 4 °C.
mTeSR1	STEMCELL Technologies	85850	Reconstituir añadiendo 5X Suplemento al Medio Basal. El medio reconstituido se puede almacenar a 4 & grados; C durante un 4 semanas sin afectar el rendimiento del cultivo celular.
Y27632	Axon	1683	Diluido 5 mg Y27632 (MW 320.26) con 312.2 μ L de agua para preparar 50 mM de solución madre Y27632. Esterilizar por filtración (0,22 μ m). Alícuota 20 μ L/tubo x 15 tubos y almacenar a -20 °C.
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	07930	Tienda en 4 °C.
Accutase	Innovative cell technologies	AT104-500	Enzima de disociación celular; alícuota 40 mL/tubo x 12 tubos y almacenar a -20 °C.
Name	Company	>Número de catálogo	Comments
4i hiPSC culture
KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	A1286101
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Alícuota 40 mL/tubo x 12 tubos y almacenar a -20 °C.
Penicilina-estreptomicina-glutamina (100x)	Thermo Fisher Scientific	10378016
MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140050
Insulina de páncreas bovino	Sigma-Aldrich	I1882-100MG	Añadir 0,1 mL de ácido acético glacial a 10 mL de agua. Esterilizar por filtración (0,22 mmm). Diluya 100 mg de polvo liofilizado de insulina con 10 ml de agua acidificada fría para hacer una solución madre de 10 mg/mL. Alícuota 650 μ L/tubo x 15 tubos y almacenar a -80 °C.
humano LIF	PeproTech	300-05	Reconstituir 250 μ g LIF humano con 250 μ L agua. Agregue 750 μ L de 0,1% de albúmina sérica bovina en PBS(-) para hacer 250 μ g/mL de solución madre LIF humana. La actividad específica de este producto es de >10.000 unidades/μg. Alícuota 40 ul/tubo x 25 tubos y almacenar a -80 °C.
humano FGF2	R& D Systems	4114-TC	Reconstituir 1 mg de FGF2 humano con 5 mL de PBS(-) para hacer 200 μ g/mL de solución madre humana de FGF2. Alícuota 100 μ L/tubo x 50 tubos y almacenar a -80 °C.
TGF-y beta humano; 1	PeproTech	100-21	Reconstitita 50 μ g con 50 μ L de 10 mM de ácido cítrico (pH 3,0). Agregue 150 μ L de 0,1% de albúmina sérica bovina en PBS(-) para hacer 250 μ g/mL de TGF-y beta humano; 1 solución madre. Alícuota 4 μ L/tubo x 50 tubos y almacenar a -80 °C.
		basal 4i	Mezcle los siguientes reactivos para hacer medio basal 4i. 500 mL de KnockOut DMEM 100 mL de KnockOut Serum Replacement 6 mL de Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100x) 6 mL de Solución de Aminoácidos No Esenciales MEM (100x) 650 µ L de 10 mg/mL Insulina de páncreas bovino 40 y micro; L de 250 y micro; g/mL LIF humano 20 y micro; l de 200 y micro; g/ml humano FGF2 4 y micro; l de 250 y micro; g/ml de TGF-y beta humano; 1 Alícuotas 40 ml/tubo y almacenar a -80 °C.
CHIR99021	Axon	1386	Reconstituye 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) con 1791 μ L DMSO para hacer 30 mM CHIR99021 solución madre. Alícuota 50 μ L/tubo x 35 tubos y almacenar a -20 °C.
PD0325901	Axon	1408	Reconstituye 5 mg PD0325901 (MW 482.19) con 1037 μ L DMSO para hacer 10 mM PD0325901 solución madre. Alícuota 50 μ L/tubo x 20 tubos y almacenar a -20 °C.
BIRB796	Axon	1358	Reconstituir 10 mg BIRB796 (MW 527.66) con 948 μ L DMSO para hacer 20 mM BIRB796 solución madre. Alícuota 50 μ L/tubo x 18 tubos y almacenar a -20 °C.
SP600125	Tocris	1496	Reconstituir 10 mg SP600125 (MW220.23) con 908 μ L DMSO para hacer 50 mM SP600125 solución madre. Alícuota 50 μ L/tubo x 18 tubos y almacenar a -20 °C.
AggreWell400	STEMCELL Technologies	27845	Placa de micropocillo
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Reconstituya 5 g de Pluronic F-127 en 100 mL de agua para hacer una solución madre de Pluronic F127 al 5% (p/v). Esterilizar por filtración (0,22 mmm). Aliqout 50 mL/tubo x 2 tubos y almacenar en r.t.
Nombre	>Company	Número de catálogo	Comments
>hPGCLC culture
Glasgow' s MEM	Thermo Fisher Scientific	11710035
Piruvato de sodio (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360070
Penicilina-estreptomicina (100x)	Corning	30-002-CI
medio basal			Mezcle los siguientes reactivos para hacer el medio basal de hPGCLC. 500 mL de Glasgow' s MEM 75 mL de Reemplazo de Suero KnockOut 6 mL de Solución de Aminoácidos No Esenciales MEM (100x) 6 mL de 100 mM de piruvato de sodio 6 mL de Penicilina-Estreptomicina (x100) Alícuotas 40 mL/tubo y almacenar a -20 °C.
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148	Diluido 350 μ L 2-Mercaptoetanol (14,3 M) en 9,65 mL PBS(-) para hacer 500 mM de solución madre de 2-Mercaptoetanol. Almacenar a 4 °C.
Ácido L-ascórbico	Sigma-Aldrich	A4544	Reconstituya 400 mg de ácido L-ascórbico con 20 mL de agua para hacer una solución madre de 20 mg/mL de ácido L-ascórbico. Esterilizar por filtración (0,22 mmm). Alícuota 500 μ L/tubo x 40 tubos y almacenar a -20 °C.
BMP4 humano recombinante	R& D Systems	314-BP	Reconstituir 1 mg de BMP4 humano recombinante con 10 mL de 4mM HCl aq. para hacer 100 μ g/mL de solución madre humana recombinante de BMP4. Alícuota 250 μ L/tubo x 40 tubos y almacenar a -80 °C.
SCF humano	PeproTech	300-07	Reconstituir 250 μ g SCF humano con 500 μ L de albúmina sérica bovina al 0,1% en PBS(-) para hacer 500 μ g/mL de solución madre de SCF humano. Alícuota 35 μ L/tubo x 14 tubos y almacenar a -80 °C.
EGF humano	PeproTech	AF-100-15	Reconstituya 1 mg de EGF humano con 1 mL de albúmina sérica bovina al 0,1% en PBS(-) para hacer una solución madre de EGF humano de 1 mg/mL. Aliqot 100 μ L/tubo x 10 tubos. Diluir 100 μ L de 1 mg/ml de solución madre de EGF humano con 300 μ L de 0,1% de albúmina sérica bovina en PBS(-) para hacer 250 μ g/mL de solución madre de EGF humano. Alícuota 20 μ L/tubo x 20 tubos. Almacenar a -80 °C.
Colador de celdas	Corning	352340	Tamaño de poro = 40 μm.
Tubo cónico de polipropileno de 50 ml	Corning	352070
Placa de fijación baja	Corning	3471
Balancín de plataforma Vari-Mix	Thermofisher	M79735Q
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Tinción inmunohistoquímica
BLOXALL Solución de bloqueo	VECTOR	SP-6000
Normal Caballo suero ImmPRESS Reactivo Anti-Cabra IgG	VECTOR	MP-7405
OCT-3/4 Anticuerpo	Santa Cruz	SC-8629
ImmPACT DAB	VECTOR	SK-4105
Permount	Thermofisher	SP15-100	Montaje medio
Nombre	>Empresa	Número de catálogo	Comentarios
>aislante hPGCLC
disociación corporal embrioidal	Miltenyi Biotec	130-096-348
Anticuerpo anti-CD38 conjugado con APC	abcam	ab134399