TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma

Resumen

Se describe un protocolo paso a paso para cromatina tándem inmunoprecipitación secuenciación (tChIP-Seq) que permite el análisis de modificaciones específicas del tipo de célula genoma histona.

Resumen

Regulación epigenética juega un papel central en la expresión génica. Puesto que la modificación de las histonas se descubrió en la década de 1960, sus funciones fisiológicas y patológicas se han estudiado ampliamente. De hecho, la llegada de próxima generación secuenciación profunda e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) mediante anticuerpos de modificación específica de la histona ha revolucionado nuestra visión de la regulación epigenética a través del genoma. Por el contrario, tejidos consisten en típicamente tipos celulares diferentes, y su mezcla compleja plantea desafíos analíticos a investigar el epigenoma en un tipo de célula particular. Para abordar el estado de cromatina tipo específico de célula en forma de genoma, recientemente desarrollamos tándem cromatina inmunoprecipitación secuenciación (tChIP-Seq), que se basa en la purificación selectiva de la cromatina por las proteínas de histona etiquetado núcleo de célula tipos de interés, seguido por ChIP-seq. El objetivo de este protocolo es la introducción de mejores prácticas de tChIP-SS. Esta técnica proporciona una herramienta versátil para la investigación de tejidos específicos epigenoma en modificaciones de las histonas diversas y organismos modelo.

Introducción

Los tejidos de los animales consisten en tipos de células diferentes. La regulación del gene en cada célula define el tipo de célula. Modificaciones de la cromatina - ADN metilación e histona modificación - ser la base de la especificidad del tipo de la célula de la expresión génica. Así, la medición de la regulación epigenética en cada tipo de célula ha sido deseada, pero ha sido un desafío técnico.

Para investigar la epigenética en un tipo de célula particular, la secuencia de inmunoprecipitación de cromatina tándem (tChIP-Seq) fue recientemente desarrollado ()figura 1)

Protocolo

Todos los métodos descritos han sido aprobados por la división de seguridad de RIKEN (H27-EP071) y llevado a cabo con reglamentos y directrices pertinentes.

1. disección del tejido

1. Disecar los tejidos de interés en pequeños pedazos (aproximadamente < 3 mm²) con unas tijeras finas primavera.
   Nota: Fragmentos de tejidos más grandes tardan más tiempo en congelarse, y piezas más pequeñas se transportan a mayores volúmenes de buffer, que pueden afectar los resultados.
2. Añadir los fragmentos de tejido disecado a un recipiente limpio llenado de nitrógeno líquido y recogerlas en tubos con 2 mL (1 pieza por tubo) lle....

Resultados

Aquí, describimos la disección del tejido, fijación, lisis celular, purificación del tándem de cromatina y preparación de biblioteca de DNA para secuenciadores de última generación. Durante los procedimientos, uno puede probar la calidad de la DNA, que es la clave para la secuencia del éxito, en varios pasos (figura 2). Puesto que un nucleosoma solo es rodeada típicamente por 147 bp DNA ⁴, esquilado ADN no debe ser menor que el tamaño........

Discusión

Nuestro protocolo se ha optimizado para las neuronas del cerebro de ratón, en el que la expresión de tagged bandera H2B es inducida por inyección de tamoxifeno. Promotores para expresión H2B, partida materiales de tejido y la cantidad de los tejidos son parámetros fundamentales para éxito tChIP-SS. Por lo tanto, la optimización de estos factores debe considerarse para cada tipo de célula de interés.

Un paso fundamental entre los procedimientos utilizados en el presente Protocolo es el ADN de c.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo LoBind de proteínas, 2 mL	Eppendorf	No.  0030108132	Para lisis celular
Tubo LoBind de proteínas, 1,5 mL	Nº Eppendorf	0030108116	Para ChIP y preparación de bibliotecas
Tubo LoBind de ADN, 1,5 mL	Nº Eppendorf	nbsp; 0030108051	Para ChIP y preparación
de bibliotecas Tubo de PCR de 8 tiras	BIO-BIK	3247-00	Para ChIP y preparación de bibliotecas
SK Mill	TOKKEN	SK-200	Práctico molinillo criogénico para hacer polvo de células para la fijación
Bala de metal	TOKKEN	SK-100-DLC10	Accesorio de SK Mill
Tubo de acero inoxidable de 2 mL	TOKKEN	TK-AM5-SUS	Una opción para la célula lisis
2 mL soporte de tubo de acero inoxidable	TOKKEN	SK-100-TL	Una opción para la lisis celular
16% formaldehído (p/v), sin metanol	Pierce	28906	Para fijar células. Prepare la solución al 1% antes de usar.
Glicina	Nacalai Tesque	17109-35	Preparar 2,5 M de stock
D-PBS (-)(1x)	Nacalai Tesque	14249-24	Para el lavado de lisado y ADN purificado
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	Para tampón de lisis 1. Preparar 1 M, pH 7,5 caldo.
5 M NaCl, grado de biología molecular	Nacalai Tesque	06900-14	para tampón de lisis 1, tampón de lisis 2, tampón de elución ChIP y tampón Tris-EDTA-NaCl
0,5 M EDTA, grado de biología molecular	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	Para tampón de lisis 1, tampón de lisis 2, tampón de elución ChIP y tampón Tris-EDTA-NaCl
glicerol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	Para tampón de lisis 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	Para tampón de lisis 1
Triton X-100, grado de biología molecular	Nacalai Tesque	12967-32	Para tampón de lisis 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	Para tampón de lisis 2, tampón de elución ChIP y tampón Tris-EDTA-NaCl. Prepare caldo de 1 M, pH 8.0.
0.1 M EGTA pH neutro	Nacalai Tesque	08947-35	Para tampón de lisis 2
Cóctel de inhibidores de proteasa (100x)	Nacalai Tesque	25955-24	Para bloquear la degradación de proteínas
Tampón RIPA	Thermo Fisher Scientific	89900	Para lisis celular y lavado
milliTUBE 1 mL AFA Fiber	Covaris	520130	Tubo sonicador. Accesorio de ultrasonido enfocado
ultrasonido enfocado	Covaris	S220 o E220	Para digerir el ADN en el tamaño adecuado para ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	para ChIP Tampón de elución
RNasa A	Nacalai Tesque	30141-14	Para purificar el ADN del lisado
Proteinasa K, recombinante, Grado PCR	Sigma-Aldrich	3115887001	Para purificar el ADN del etanol lisado
	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	Hacer una solución al 70%
Anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 producido en ratón	Sigma-Aldrich	F1804	Para purificar la cromatina expresada en células de interés
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	Esto se puede utilizar para anti-FLAG IP y anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-metilhistona H3 (K4), anticuerpo monoclonal de ratón	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	301-34811	Cualquier otro anticuerpo que funcione para el análisis de ChIP funcionará
10x Reactivo de bloqueo	Sigma-Aldrich		11096176001 Para el bloqueo durante la purificación por afinidad
Denhardt' s solución	Nacalai Tesque	10727-74	Para el bloqueo durante la purificación por afinidad
Glucógeno (5 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	Para purificar ADN a partir de lisado
Qubit 2.0 Fluorímetro	Thermo Fisher Scientific	Q32866	Para la cuantificación de ADN aislado
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo	Fisher Scientific	Q32851	Para la cuantificación de ADN aislado
Tubo de 0,5 mL	Axygen	10011-830	Para cuantificación por Qubit
Fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1)	Nacalai Tesque	25970-56	Para purificar el ADN del lisado
Cuentas AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	SPRI perlas magnéticas para la preparación de bibliotecas
Cubitera metálica	Funakoshi	IR-1	Para mantener congelado el lisado celular
Enfriador	de muestras New England Biolabs	T7771S	Ayuda a reparar las células con un daño mínimo
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	Para comprobar la calidad de los fragmentos de ADN aislados. Se puede utilizar otro analizador de fragmentos.
Bioanalyzer 2100 Expert Software	Agilent Technologies	G2946CA	suministra con el kit de
ADN de alta sensibilidad	Agilent Technologies	5067-4626	Para comprobar la calidad de los fragmentos de ADN aislados
KAPA LTP Library Preparation Kit		07961898001	Se suministra con 10 tampones de reparación de extremos KAPA, mezcla de enzimas de reparación de extremos KAPA, tampón de cola A de KAPA, enzima de cola KAPA, tampón de ligadura de KAPA, ligasa de ADN KAPA y solución de PEG / NaCl
Códigos de barras de ADN NEXTflex Adaptador	BIOO Scientific	NOVA-514101	para la preparación de bibliotecas. Se suministra con adaptadores de código de barras DNA y mezcla de cebador.
Kit de amplificación de biblioteca en tiempo real KAPA	Roche 07959028001		suministrado con 2 mezclas maestras de PCR en tiempo real KAPA HiFi HS, mezcla de cebadores de PCR y estándares fluorescentes
2 KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	para la preparación de bibliotecas. Además, esta enzima puede ser necesaria para el kit de amplificación de biblioteca en tiempo real KAPA
Tampón EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl, pH 8,5 para la elución de ADN
Placa qPCR de 386 pocillos	Thermo Fisher Scientific	4309849	para PCR en tiempo real
QuantStudio 7 Flex Sistema de PCR en tiempo real	Thermo Fisher Scientific	4485701	Para cuantificar
la película adhesiva óptica MicroAmp de ADN	Thermo Fisher Scientific	4311971	Para PCR en tiempo real
MicroAmp Película adhesiva transparente	Thermo Fisher Scientific	4306311	para el sellado de placas
Mezcla			Combine 1.4 µ L de 10x Tampón de reparación de extremos KAPA, 1 µ L de KAPA End Repair Enzyme Mix, y 1.6 µ L de H2O
		maestra A-taling	Combine 1 µ L de tampón de relaves KAPA A, 0,6 y micro; L de la enzima de cola KAPA A, y 8.4 µ L de H2O
		tampón de ligadura	Combine 2 µ L de tampón de ligadura KAPA y 6 µ L de H2O
		maestra de PCR en tiempo real	Combine 5 µ L de 2x KAPA HiFi HS PCR en tiempo real Master Mix, 0.35 y micro; L de mezcla de cebadores para PCR (10 y micro; M cada uno de los cebadores delanteros AATGATACGGCGACCACCGAG y cebadores inversos (CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), y 3.15 µ L de H2O
PCR master mix			Combine 10 µ L de 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 y micro; L de mezcla de cebadores PCR, y 0,6 y micro; L de H2
O Visor de Genómica Integrativa	Broad Institute	IGV_2.3.88	Navegador de genoma para visualizar datos de secuenciación
Oligionucleótido de ADN: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		Un cebador para amplificar la región promotora del
olgionucleótido de ADN GAPDH: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		Un cebador para amplificar la región promotora de GAPDH
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	Para cuantificar el ADN correspondiente a la región promotora de GADPH
Termociclador Dice	Takara	TP870	Para cuantificar el ADN correspondiente a la región promotora de GADPH

& Bioanalyzer Roche maestra de reparación final Mezcla Mezcla Mezcla