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Artículo de método

Purificación de proteínas anaerobias y análisis cinético mediante electrodo de oxígeno para el estudio de la inhibición y la actividad de DesB dioxigenasa

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DOI:

10.3791/58307

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3 de octubre de 2018

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1Department of Chemistry, Wesleyan University

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo de purificación de proteínas anaerobias, anaerobias proteína concentración y posterior caracterización cinética mediante un sistema de electrodo de oxígeno. El método se ilustra utilizando la enzima DesB, una enzima dioxigenasa que es más estable y activo cuando purificada y almacenada en un medio ambiente anaeróbico.

Resumen

Proteínas sensibles al oxígeno, como las enzimas que utilizan oxígeno como sustrato, pueden han reducido la estabilidad cuando se purificaron usando métodos tradicionales de depuración aerobia. Este manuscrito muestra los detalles técnicos involucrados en el proceso de depuración anaerobio, incluyendo la preparación de buffers y reactivos, los métodos para cromatografía en columna en una caja de guante y la desalación de la proteína antes de la cinética. También se describe son los métodos para la preparación y uso de un electrodo de oxígeno para realizar la caracterización cinética de una enzima utilizando oxígeno. Estos métodos se ilustran mediante la enzima dioxigenasa DesB, una dioxigenasa galato de la bacteria de cepa de SP Sphingobium SYK-6.

Introducción

Las enzimas que utilizan el hierro u otros metales para activar el oxígeno son a menudo susceptibles a la inactivación durante el proceso de purificación debido a su retiro del ambiente reduciendo de una célula. Por lo tanto, estas proteínas deben utilizarse como lysates de la célula, ser sometidas a agentes reductores externos o purificadas anaeróbicamente para asegurarse que tengan una óptima actividad enzimática1,2,3,4. Para las enzimas que son sensibles al oxígeno (específicamente hierro-que contienen enzimas), realizando todos los pasos de purificación y caracterización manteniendo condiciones anaerobias es necesario caracterizarlas totalmente. Esto ha llevado a investigadores a desarrollar montajes de laboratorio todo dentro de los límites de cámaras anaeróbicas para estudios de expresión de la proteína a través Cristalografía5,6,7,8 .

Adjunto, Divulgamos los métodos para la depuración anaeróbica y caracterización cinética de la enzima DesB mediante un sistema de electrodo de oxígeno. DesB es una dioxigenasa galato de la bacteria de cepa de SP Sphingobium SYK-6 que está relacionado con la LigAB, un protocatecuate dioxygenase del mismo organismo. Ambas enzimas pertenecen a la superfamilia tipo II protocatechuate dioxigenasa (PCAL) que no ha sido extensamente estudiada a la fecha9, probablemente en parte debido a las enzimas de esta superfamilia es susceptible a la inactivación cuando se purificaron usando estándar aeróbico métodos de purificación de proteínas. Puesto que algunas de las enzimas de PCAL Mostrar promiscuidad de sustrato, mientras que otros son específicos del sustrato2,10, mayor caracterización de esta superfamilia es necesario identificar determinantes de especificidad. Como se ha observado en varias enzimas superfamilias11,12,13,14,15, pequeñas moléculas pueden alterar la actividad mediante inhibición competitiva directa o la Unión de moléculas a separar bolsillos alostéricos que causa un aumento o disminución de la actividad enzimática16. Mientras que la cinética solamente no puede distinguir la situación de la Unión de un modulador, determinar la magnitud de un cambio de actividad es importante para la comprensión de los efectos. Como tales, los métodos para la caracterización cinética de la actividad de DesB nativa y su actividad en presencia de 4-nitrocatechol (4NC), un compuesto utilizado para caracterizar e inhibir dioxygenase enzimas2,17, 18, se muestran.

DesB es capaz de romper galato, un aromático lignina derivado compuesto mediante una reacción de extradiol dioxigenasa (EDO) en que anillo de apertura es catalizada utilizando oxígeno como uno de los sustratos10,19. Esta reacción enzimática se produce en el contexto de la descomposición de la lignina, un CASET aromático encontrado en la pared celular de las plantas. Lignina puede ser despolimerizada, produciendo una variedad de compuestos aromáticos puede además dividirse en metabolitos central3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) cataliza un reacción de compuestos aromáticos dihydroxylated, donde se produce la hendidura adyacente a un diol coordinado de metal; la abertura del anillo en cambio, intradiol dioxygenases cleave análogos compuestos aromáticos entre los dos grupos hidroxilo (figura 1). EDOs, como muchas otras metaloenzimas, tienen un centro metálico divalente de coordinación fe (II) compuesto por una dos-histidina, uno-carboxylate tríada9,34,35. Estos metaloenzimas ser oxidados, a través de autoxidación o basadas en el mecanismo de inactivación, mientras que la enzima se hace inactivo2,36,37,38.

En los procedimientos experimentales descritos en este manuscrito, utilizamos DesB, un miembro de la superfamilia del PCAL de la bacteria Sphingobium SP., SYK-6, catalizan la adición de oxígeno a través de los bonos de C4-C5 de galato (figura 2A). La regioquímica de este escote es análogo a LigAB, que es un protocatechuate-4,5-dioxigenasa (figura 2B). Hasta el momento, las investigaciones de este dioxygenase galato incluyen ningunos informes de compuestos que inhiben la DesB10,19,39. Con el uso de métodos de depuración aerobia, DesB exhibió actividad variable, mientras que con el uso de métodos anaerobios pudimos obtener constantemente proteínas con actividad reproducible. Los estudios cinéticos descritos aquí muestran los métodos de depuración anaerobia de DesB, caracterización cinética de la reacción de DesB con saúco y la inhibición de DesB por 4-nitrocatechol (4NC).

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Protocolo

1. Generalidades los materiales y métodos

  1. Preparar todos los medios necesarios como se describe en la tabla 1. Autoclave a 120 ° c durante 15 minutos estéril filtrar la solución SOC, después de la adición de MgCl2 y glucosa, haciéndola pasar por un filtro de 0.2 μm. Ajustar el pH de la solución de caldo de lisogenia (media libra) de Miller antes de autoclavar. Complementar la solución de los medios de comunicación de LB-Amp después de autoclavar soluciones estériles de 0,2 mM de L-cisteína, luego 0,1 mM amonio Sulfato ferroso para mejorar la solubilidad y la expresión de la proteína.
  2. Preparar el Tampón Laemmli y corriente buffer para electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) como se describe en la tabla 2. Ajustar el pH de las soluciones (con 1 M de HCl y Tris base para la preparación de buffer) antes de diluir los componentes para sus volúmenes finales.
  3. Preparar los buffers para la purificación de la proteína como se describe en la tabla 3. Ajustar el pH de las soluciones (con 1 M de HCl y Tris base para la preparación de buffer) antes de diluir los componentes para sus volúmenes finales.
  4. Transferencia de los buffers dispuestos a una botella que puede ser sellada con un tapón de goma 1 orificio y que contiene un tubo de vidrio.
    1. Use una manguera para conectar el tubo de vidrio en el tapón a una fuente de vacío. Deje que la solución de desgasifica bajo presión negativa para aproximadamente 30 min agitación a velocidad media.
    2. Romper el sello primero, y luego apague la aspiradora de vacío. A continuación, perfore a través del tapón de goma con dos agujas de 20G (una que es suficiente para llegar a la parte inferior de la botella y una aguja más corta que puede ser utilizada como un ducto de escape de gas). Burbuja en un flujo continuo de nitrógeno agitación a velocidad media durante 30 minutos.
    3. Retire las agujas y repita la desgasificación y burbujeante en nitrógeno para un total de tres ciclos. Cuando haya terminado, selle correctamente la botella con un tapón de goma sólida. Fijar el obturador con la película de parafina y alambre de cobre (20G) y colocarlos en la guantera.
      Nota: Todos los materiales se colocan en la guantera y sometidos a 3 ciclos de purga de la antecámara, seguida de aspirar oxígeno y llenado con nitrógeno. Buffers utilizados para la purificación y concentración pueden ser capsuladas y almacenados indefinidamente en la guantera.
  5. Preparar la solución dithionate de sodio disolviendo aproximadamente una espátula (0,31 "x 2", el extremo más pequeño de una espátula de acero inoxidable de micro cónica doble) de dithionate de sodio en aproximadamente 1 mL de agua desgasificada en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL . Sellar el tubo con la película de parafina antes de sacarlo de la caja de guante.
    Nota: Guarde el dithionate de sodio sólido en la guantera para evitar la oxidación.

2. preparación de la columna de amilosa para purificación de proteínas

  1. Hacer una mezcla de resina de alto flujo amilosa (15 mL) combinada con 5 volúmenes de columna (75 mL) de tampón de la columna de amilosa. Transferir la mezcla de resina en dos botellas de suero de 50 mL y cada botella con una membrana de goma del sello. Perfore un 20G, aguja de 305 mm a través de los septos y nitrógeno de la burbuja en la mezcla durante aproximadamente 1 minuto extraer oxígeno de la suspensión. Transferencia de la resina y la solución que contiene la proteína en la guantera.
  2. En la guantera, vierta la resina en una columna de borosilicato de 2 x 30 cm con una simple llave de paso, permitiendo a la resina para asentarse y crear una cama nivel. Vaciar el búfer de columna y equilibrar la columna con 3 volúmenes de columna (total de ~ 30 mL) de tampón de la columna de amilosa desgasificada con gas nitrógeno a presión para empujar el tampón a través de la resina en aproximadamente 1 gota/s o 5 mL/min, hasta que el solvente es justo por encima de la cama de resina.
    Nota: Después de la proteína es eluted (ver paso 3.5 más abajo), la resina de la columna de amilosa es regenerada por lavado con el volumen de la 1 columna (10 mL) de agua, luego volumen 1 columna de dodecil sulfato de sodio al 1% (SDS) y finalmente, 3 volúmenes de columna (30 mL) de agua. Este paso puede completarse fuera de la caja de guante. La resina de la columna se almacena a 4 ° C en 20% de etanol y se puede regenerar hasta 5 veces.

3. proteína expresión y purificación anaerobio de DesB

Nota: El gen DesB fue sintetizado comercialmente, que han colocado en pET-15b, pET-32a y pMAL-c5x vectores usando la restricción NdeI y BamHI sitios de clonación.

  1. Completar los análisis de expresión de proteína según las instrucciones del fabricante para determinar las condiciones adecuadas para la expresión de gran escala (se describe brevemente a continuación).
    1. Transformar la plásmidos que contienen DesB comercialmente hechos, químicamente competentes de e. coli BL21 (DE3) células, según las instrucciones del fabricante. En Resumen, descongelar las células en hielo durante 10 min, añadir aproximadamente de 10-50 ng de ADN plásmido a la mezcla de la célula, shock térmico las células a 42 ° C por 10 s e incubar en hielo por un adicional 5 min medios SOC añadir para obtener un volumen final de 1 mL y permitir la células a temblar (~ 200 rpm) a 37 ° C durante 60 minutos. Una placa de LB-Amp, agregar y difundir 100 μl de la solución de la célula e incubar durante una noche a 37 ° C.
    2. Seleccionar una sola unidad formadora de colonias de la placa después de la incubación durante la noche y esta colonia para inocular 10 mL de medio LB-Amp. Crecen las células durante la noche, con agitación (~ 200 rpm) a 37 ° C.
    3. 10 mL de medio, añada 100 μl de la solución de crecimiento durante la noche y sacuda los nuevos medios tal como se describe en el paso 3.1.2 a 37 ° C. Cuando la densidad óptica a 600 nm (OD600) está entre 0.4-0.8, añadir isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) para obtener una concentración de la solución final de 1 mM.
    4. Inmediatamente retire una alícuota de 1 mL de la solución y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con etiqueta tiempo = 0 horas. Girar el tubo a 15.000 x g durante 10 minutos para que sedimenten las células. Después del centrifugado, quite el sobrenadante y almacenar las células a 4 ° C.
    5. Retirar alícuotas adicionales (1 mL) a intervalos de tiempo después de la adición de IPTG (normalmente en 5, 10, 12, 18 y 24 h). Como se describe en el paso 3.1.4, cada tubo de centrífuga, decante el sobrenadante y almacenar las células a 4 ° C.
    6. Una vez que todas las porciones se obtienen, resuspender las células de cada punto en 30 μl de solución de extracción de proteína bacteriana, les incube a temperatura ambiente durante 10-15 minutos y centrifugar los tubos a 15.000 × g por 5 min separar el soluble e insoluble proteínas.
    7. Transferir la solución de la proteína soluble a un tubo nuevo de microcentrífuga y resuspender los gránulos insolubles restantes con 30 μl de solución de extracción de proteína bacteriana.
    8. 30 μl de cada solución (soluciones solubles e insolubles para cada punto) se combinan con un volumen igual de buffer Laemmli, entonces visualizar en un gel de SDS-PAGE40. Seleccione las condiciones correspondientes a las rutas que contienen las bandas de tamaño correcto en la fracción soluble para expresión de proteínas a gran escala y purificación.
      Nota: Puesto que la proteína soluble mínima inicialmente fue generada usando las condiciones anteriores, varios complementos fueron agregados para probar efectos sobre la expresión de la proteína soluble, 0,2 mM de L-cisteína y sulfato ferroso de amonio 0,1 mM mostrando mayor proteína expresión. Según esta pantalla de expresión de la proteína, un vector de expresión apropiado para la producción de soluble de DesB era vector pMAL-c5x.
  2. Después de la transformación en Escherichia coli BL21 (DE3), hacer un balance de DesB/pMal-c5x mediante la combinación 900 μl de cultivo bacteriano (crecida durante la noche con agitación a 200 rpm y 37 ° C) con 100 μl de glicerol al 80%. Almacenar el stock a-80 ° C en un tubo criogénico.
    Nota: Hacer un nuevo caldo congelado aproximadamente cada 6-8 meses.
  3. Utilizar una pipeta para raspar las células de la acción congelada y empezar un cultivo bacteriano, aumentando durante la noche en 5 mL de medio LB-Amp a 37 ° C con agitación. Inocular el 1.5 litros de media libra-Amp en un matraz de 2 L a 37 ° C y 200 rpm, mediante el cultivo bacteriano crecido durante la noche.
    Nota: Debido a la sensibilidad observada de la proteína al oxígeno, se encontró ese espacio reducido en el frasco y velocidades proteína mejor rendimiento para la expresión a gran escala de agitación moderada.
  4. Inducir la expresión de la proteína cuando la densidad óptica a 600 nm (OD600) está entre 0.4-0.8 con 1 mM IPTG y suplementado con 0.2 mM L-cisteína y 0,1 mM sulfato ferroso amónico. Bajar la temperatura de incubación a 30 ° C y agitar a 200 rpm. Desactivación de las células mediante centrifugación después de la inducción después de 24 h a 4.700 x g durante 10 minutos y desechar el medio gastado.
  5. Resuspender el precipitado de células en 20 mL de tampón de columna de amilosa por cada 1,5 L de crecimiento, seguido por la adición de 1 mg de lisozima. Agitar durante 20 minutos en hielo.
    Nota: Más tampón puede añadirse si la solución es muy viscosa, como proteína de soluciones que son demasiado viscosas pueden interrumpir el paso siguiente de la homogeneización.
  6. Lisar la solución celular resuspendido mediante homogeneización de alta presión con pases de 3-5 a aproximadamente 15.000 psi. Transferencia de la proteína a un tubo de centrífuga de 50 mL y lavar los espacios vacíos con nitrógeno durante 1 minuto. Luego, centrifugar el lisado a 20.000 x g durante 40 minutos eliminar los residuos insolubles de la célula.
    Nota: Éxito de homogeneización hace la proteína micelas forma fluye a través del tubo y en el frasco de colección, y la solución aparece como un color gris-marrón translúcido. Mantener la proteína homogeneizada en hielo durante todo el proceso.
  7. Después de la centrifugación, transferencia el sobrenadante en un tubo de 50 mL (más de uno puede que sea necesario), cerrar el tubo con una membrana de goma y con una aguja de calibre 20, lentamente la burbuja nitrógeno gaseoso a través de la solución por 2 min desplazar oxígeno. Envuelva el tabique con la película de parafina y asegurar con el alambre de cobre y traer el sobrenadante en la guantera junto con los materiales de la columna.
  8. Equilibrar la columna (ver paso 2.3) y la proteína sobrenadante a la columna de la carga. Recoge el flujo a través en fracciones de 5 mL bajo nitrógeno a presión moderada (1 gota por segundo o unos 5 mL/min). A continuación, lavar la columna mediante otra columna 3 volúmenes de amortiguador de columna de amilosa y manualmente recoger fracciones de 3 mL en tubos de ensayo de vidrio bajo nitrógeno a presión moderada (aproximadamente 5 mL/min). Eluir la proteína utilizando 5 volúmenes de columna (50 mL) de tampón de elución y manualmente recoger fracciones de 3 mL bajo presión moderada de nitrógeno (aproximadamente 5 mL/min).
    Nota: Las fracciones también se pueden recoger mediante filtración de gravedad. Aproximadamente 12 fracciones elución deben ser recogidas.
  9. Recoger 30 alícuotas de μl de fracciones y quitarlos de la caja de guante para permitir la visualización de la proteína que contiene fracciones mediante análisis de SDS-PAGE.
    Nota: Las fracciones recogidas permanecen en la caja de guante para la duración de esta prueba. DesB purificada normalmente elutes de la columna en fracciones de 3 a 5.

4. anaerobio proteína concentración tampón intercambio

  1. Monte el concentrador a presión, revuelto de la célula con un filtro de membrana de celulosa reconstituida de 76 mm (corte 10 kDa). Añadir una cantidad suficiente de etanol al 20% en el concentrador de oxígeno para mantener la membrana mojada como se transfiere el concentrador montado en la guantera.
    Nota: Asegúrese de que no sin lágrimas en la membrana y que la junta tórica no está arrugada.
  2. Después de traer el concentrador celda agitada en la guantera, la solución de etanol apagado la membrana con agua de lavado. La tapa y presionar la celda agitada para limpiar la tubería y la membrana de cualquier exceso de agua.
  3. Añadir todas las fracciones que contienen proteína según lo determinado por SDS-PAGE (figura 3) al concentrador. Añadir el tampón de intercambio suficiente para obtener 150 mL de volumen de solución de proteína total.
  4. Presurizar la cámara de agitación celular utilizando una línea externa de2 N y concentrado de la proteína a 50 mL con agitación a velocidad moderada.
    Nota: Lograr una concentración de 50 mL toma aproximadamente 20 minutos.
  5. Completar 100 mL de tampón de intercambio con 0,1 mM Ditiotreitol (DTT) y sulfato ferroso de amonio 0,1 mM, añadir la solución a la celda agitada y concentrado de la proteína para un volumen total de 50 mL con una moderada velocidad de agitación.
  6. Después de que la solución alcance un volumen de 50 mL, agregar en el búfer de intercambio completada una vez más, pero concentrar la solución hasta un volumen total de 10 mL con agitación a velocidad moderada.
  7. Filtro de la proteína concentrada utilizando un 0,45 μm filtro de la jeringuilla de tamaño de poro y alícuota en tubos de reacción en cadena (pcr) de polimerasa individuales de 0,2 mL (cada uno contiene aproximadamente 150 μL de la solución de la proteína). Quitar las alícuotas tapa de la guantera e inmediatamente flash congelarlas con nitrógeno líquido. Almacenar las alícuotas a-80 ° C.

5. desalación DesB

  1. Enjuague la bolsa de guante con gas de nitrógeno de aproximadamente 1,5 horas antes de su uso.
  2. Descongelar una alícuota de 150 μL de proteínas purificadas de DesB dentro de la bolsa de guante en el hielo.
  3. Mientras que la proteína se descongela, preparar una pequeña gravedad, columna que contiene 3 mL de gel gruesa de desalación Sephadex G-25, en una columna de borosilicato de 9 mL de la desalación. Lavar la columna con 2 volúmenes de columna (~ 6 mL) de desgasificado buffer del desalt.
    Nota: Cambie el gel de desalación cuando hay un cambio en el gel de color de blanco a amarillo (después de aproximadamente 7 aplicaciones).
  4. El DesB descongelada a la columna mediante un proceso controlado por la gravedad de la carga. Deseche el flujo a través. Eluir la proteína con aproximadamente 5 mL de tampón de la desalación.
    Nota: La presión del tanque de gas continuamente llenando la bolsa de guante afectará la tasa a la que las soluciones del goteo de la columna.
  5. Para la determinación inicial de elución de la proteína de la columna, recoge 12 frascos/elutions (contiene 3 gotas por frasco). Sellado con un septum de goma, quitar de la bolsa de guante y prueba para la presencia de la proteína ya sea directamente (a través del análisis del gel de SDS-PAGE) o indirectamente (a través de examen de la actividad de cada fracción).
    Nota: Por lo general, las fracciones se prueban individualmente para la actividad, como se describe en el paso 7.1, con la mayor actividad corresponde a la fracción con mayor concentración de proteína activa. DesB elutes generalmente a partir de la caída de 7, después de lo cual se recogen las siguientes 9 gotas de proteína desalada. Alícuotas de proteínas se almacenan en el hielo durante las mediciones de cinética (pasos 7.1-7.4).

6. preparar el electrodo de oxígeno

  1. Pulir el anillo de plata ánodo y cátodo de platino con electrodo limpiador y un q-tip humedecido hasta que no hay signos visibles de depósitos de óxido negro.
  2. Con las tijeras, corta aproximadamente un cuadrado de 1.5 pulgadas de espaciador de papel (o papel de balanceo del cigarrillo, que funciona así). Luego, corte 1) triángulos en cada cara de la Plaza y 2) ranuras en las esquinas para facilitar el embalaje del electrodo.
  3. Añadir 5 gotas de una solución de KCl 50% en el ánodo de plata del surco y unirlos para formar un anillo continuo de solución. Añadir 2 gotas de la solución de KCl 50% a la parte superior del electrodo de platino. Cuidadosamente coloca el papel separador en la parte superior del electrodo de platino y suavizar el papel separador, por lo que no hay burbujas de aire.
    Nota: Tenga cuidado para evitar rasgar el papel separador.
  4. Cortar un trozo de la membrana PTFE (politetrafluoetileno) de 30m de S4 que es de aproximadamente 2 pulgadas de largo y colóquela sobre el papel separador. Corte los bordes de la membrana para que estén alineados con el aro exterior del electrodo.
  5. Con el aplicador de anillo o, pulse la pequeña junta tórica sobre el electrodo para asegurar al espaciador de papel y membrana en el electrodo. Coloque el O-ring más grande en la ranura circular del electrodo, haya no hay membrana debajo de ella. Deslice la cámara superior del electrodo en la base y enroscar los dos juntos.
    Nota: Los dos se atornillan en correctamente si no palo de burbujas de aire a los lados de la cámara.
  6. Coloque el electrodo montado en su base y conecte el electrodo para el sistema de vigilancia. Iniciar el programa de control de electrodo y calibrar el electrodo realizando el protocolo de calibración de fase líquida (Figura 4A). La variable de temperatura debe ser la temperatura de la habitación en la que se realiza el experimento, y la variable de la presión ambiente es dependiente en la región y las condiciones actuales del tiempo.
    Nota: La presión ambiente puede obtenerse un informe del tiempo para la región.
  7. Añadir 1 mL de tampón de Tris 25 mM a la cámara del electrodo, inserte el émbolo, comenzar la calibración de una solución saturada de oxígeno y ajustar la velocidad del agitador a 100. Después de que el electrodo se estabiliza, el punto de ajuste de calibración para el oxígeno se determina la solución saturada (Figura 4B).
  8. Sin quitar el émbolo, use una jeringa de aguja y 1 mL de 1.2 x 40 mm para inyectar aproximadamente 1 mL de solución de Ditionito de sodio en la cámara, teniendo cuidado de evitar la adición de burbujas de aire (figura 4). Use un tapón de caucho para sellar la cámara del electrodo inmediatamente después de la adición de Ditionito de sodio.
  9. Permite la calibración continuar hasta que todo el oxígeno se utiliza y se completa el programa y guardar la calibración (figura 4). Aspirar la solución de la cámara y enjuague el pistón y la cámara con agua desionizada 5 - 6 veces para asegurar el retiro completo del Ditionito de sodio. Cuando enjuague, use un tubo de plástico equipado con una punta de pipeta conectada a un termo de brazo lateral. Evitar dañar la membrana.

7. cinéticos ensayos usando el electrodo de oxígeno

  1. Identificar las alícuotas desaladas que contengan proteína activa en pruebas en serie de 1 μl de solución enzimática para la actividad en una solución de tampón Tris 25 mM, pH 7,5 y que contiene 100 μm galato. Use el aliquot(s) con la mayor actividad observada para los experimentos restantes. (Ver paso 5.5.1)
  2. Determine la velocidad de la reacción enzimática, midiendo el consumo de O2 con una O2-electrodo de Clark-tipo sensible con integración de equipo a través de la unidad de control del electrodo.
    1. Para cada dato de la cinética del punto medición de DesB, añadir 1 mL de tampón de Tris 25 mM (pH 7.5) a la cámara del electrodo. Añadir un volumen calculado de una solución 25 mM de saúco al buffer Tris para lograr la concentración del substrato final deseado (0.05-25 mM).
      Nota: Preparar soluciones frescas de saúco y compuestos inhibitorios con agua todos los días y ajustar el pH a 7.5 con la adición de 0,1 mM NaOH, si es necesario.
    2. Después de 10 s de agitación para permitir la mezcla de la solución, sellar la cámara con el émbolo lentamente y atornille la parte superior. Puede utilizarse un paño limpio para absorber el exceso de líquido que es desplazado de la cámara. Permita que el electrodo se equilibren donde puede producir una medida estable de la concentración de oxígeno en la solución durante al menos 1 minuto antes de proceder a la adición de la enzima (fondo O2 consumo tasa de ± 0.5 μm/min).
    3. Utilizando una jeringa de μl 10 tight gas, añadir aproximadamente 1 μl de enzima (aproximadamente 3-7 μm enzima) a la cámara del electrodo por el émbolo.
      Nota: La cantidad de enzima puede aumentar o disminuir en respuesta a la actividad observada de la alícuota específica para permitir velocidades de reacción suficiente.
    4. Calcular la velocidad de reacción basada en la cuesta de los primeros 30 s de datos lineales después de la adición del enzima y correcto para el fondo usando el 30 el consumo de O2 s de datos inmediatamente antes de la adición de la enzima. El tipo de catálisis es igual a la tasa de consumo de O2 (figura 5A).
    5. Después de la recolección de los datos de velocidad para una concentración dada de substrato, vaciar la cámara de electrodos mediante aspiración mediante el uso de un tubo de plástico conectado a un frasco de vacío de brazo lateral y enjuague repetidamente con agua durante 4-6 ciclos. Configurar la solución en el electrodo como se describe en paso 7.2.1 usando una concentración de sustrato nuevo.
    6. Variar las concentraciones de sustrato en forma desordenada y replicar a lo largo del experimento para tener en cuenta las disminuciones en la actividad enzimática con el tiempo (figura 5B).
      Nota: Cuando se replica de una concentración específica se ejecuta y demuestra más que una disminución de 30% de tasa en comparación con un anterior ejecución, ningún análisis adicionales deben realizarse con ese lote de enzima. Por lo general, después de 30-40 funcionamientos, la enzima muestra una disminución de 30% en la actividad.
    7. Determinar los parámetros cinéticos kcat (la constante catalítica para la conversión de sustrato a producto) y Km (la constante de Michaelis, operacionalmente se define como la concentración de sustrato en el que la tasa inicial es la mitad de la velocidad máxima), por un ajuste de mínimos cuadrados de los datos de cada una de las concentraciones de sustrato a la ecuación de Michaelis−Menten (figura 6) mediante GraphPad Prism.
  3. Añadir 4-nitrocatechol (4NC) para probar sus efectos sobre la cinética de dioxygenation y determinar la constante de inhibición (K) con DesB. Para cada condición de reacción, acción soluciones de Tris (50 mM), galato de (25 mM) y 4NC (25 mM) se combinan y diluido con agua para producir una solución de 2 mL de tampón de Tris 25 mM (pH 7.5) con galato de 1 mM y variando las concentraciones de 4NC. El volumen de 4NC fue variado para lograr la concentración de inhibidor final deseado (0.05-20 mM).
    1. Después de 10 segundos de agitación para permitir la mezcla de la solución, coloque el émbolo en la cámara lentamente y atornille la parte superior. Puede utilizarse un paño limpio para absorber el exceso de líquido que es desplazado de la cámara. Permita que el electrodo equilibrar y producir una medición estable de la concentración de oxígeno en la solución durante al menos 1 minuto antes de proceder a la adición de la enzima (fondo O2 consumo tasa de ± 0.5 μm/min).
    2. Como se describió anteriormente, agregar la proteína (paso 7.2.3), determinar la velocidad de reacción (paso 7.2.4) y restablecer el electrodo para la siguiente condición.
    3. Como parte de esta serie de experimentos, determinan la velocidad de la reacción en ausencia de inhibidor varias veces. Determinar la inhibición por la normalización de las tasas de consumo de oxígeno en presencia de diferentes concentraciones de inhibidor con sustrato de 1 mM y ausencia de inhibidor (v/vo).
    4. Ajuste la inhibición de la dioxygenation galato a ecuación 7.3A y, a continuación, los datos de inhibición a ecuación 7.3B usando un programa de graficación (figura 7).
  4. Determinar la concentración de enzima precisa para cada experimento mediante la realización de un ensayo de Bradford después de la terminación de todas las ejecuciones de cinéticas.
    Nota: Todas las tarifas fueron corregidas para la concentración de enzima. Este paso no es necesario hacerlo en una caja de guante o bolsa de guante.

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Resultados

Es el análisis del gel de SDS-PAGE de fracciones individuales de la purificación de la construcción de fusión DesB-maltosa vinculante proteínas (MBP) (figura 3). El gel revela que la proteína es pura (MW = 91.22 kDa), excepto por la presencia de DesB (MW = 49.22 kDa) y el dominio de la proteína MBP (42 kDa) divididos unos de otros. Fracciones E2 y E3 fueron seleccionados para la concentración (paso 4.2).

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Discusión

Los pasos críticos en la obtención de proteína activa purificada DesB implican la formación y el mantenimiento de la reducción fe (II) activo en la enzima. Como tal, correcto funcionamiento de la inducción, purificación, concentración y desalación pasos son esenciales para obtener con éxito la enzima activa. Inducir la expresión de la proteína en presencia de sulfato de amonio ferroso 1 mM asegura que el fe (II) se incorpora correctamente en el sitio activo de DesB. Este método está inspirado en estudios como los metaloe...

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Divulgaciones

Los autores tienen ninguna competencia intereses financieros u otros conflictos de intereses.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Dr. Camille Keller de la Universidad de Wesleyan por soporte técnico. Agradecimiento especial a profesor Lindsay D. Eltis y Jenna K. Capyk de la Universidad de Columbia Británica, así como Christian Whitman de la Universidad de Texas en Austin, por su asesoramiento sobre métodos de purificación de la proteína anaerobia y el uso de una O2 -electrodo sensible.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Isopropilo β-D-1-tiogalactopiranodisidaOro Bio TechnologiesI2481C50
Coomassie Azul Brillante R-250Bio-Rad161-0400
Persulfato de amonioBio-Rad161-0700
30% AcrilamidaBio-Rad161-0158
N,N'tetrametil-etilendiaminaBio-Rad161-0801
Resina de amilosa de alto flujoNew England BiolabsE8022S
BL21 (DE3) células competentes de Escherichia coliNew England BiolabsC2527I
L-cisteínaSigma AldrichC7352
ácido gálicoSigma AldrichG7384
4-nitrocatecolSigma AldrichN15553
Ferroso sulfato de amonioMallinckrodt5064
Ditionito de sodioAlfa Aesar33381-22
Wheaton Botellas de sueroFisher Scientific06-406G
25 mm Acrodisc PF Filtro de jeringa con membrana SuporPall Corportation4187
400 mL Amicon Concentrador de células agitadasEMD MilliporeUFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa corte filtro de membrana de celulosa reconstituidaEMD MilliporePLGC07610
DL-dithiothreitolGold Bio TechnologiesDTT50
Sephadex G-25 columna de gal desalinizante gruesoGE Healthcare17-0033-01
mL Viales con tapa engarzada Unidad deFisher Scientific03-391-38
OxygraphPlusHansatech InstrumentsOXYG1 Plus
Cámara de electrodo de oxígenoHansatech InstrumentsDW1
Disco de electrodoHansatech InstrumentsS1
PTFE (0,0125 mmX25mm) Carrete de 30 m KitHansatech InstrumentsS4
Hansatech InstrumentsS16
Papel espaciadorZig Zagdisponible en cualquier gasolinera
Guantera Dri-Lab de la serie He, empresa de aspiración/atmósferas
HE-493 Dri-Trainaspiración/atmósferas
espátula de acero inoxidable microcónica de doble extremoFisher Scientific21-401-10
DWK Ciencias de la vida Kimble Kontes Columna flexible Columna económicaFisher Scientifick420400-1530
10 μ L, modelo 701 N SYR, cementado NDL 26s GA, 2 pulgadas, jeringa de punto Stlye 2Hamilton80300
DWK Ciencias de la vida Kimble Kontes Flex Column EconomyColumn Fisher ScientificK420401-1505
Emulsiflex-C5 homogeneizador de alta presiónAvestin
B-PER Reactivo completo de extracción de proteínas bacterianasThermo Fisher Scientific89821
Lisozima de clara de huevo de gallinaSigma Aldrich12650-88-3
Dodecil sulfato de sodioThermo Fisher Scientific151-21-3
ampicilinaSigma Aldrich7177-48-2
TriptonaFisher ScientificBP-1421-500
Extracto de levaduraFisher ScientificBP1422-2
Cloruro desodioFisher ScientificS271-10
Cloruro de potasioFisher ScientificP217-3
Cloruro de magnesioFisher ScientificM33-500
DextrosaFisher ScientificD16-3
Hidróxido de sodioFisher ScientificS318-1
Clorhidrato de TrisFisher ScientificBP153-500
MaltosaFisher ScientificBP684-500
GlicinaFisher ScientificG46-500
2 control de electrodos de limpieza de electrodos ,, empresa de ,

Referencias

  1. Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
  2. Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Biochemistry. 52 (38), 6724-6736 (2013).
  3. Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (3), 607-614 (2014).
  4. Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521 (1), 10-17 (2012).
  5. Tsai, C. -L., Tainer, J. A. Methods in Enzymology. David, S. S. 599, Academic Press. 157-196 (2018).
  6. Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5 (11), e15491(2010).
  7. Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61 (5), 482-485 (2005).
  8. Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133 (5), 789-800 (2008).
  9. Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
  10. Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9 (3), e92249(2014).
  11. Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
  12. Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13 (5), 684-685 (2005).
  13. Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32 (3), 469(1973).
  14. Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. Biochemistry. 49 (12), 2647-2656 (2010).
  15. Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23 (1), 20-23 (1997).
  16. Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
  17. Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8 (3), 263-272 (2003).
  18. Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250 (5), 1765-1770 (1975).
  19. Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187 (15), 5067-5074 (2005).
  20. Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10 (1), 106(2015).
  21. Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
  22. Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28 (12), 1883-1896 (2011).
  23. Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83 (18), (2017).
  24. de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
  25. Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
  26. Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48 (20), 12454-12463 (2014).
  27. Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4 (1), 29-38 (2009).
  28. Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
  29. Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12 (1), 71(2017).
  30. Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84 (4), (2018).
  31. Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6 (1), 1(2013).
  32. Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), E5802-E5811 (2016).
  33. Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7 (1), 8420(2017).
  34. Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 87-93 (2005).
  35. Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 644-649 (2008).
  36. Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. Biochemistry. 50, 8899-8913 (2011).
  37. Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17 (8), 817-826 (1998).
  38. Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 2019-2027 (2002).
  39. Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65 (11), 1171-1174 (2009).
  40. Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6 (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
  41. Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. Biochemistry. 54 (18), 2919-2930 (2015).
  42. Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 826-836 (2016).
  43. Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. Biochemistry. 53 (28), 4727-4738 (2014).
  44. Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333 (1), 233-242 (1996).
  45. Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
  46. Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265 (11), 6301-6311 (1990).
  47. Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135 (6), 721-730 (2004).
  48. Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273 (52), 34887-34895 (1998).
  49. Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
  50. Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4414-4426 (1993).

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