Method Article

TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma

DOI:

10.3791/58298

⸱

January 23rd, 2019

 ,  ,  , 
1RNA Biology Laboratory, RIKEN, 2RNA Systems Biochemistry Laboratory, RIKEN Cluster for Pioneering Research, 3Laboratory for Phyloinformatics, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 4RNA Biology Laboratory, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, 5Department of Computational Biology and Medical Sciences, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se describe un protocolo paso a paso para cromatina tándem inmunoprecipitación secuenciación (tChIP-Seq) que permite el análisis de modificaciones específicas del tipo de célula genoma histona.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regulación epigenética juega un papel central en la expresión génica. Puesto que la modificación de las histonas se descubrió en la década de 1960, sus funciones fisiológicas y patológicas se han estudiado ampliamente. De hecho, la llegada de próxima generación secuenciación profunda e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) mediante anticuerpos de modificación específica de la histona ha revolucionado nuestra visión de la regulación epigenética a través del genoma. Por el contrario, tejidos consisten en típicamente tipos celulares diferentes, y su mezcla compleja plantea desafíos analíticos a investigar el epigenoma en un tipo de célula particular. Para abordar el estado de cromatina tipo específico de célula en forma de genoma, recientemente desarrollamos tándem cromatina inmunoprecipitación secuenciación (tChIP-Seq), que se basa en la purificación selectiva de la cromatina por las proteínas de histona etiquetado núcleo de célula tipos de interés, seguido por ChIP-seq. El objetivo de este protocolo es la introducción de mejores prácticas de tChIP-SS. Esta técnica proporciona una herramienta versátil para la investigación de tejidos específicos epigenoma en modificaciones de las histonas diversas y organismos modelo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los tejidos de los animales consisten en tipos de células diferentes. La regulación del gene en cada célula define el tipo de célula. Modificaciones de la cromatina - ADN metilación e histona modificación - ser la base de la especificidad del tipo de la célula de la expresión génica. Así, la medición de la regulación epigenética en cada tipo de célula ha sido deseada, pero ha sido un desafío técnico.

Para investigar la epigenética en un tipo de célula particular, la secuencia de inmunoprecipitación de cromatina tándem (tChIP-Seq) fue recientemente desarrollado ()figura 1)1. En tChIP, proteína núcleo etiquetado del epítopo de histona H2B se expresa de un promotor de la célula-tipo-específico. Esta característica permite el aislamiento del chromatins de las células de interés, aunque el material comienza a partir de una mezcla de diversos tipos celulares. Siguiente ChIP-Seq, purificación de la cromatina a través de una marca de histonas modificadas y secuenciación profunda generación de aislado ADN, podemos monitorear el estado epigenético del tipo objetivo de la célula en forma de todo el genoma.

Usando esta técnica, hemos investigado recientemente la trimetilación de neurona-específica de la histona H3 proteína en lisina 4 (H3K4me3) marcas. En ese estudio, desarrollamos un ratón knock-in en que C-terminal H2B tagged bandera proteína se expresó sobre recombinación mediada por la Cre (Rosa26CAG floxed pA H2B-bandera). Por cruce con un ratón que poseen el gen Cre-endoplasmic del endoplásmico (ER) bajo el control del promotor CamK2a, la línea de ratón obtenidos induce H2B-bandera en neuronas activas sobre tamoxifeno inyección (Camk2aH2B-bandera)1. A partir de cerebro de la línea de ratón establecido, realizamos tChIP-Seq con anticuerpo anti-H3K4me3. Desde marcas H3K4me3 corresponden a menudo a regiones promotoras, podríamos descubrir cientos de mRNAs expresado específicamente en las neuronas1.

Aquí, describimos un método típico tChIP-Seq que cubre los pasos de la disección del tejido a la construcción de la biblioteca ()figura 1). El objetivo final de este protocolo es compartir nuestras mejores prácticas para la ejecución de tChIP-Seq y la futura aplicación de este método a otros tipos celulares y modificaciones de las histonas.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los métodos descritos han sido aprobados por la división de seguridad de RIKEN (H27-EP071) y llevado a cabo con reglamentos y directrices pertinentes.

1. disección del tejido

  1. Disecar los tejidos de interés en pequeños pedazos (aproximadamente < 3 mm2) con unas tijeras finas primavera.
    Nota: Fragmentos de tejidos más grandes tardan más tiempo en congelarse, y piezas más pequeñas se transportan a mayores volúmenes de buffer, que pueden afectar los resultados.
  2. Añadir los fragmentos de tejido disecado a un recipiente limpio llenado de nitrógeno líquido y recogerlas en tubos con 2 mL (1 pieza por tubo) lleno de nitrógeno líquido.
    Nota: Los tubos con una superficie hidrofílica se recomiendan para este paso.
  3. Colocar los tubos a-80 º C durante > 5 min con la tapa abierta para evaporar nitrógeno líquido restante.
    Nota: Después de cerrar la tapa, fragmentos de tejido pueden almacenarse a-80 ° C durante un mes antes de su uso.

2. fijación de la célula

Nota: Para este paso utilizamos un práctico molino criogénico. Puede utilizarse un aparato alternativo.

  1. Lugar los 2 mL-proteínas baja de Unión tubos con las muestras de tejido en un estante del hielo de metal enfriada en nitrógeno líquido.
  2. Coloque una bala de metal en un 1,5 mL-tubo y frío con nitrógeno líquido. Coloque en el estante del hielo de metal.
  3. Abrir el tubo de 2 mL y colocar la bala metal prechilled en el tubo. Cierre la tapa, coloque los tubos de 2 mL en el sostenedor del tubo de un práctico molino criogénico e inmediatamente sumerja el soporte del tubo montado en nitrógeno líquido durante 1 minuto.
  4. Inserte el soporte de tubo congelado en el casete externo del práctico molino criogénico y agite vigorosamente 60 veces durante 30 s.
  5. Desmontar el soporte del tubo, quitar la bala de metal y prechilled mL tubo lugar el 2 en una muestra de refrigerador a-20 ° C.
  6. Coloque la muestra en frío a-20 ° C por 15 min evitar la congelación de fijador en el paso siguiente.
  7. Traer la muestra más fresca en el Banco, abra la tapa del tubo y goteo inmediatamente 900 μl de formaldehído al 1% en él. Después de haber efectuado varias veces, transfiera la suspensión a nuevo 2 mL tubo con 900 μl de formaldehído al 1% y solución para 10 min. con rotación suave en una incubadora a 23 º C.
    PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico y nocivo.
  8. Para detener la reacción de fijación, añada 100 μl de glicina de 2,5 M a cada tubo y centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
  9. Añadir 1 mL de helado salina tamponada con fosfato (PBS), centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Repita este paso dos veces (3 lavados en total).
    Nota: Muestras fijadas pueden ser flash-congelado por nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C.
  10. Agregar 500 μl de tampón de lisis 1 (ácido de-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido 50 mM 4 (HEPES)-KOH (pH 7.5), 140 mM NaCl, 1 mM etilendiaminotetracético ácido (EDTA) (pH 8.0), w/v glicerol al de 10%, 0.5% w/v NP-40, inhibidor de la proteasa de 0.25% w/v Triton X-100 y 0.1 x cóctel) para la pelotilla, pipeta varias veces y rotar durante 10 min a 4 ° C.
    Nota: Tampón de lisis 1 debe ser filtrada y almacenada a 4 ° C antes de usar.
  11. Centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
  12. Añadir 1 mL de tampón de lisis 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 0,5 mM EGTA y 0.1 x inhibidor de la proteasa cóctel) para la pelotilla, vortex y rotar durante 10 min a 4 ° C.
    Nota: Tampón de lisis 2 debe ser filtrada y almacenada a 4 ° C antes de usar.
  13. Centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
  14. Añadir 800 μl de tampón de ensayo (RIPA) radioinmunoprecipitación con inhibidor de la proteasa de la 1 x cóctel a la pastilla y resuspender el precipitado mediante pipeteo.
  15. Centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
  16. Añadir 500 μl de tampón RIPA con 1 inhibidor de proteasa x cóctel.
  17. Centrifugar durante 5 min a 3.000 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
  18. Añadir 1 mL de tampón RIPA con 1 inhibidor de proteasa x cóctel. Proceder inmediatamente al siguiente paso.

3. cromatina de corte

  1. Transferir el lisado a un tubo del sonicador y coloque el tubo en un ultrasonicador.
  2. Distorsionar la cromatina con los siguientes valores: temperatura: 4 ° C; energía incidente máxima: 175 W; factor de servicio: 10%; ciclos/ráfaga: 200; y tiempo: 2.400 s.
  3. Transferir la muestra a un 1,5 mL-proteína vinculante bajo tubo y centrifugar durante 5 min a 20.000 x g a 4 ° C.
  4. Recoger el sobrenadante en un tubo nuevo de unión baja de proteína.
    Nota: La muestra puede ser flash-congeladas en nitrógeno líquido y almacenada a-80 ° C.

4. cheque de calidad de ADN (reticulación inversa)

  1. Mezcla 20 μl del lisado y 180 μl de tampón de elución de ChIP (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 300 mM de NaCl, 5 mM EDTA (pH 8.0) y 1% w/v sodio dodecil sulfato (SDS)) en un tubo de reacción en cadena (PCR) polimerasa. Incubar la muestra a 65 ° C en un termociclador durante 6 h con la tapa de Termociclador abierta. Mantenga la tapa del termociclador abierto para evitar excesiva desnaturalización.
    Nota: El tampón de elución de ChIP debe ser filtrado y almacenado a temperatura ambiente antes de usar. Esta incubación puede extenderse para toda la noche.
  2. Añadir 1 μl de 10 mg/mL Rnasa, vortex e incubar a 37 ° C durante 30 minutos.
  3. Añadir 6,5 μl de 15 mg/mL proteinasa K, vortex e incubar a 55 ° C durante 60 minutos.
  4. Transferencia de la reacción a un tubo de unión baja de ADN, añadir 4 μL de glucógeno de 5 mg/mL y agitar. Luego, añada 200 μL de fenol/cloroformo/isoamyl alcohol (25:24:1) y centrifugar durante 5 min a 18.000 x g a temperatura ambiente.
  5. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de baja obligatoria de ADN. Agregar 200 μL de tampón Tris-EDTA-NaCl (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8.0) y 200 mM NaCl) a la solución de fenol/cloroformo/isoamyl alcohol restante y centrifugar durante 5 min a 18.000 x g a temperatura ambiente. Recoger el sobrenadante y mezclar con el sobrenadante de la primera.
  6. Agregar 900 μl de etanol helada e incubar 1 h a-20 ° C.
    Nota: La incubación puede prolongarse hasta 4 - 6 h.
  7. Centrifugar por 30 min a 18.000 x g a 4 ° C.
  8. Deseche el sobrenadante. Añadir 1 mL de etanol 75% helada a la pelotilla y centrifugar por 30 min a 18.000 x g a 4 ° C. Repita este paso (dos lavados en total).
  9. Descartar cuidadosamente el sobrenadante y secar al aire durante 1 min a temperatura ambiente.
  10. Agregar 50 μl de tampón Tris-EDTA (TE) y disolver el ADN por incubar a temperatura ambiente durante 30 min o a 4 ° C durante la noche. Evite un vórtex o pipeteando. Mantenga este ADN como "entrada" y utilizar para la preparación de la biblioteca, si es necesario.
  11. Medir la concentración de ADN con un fluorómetro según las instrucciones del fabricante (véase tabla de materiales) y la distribución de tamaño con un equipo de electroforesis de microfluidos (ver datos representativos se muestra en la figura de 2A). uso 10 ng o menos ADN para este ensayo.
    Nota: Fragmentos de 100 a 500 pares de bases (bp) deben ser 50% o más de la DNA.

5. purificación de afinidad por los anticuerpos de anti-FLAG

Nota: Para la neurona tChIP-Seq, los tejidos del cerebro de 8 ratones se utilizan típicamente para una muestra de tChIP-Seq para preparar 2 ng de DNA purificado por tándem inmune-purificación (ver paso 7.1). En nuestras manos, 0,1 ng de DNA todavía proporcionado alta calidad bibliotecas de ADN para ChIP-Seq (peores, inédito). Así, en teoría, un ratón puede ser suficiente para llevar a cabo la neurona tChIP-SS. La cantidad necesaria debe ser optimizada para el tipo de tejidos y células de interés. Para el control negativo del experimento de imumuno-purificación, lisado de ratones sin ninguna expresión de H2B-bandera de tejido cerebral debe ser preparado y utilizado.

  1. Pipetee 200 μL de las bolas magnéticas conjugado con inmunoglobulinas de anti-ratón ovejas G (IgG) en un tubo de unión baja a proteínas.
  2. Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere 1 minuto para el sobrenadante a quedado claro. Eliminar el sobrenadante, agregar 1 mL de PBS helado y vortex. Repita este paso (dos lavados en total).
  3. Añadir 20 μl del anticuerpo de anti-FLAG 1 mg/mL y rotarla durante 5 h a 4 ° C.
    Nota: Esta incubación puede extenderse para toda la noche.
  4. Lavar los granos tras paso 5.2. Coloque los granos en un tubo de 15 mL.
  5. Resuspender los granos en 1110 μl de tampón de RIPA y luego agregar 900 μl de 10 x bloqueo reactivo 180 μl de 50 x solución de Denhardt, 10 μl de 100 x inhibidor de la proteasa cóctel y 6,8 mL de lisado elaborado en el paso 3. Dividir esta mezcla en 5 tubos de unión baja de proteína. Gire durante 6 h a 4 ° C.
    Nota: Esta incubación puede extenderse para toda la noche.
  6. Coloque el tubo en el soporte magnético y espere 1 minuto para el sobrenadante a quedado claro. Eliminar el sobrenadante, agregar 1 mL de tampón RIPA y mezclar suavemente. Repita este paso 5 veces (6 lavados en total). Piscina, todos los granos en un tubo de unión baja proteína sola.
  7. Añadir 200 μL de tampón de elución de ChIP y gire durante 15 min a temperatura ambiente. Comprobar la calidad del ADN como se describe en el paso 4.11 (ver datos representativos que se muestra en la figura 2B y C). Proceder inmediatamente al siguiente paso.

6. afinidad purificación por anticuerpos Anti-H3K4me3 y reticulación inversa

Nota: El siguiente grano preparación que pasos (6.1-6.4) deben realizarse antes de paso 5.7.

  1. Pipeta de 40 μl de bolas magnéticas conjugado anti-ratón ovejas IgG en un tubo de 2 mL-proteínas de unión baja.
  2. Coloque el tubo en el soporte magnético y espere 1 minuto para el sobrenadante a quedado claro. Eliminar el sobrenadante, agregar 1 mL de PBS helado y mezclar suavemente. Repita este paso (dos lavados en total).
  3. Añadir 4 μL del anticuerpo anti-H3K4me3 de 1 mg/mL y rotarla durante 6 h a 4 ° C.
  4. Lavar los granos tras paso 6.2. Coloque los granos en un tubo de 2 mL-proteínas de unión baja.
  5. Suspender los granos en 1558 μl de tampón de RIPA y luego añadir 200 μL de 10 x bloqueo reactivo, 40 μl de 50 x solución de Denhardt, 2 μl de 100 x inhibidor de la proteasa cóctel y 200 μL de eluido en paso 5.7. Gire durante la noche a 4 ° C.
    Nota: El SDS en el tampón de elución de la viruta se diluyó más de 10 veces en la incubación.
  6. Coloque el tubo en el soporte magnético y espere 1 minuto para el sobrenadante a quedado claro. Eliminar el sobrenadante, agregar 1 mL de tampón RIPA y mezclar suavemente. Repetir este paso 4 veces (5 lavados en total). Después del último lavado, transferencia de los granos en un tubo de unión baja de ADN y descarte el sobrenadante.
  7. Añadir 200 μL de tampón de elución de ChIP y gire durante 15 min a temperatura ambiente. Transferir el efluente a un nuevo bindingTube baja de la DNA.
    Nota: El efluente puede ser almacenado a-80 ° C.
  8. Siga el paso 4 para decrosslinking de la DNA. Resuspender el DNA purificado en 20 μl de tampón TE.
  9. Comprobar la calidad del ADN como se describe en el paso 4.11 (ver datos representativos que se muestra en la Figura 2D). (opcional) Realizar análisis de enriquecimiento por PCR cuantitativa como se describió anteriormente2. Diez veces o mayor enriquecimiento debe ser observado.

7. Biblioteca construcción

  1. Para cada entrada y ChIP DNA muestra, calcular la proporción de DNA en la región de 100-500-bp usando la función de análisis del borrón de transferencia del software de la máquina de electroforesis de microfluidos. Estimar el volumen de muestra requerido para obtener 2 ng de 100 – 500 bp DNA. Utilice 20 ng de ADN en el rango de 100 – 500-bp como muestra "entrada".
  2. Pipetear las muestras de ADN en tiras de 8 tubos PCR y agregar H2O para llevar el volumen total a 10 μl. (opcional) si el volumen de ADN excede 10 μl, escalado proporcionalmente la siguiente reacción de reparación final y la selección de tamaño.
  3. Preparar mezcla master final-reparación (véase Tabla de materiales). Añadir 4 μL de la mezcla principal final de reparación del ADN e incubar 30 min a 20 ° C.
  4. Añadir 36 μl de 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 y 0,6 x volumen (30 μL) del sólido fase granos magnéticos inmovilización reversible (SPRI) e incube durante 5 min a temperatura ambiente.
  5. Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere hasta que el sobrenadante sea claro.
  6. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, añadir 1,2 volúmenes de x (60 μL) de granos magnéticos de SPRI e incubar 5 min a temperatura ambiente.
  7. Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere hasta que el sobrenadante sea claro.
  8. Lavar los granos dos veces con 200 μL de 80% EtOH, sujetando el tubo en el imán.
  9. Centrifugar brevemente el tubo para recoger el EtOH residual en la parte inferior y coloque en el imán. Extraiga cuidadosamente el EtOH residual.
  10. Deje la tapa de tubo abierta durante 1-2 minutos permitir que el EtOH se evapore.
  11. Cierre la tapa y mantenga el tubo en hielo.
    Nota: Ahora han obtenido ADN seleccionado de tamaño de 100-500 bp en los granos. Pueden encontrar más detalles acerca de la selección de tamaño doble en la web del fabricante (www.beckman.com).
  12. Preparar A tizón master mix (véase Tabla de materiales).
  13. Resuspender los granos (de paso 7.10) con 10 μl de la mezcla principal A tizón e incubar 30 min a 30 ° C.
  14. Añadir volumen x 1.8 (18 μL) de polietilenglicol (PEG) / solución de NaCl e incubar 5 min a temperatura ambiente.
  15. Siga los pasos 7.7-7.11 para purificar el DNA.
  16. Preparar mezcla de tampón de ligadura (véase Tabla de materiales).
  17. Pipeta 8 μl de mezcla de tampón de ligadura en los granos (de paso 7.14), añadir 1 μl de adaptador de 1 μm y suspender las cuentas. Use 1 μl de adaptador μm 5 para la muestra de entrada. Considere el uso de adaptadores diferentes para cada muestra de multiplexación.
  18. Añadir 1 μl de ADN ligasa e incubar por 15 min a 20 ° C.
  19. Añadir 1,0 x volumen (10 μl) de solución de PEG/NaCl, suspender los granos e incubar 5 min a temperatura ambiente.
  20. Siga los pasos 7.7 7.10 para purificar el DNA.
  21. Pipetear 25 μl de 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 en el tubo y resuspender los granos.
  22. Añadir 1,0 x volumen (25 μl) de solución de PEG/NaCl e incubar 5 min a temperatura ambiente.
  23. Siga los pasos 7.7 7.10 para purificar el DNA.
  24. Pipeta de 11 μl de 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 en el tubo y resuspender los granos.
  25. Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere hasta que el sobrenadante sea claro.
  26. Recoger el sobrenadante en un tubo PCR de nuevo 8-tira.
  27. Preparar la mezcla principal de PCR en tiempo real (ver materiales para más detalles).
  28. Pipetee 8,5 μl de mezcla principal en tiempo real de PCR en una placa PCR (qPCR) 384-bien cuantitativa y añadir 1,5 μl del adaptador ligarse DNA (de paso 7,26).
  29. Pipetear 10 μl de cada norma fluorescente en los pocillos vacíos.
  30. Realizar PCR en tiempo real con el siguiente programa: (98 ° C por 45 s) x 1 ciclo, (98 ° C por 15 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C por 30 s) x 20 ciclos, y (72 ° C durante 60 s) x 1 ciclo.
  31. Determinar el número de ciclos PCR necesarios para alcanzar la intensidad de fluorescencia de los fluorescentes estándar 2.
  32. Preparar al maestro de la PCR (véase Tabla de materiales) de la mezcla.
  33. Pipetee 11.5 μl de la mezcla principal de PCR en el restante ADN ligada adaptador (de paso 7,26) y realizar la PCR como se indica en el paso de las 7: 30 con los ciclos PCR en paso 7.31.
  34. Añadir 1,0 x volumen (20 μl) de solución de PEG/NaCl e incubar 5 min a temperatura ambiente.
  35. Siga los pasos 7.7 7.10 para purificar el DNA.
  36. Pipetear 20 μl de 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 en el tubo y resuspender los granos.
  37. Coloque el tubo sobre un soporte magnético y espere hasta que el sobrenadante sea claro.
  38. Recoger el sobrenadante en un tubo de 1,5 mL-DNA obligatorio bajo nuevo.
  39. Compruebe la calidad de la biblioteca como se describe en el paso 4.11 (ver datos representativos que se muestra en la Figura 2E y F). Use 1 μl de la muestra de ADN de la biblioteca. (opcional) Realizar análisis de enriquecimiento por qPCR como se describió anteriormente 2. Diez veces o mayor enriquecimiento debe ser observado.

8. la secuencia

  1. Las bibliotecas en un secuenciador de última generación de la secuencia (ver datos representativos se muestra en la figura 3).
    Nota: La profundidad de secuencia suficiente para el análisis de datos variará dependiendo del tamaño del genoma del organismo3. Para el ser humano y ratón, se recomienda obtener al menos 20 millones de solo-fin Lee. Según la producción de Lee, multiplexación puede ser rentable.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, describimos la disección del tejido, fijación, lisis celular, purificación del tándem de cromatina y preparación de biblioteca de DNA para secuenciadores de última generación. Durante los procedimientos, uno puede probar la calidad de la DNA, que es la clave para la secuencia del éxito, en varios pasos (figura 2). Puesto que un nucleosoma solo es rodeada típicamente por 147 bp DNA 4, esquilado ADN no debe ser menor que el tamaño....

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nuestro protocolo se ha optimizado para las neuronas del cerebro de ratón, en el que la expresión de tagged bandera H2B es inducida por inyección de tamoxifeno. Promotores para expresión H2B, partida materiales de tejido y la cantidad de los tejidos son parámetros fundamentales para éxito tChIP-SS. Por lo tanto, la optimización de estos factores debe considerarse para cada tipo de célula de interés.

Un paso fundamental entre los procedimientos utilizados en el presente Protocolo es el ADN de c...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a todos los miembros del laboratorio de Iwasaki para lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras (26113005 # S.N. y JP17H05679 a S.I.); subvenciones para jóvenes científicos (A) (JP17H04998 a S.I.) del Ministerio de educación, ciencia, deportes y cultura de Japón (MEXT); y la pionera proyectos "Evolución celular" y todos los proyectos RIKEN "Enfermedad y epigenoma" de RIKEN (a MATR y S.I.).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubo LoBind de proteínas, 2 mLEppendorfNo.  0030108132Para lisis celular
Tubo LoBind de proteínas, 1,5 mLNº Eppendorf 0030108116Para ChIP y preparación de bibliotecas
Tubo LoBind de ADN, 1,5 mLNº Eppendorfnbsp; 0030108051Para ChIP y preparación
de bibliotecas Tubo de PCR de 8 tirasBIO-BIK3247-00Para ChIP y preparación de bibliotecas
SK MillTOKKENSK-200Práctico molinillo criogénico para hacer polvo de células para la fijación
Bala de metalTOKKENSK-100-DLC10Accesorio de SK Mill
Tubo de acero inoxidable de 2 mLTOKKENTK-AM5-SUSUna opción para la célula lisis
2 mL soporte de tubo de acero inoxidableTOKKENSK-100-TLUna opción para la lisis celular
16% formaldehído (p/v), sin metanolPierce28906Para fijar células. Prepare la solución al 1% antes de usar.
GlicinaNacalai Tesque17109-35Preparar 2,5 M de stock
D-PBS (-)(1x)Nacalai Tesque14249-24Para el lavado de lisado y ADN purificado
HEPESNacalai Tesque02443-05Para tampón de lisis 1. Preparar 1 M, pH 7,5 caldo.
5 M NaCl, grado de biología molecularNacalai Tesque06900-14para tampón de lisis 1, tampón de lisis 2, tampón de elución ChIP y tampón Tris-EDTA-NaCl
0,5 M EDTA, grado de biología molecularWako Pure Chemical Industries, Ltd.311-90075Para tampón de lisis 1, tampón de lisis 2, tampón de elución ChIP y tampón Tris-EDTA-NaCl
glicerolWako Pure Chemical Industries, Ltd.072-04945Para tampón de lisis 1
NP-40Nacalai Tesque25223-75Para tampón de lisis 1
Triton X-100, grado de biología molecularNacalai Tesque12967-32Para tampón de lisis 1
TrisNacalai Tesque35406-91Para tampón de lisis 2, tampón de elución ChIP y tampón Tris-EDTA-NaCl. Prepare caldo de 1 M, pH 8.0.
0.1 M EGTA pH neutroNacalai Tesque08947-35Para tampón de lisis 2
Cóctel de inhibidores de proteasa (100x)Nacalai Tesque25955-24Para bloquear la degradación de proteínas
Tampón RIPAThermo Fisher Scientific89900Para lisis celular y lavado
milliTUBE 1 mL AFA FiberCovaris520130Tubo sonicador. Accesorio de ultrasonido enfocado
ultrasonido enfocadoCovarisS220 o E220Para digerir el ADN en el tamaño adecuado para ChIP-Seq
UltraPure 10% SDSThermo Fisher Scientific15553-027para ChIP Tampón de elución
RNasa ANacalai Tesque30141-14Para purificar el ADN del lisado
Proteinasa K, recombinante, Grado PCRSigma-Aldrich3115887001Para purificar el ADN del etanol lisado
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.054-07225Hacer una solución al 70%
Anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 producido en ratónSigma-AldrichF1804Para purificar la cromatina expresada en células de interés
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgGThermo Fisher Scientific11201DEsto se puede utilizar para anti-FLAG IP y anti-H3K4me3 IP
Anti-tri-metilhistona H3 (K4), anticuerpo monoclonal de ratónWako Pure Chemical Industries, Ltd.301-34811Cualquier otro anticuerpo que funcione para el análisis de ChIP funcionará
10x Reactivo de bloqueoSigma-Aldrich11096176001 Para el bloqueo durante la purificación por afinidad
Denhardt' s soluciónNacalai Tesque10727-74Para el bloqueo durante la purificación por afinidad
Glucógeno (5 mg/ml)Thermo Fisher ScientificAM9510Para purificar ADN a partir de lisado
Qubit 2.0 FluorímetroThermo Fisher ScientificQ32866Para la cuantificación de ADN aislado
Qubit dsDNA HS Assay Kit ThermoFisher ScientificQ32851Para la cuantificación de ADN aislado
Tubo de 0,5 mLAxygen10011-830Para cuantificación por Qubit
Fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1)Nacalai Tesque25970-56Para purificar el ADN del lisado
Cuentas AMPure XPBeckman CoulterA63881SPRI perlas magnéticas para la preparación de bibliotecas
Cubitera metálicaFunakoshiIR-1Para mantener congelado el lisado celular
Enfriadorde muestras New England BiolabsT7771SAyuda a reparar las células con un daño mínimo
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BAPara comprobar la calidad de los fragmentos de ADN aislados. Se puede utilizar otro analizador de fragmentos.
Bioanalyzer 2100 Expert SoftwareAgilent TechnologiesG2946CAsuministra con el kit de
ADN de alta sensibilidadAgilent Technologies5067-4626Para comprobar la calidad de los fragmentos de ADN aislados
KAPA LTP Library Preparation Kit07961898001Se suministra con 10 tampones de reparación de extremos KAPA, mezcla de enzimas de reparación de extremos KAPA, tampón de cola A de KAPA, enzima de cola KAPA, tampón de ligadura de KAPA, ligasa de ADN KAPA y solución de PEG / NaCl
Códigos de barras de ADN NEXTflex AdaptadorBIOO ScientificNOVA-514101para la preparación de bibliotecas. Se suministra con adaptadores de código de barras DNA y mezcla de cebador.
Kit de amplificación de biblioteca en tiempo real KAPARoche 07959028001suministrado con 2 mezclas maestras de PCR en tiempo real KAPA HiFi HS, mezcla de cebadores de PCR y estándares fluorescentes
2 KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKM2602para la preparación de bibliotecas. Además, esta enzima puede ser necesaria para el kit de amplificación de biblioteca en tiempo real KAPA
Tampón EBQiagen1908610 mM Tris-Cl, pH 8,5 para la elución de ADN
Placa qPCR de 386 pocillosThermo Fisher Scientific4309849para PCR en tiempo real
QuantStudio 7 Flex Sistema de PCR en tiempo realThermo Fisher Scientific4485701Para cuantificar
la película adhesiva óptica MicroAmp de ADNThermo Fisher Scientific4311971Para PCR en tiempo real
MicroAmp Película adhesiva transparenteThermo Fisher Scientific4306311para el sellado de placas
MezclaCombine 1.4 µ L de 10x Tampón de reparación de extremos KAPA, 1 µ L de KAPA End Repair Enzyme Mix, y 1.6 µ L de H2O
maestra A-talingCombine 1 µ L de tampón de relaves KAPA A, 0,6 y micro; L de la enzima de cola KAPA A, y 8.4 µ L de H2O
tampón de ligaduraCombine 2 µ L de tampón de ligadura KAPA y 6 µ L de H2O
maestra de PCR en tiempo realCombine 5 µ L de 2x KAPA HiFi HS PCR en tiempo real Master Mix, 0.35 y micro; L de mezcla de cebadores para PCR (10 y micro; M cada uno de los cebadores delanteros AATGATACGGCGACCACCGAG y cebadores inversos (CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), y 3.15 µ L de H2O
PCR master mixCombine 10 µ L de 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 y micro; L de mezcla de cebadores PCR, y 0,6 y micro; L de H2
O Visor de Genómica IntegrativaBroad InstituteIGV_2.3.88Navegador de genoma para visualizar datos de secuenciación
Oligionucleótido de ADN: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′Eurofins GenomicsUn cebador para amplificar la región promotora del
olgionucleótido de ADN GAPDH: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′Eurofins GenomicsUn cebador para amplificar la región promotora de GAPDH
SYBR Premix Ex TaqTakaraRR420LPara cuantificar el ADN correspondiente a la región promotora de GADPH
Termociclador DiceTakaraTP870Para cuantificar el ADN correspondiente a la región promotora de GADPH
& Bioanalyzer Roche maestra de reparación final Mezcla Mezcla Mezcla

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mito, M., et al. Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing. Scientific Reports. 8 (1), 1143(2018).
  2. Kadota, M., et al. CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution. Scientific Reports. 7 (1), 4957(2017).
  3. Jung, Y. L., et al. Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).
  4. Becker, P. B., Workman, J. L. Nucleosome remodeling and epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905(2013).
  5. Kidder, B. L., Zhao, K. Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).
  6. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645(2012).
  7. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  8. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  9. Hornstein, N., et al. Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain. Genome Biology. 17 (1), 149(2016).
  10. Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064(2015).
  11. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).

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