Aquí presentamos un protocolo de purificación de proteínas anaerobias, anaerobias proteína concentración y posterior caracterización cinética mediante un sistema de electrodo de oxígeno. El método se ilustra utilizando la enzima DesB, una enzima dioxigenasa que es más estable y activo cuando purificada y almacenada en un medio ambiente anaeróbico.
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Artículo de método
Purificación de proteínas anaerobias y análisis cinético mediante electrodo de oxígeno para el estudio de la inhibición y la actividad de DesB dioxigenasa
En este artículo
Resumen
Resumen
Proteínas sensibles al oxígeno, como las enzimas que utilizan oxígeno como sustrato, pueden han reducido la estabilidad cuando se purificaron usando métodos tradicionales de depuración aerobia. Este manuscrito muestra los detalles técnicos involucrados en el proceso de depuración anaerobio, incluyendo la preparación de buffers y reactivos, los métodos para cromatografía en columna en una caja de guante y la desalación de la proteína antes de la cinética. También se describe son los métodos para la preparación y uso de un electrodo de oxígeno para realizar la caracterización cinética de una enzima utilizando oxígeno. Estos métodos se ilustran mediante la enzima dioxigenasa DesB, una dioxigenasa galato de la bacteria de cepa de SP Sphingobium SYK-6.
Introducción
Las enzimas que utilizan el hierro u otros metales para activar el oxígeno son a menudo susceptibles a la inactivación durante el proceso de purificación debido a su retiro del ambiente reduciendo de una célula. Por lo tanto, estas proteínas deben utilizarse como lysates de la célula, ser sometidas a agentes reductores externos o purificadas anaeróbicamente para asegurarse que tengan una óptima actividad enzimática1,2,3,4. Para las enzimas que son sensibles al oxígeno (específicamente hierro-que contienen enzimas), realizando todos los pasos....
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Protocolo
1. Generalidades los materiales y métodos
- Preparar todos los medios necesarios como se describe en la tabla 1. Autoclave a 120 ° c durante 15 minutos estéril filtrar la solución SOC, después de la adición de MgCl2 y glucosa, haciéndola pasar por un filtro de 0.2 μm. Ajustar el pH de la solución de caldo de lisogenia (media libra) de Miller antes de autoclavar. Complementar la solución de los medios de comunicación de LB-Amp después de autoclavar soluciones estériles de 0,2 mM de L-cisteína, luego 0,1 mM amonio Sulfato ferroso para mejorar la solubilidad y la expresión de la proteína.
- Preparar el Tampón Laemmli y corrient....
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Resultados
Es el análisis del gel de SDS-PAGE de fracciones individuales de la purificación de la construcción de fusión DesB-maltosa vinculante proteínas (MBP) (figura 3). El gel revela que la proteína es pura (MW = 91.22 kDa), excepto por la presencia de DesB (MW = 49.22 kDa) y el dominio de la proteína MBP (42 kDa) divididos unos de otros. Fracciones E2 y E3 fueron seleccionados para la concentración (paso 4.2).
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Discusión
Los pasos críticos en la obtención de proteína activa purificada DesB implican la formación y el mantenimiento de la reducción fe (II) activo en la enzima. Como tal, correcto funcionamiento de la inducción, purificación, concentración y desalación pasos son esenciales para obtener con éxito la enzima activa. Inducir la expresión de la proteína en presencia de sulfato de amonio ferroso 1 mM asegura que el fe (II) se incorpora correctamente en el sitio activo de DesB. Este método está inspirado en estudios como los metaloe.......
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Divulgaciones
Los autores tienen ninguna competencia intereses financieros u otros conflictos de intereses.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Dr. Camille Keller de la Universidad de Wesleyan por soporte técnico. Agradecimiento especial a profesor Lindsay D. Eltis y Jenna K. Capyk de la Universidad de Columbia Británica, así como Christian Whitman de la Universidad de Texas en Austin, por su asesoramiento sobre métodos de purificación de la proteína anaerobia y el uso de una O2 -electrodo sensible.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Isopropilo β-D-1-tiogalactopiranodisida | Oro Bio Technologies | I2481C50 | |
| Coomassie Azul Brillante R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
| Persulfato de amonio | Bio-Rad | 161-0700 | |
| 30% Acrilamida | Bio-Rad | 161-0158 | |
| N,N'tetrametil-etilendiamina | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Resina de amilosa de alto flujo | New England Biolabs | E8022S | |
| BL21 (DE3) células competentes de Escherichia coli | New England Biolabs | C2527I | |
| L-cisteína | Sigma Aldrich | C7352 | |
| ácido gálico | Sigma Aldrich | G7384 | |
| 4-nitrocatecol | Sigma Aldrich | N15553 | |
| Ferroso sulfato de amonio | Mallinckrodt | 5064 | |
| Ditionito de sodio | Alfa Aesar | 33381-22 | |
| Wheaton Botellas de suero | Fisher Scientific | 06-406G | |
| 25 mm Acrodisc PF Filtro de jeringa con membrana Supor | Pall Corportation | 4187 | |
| 400 mL Amicon Concentrador de células agitadas | EMD Millipore | UFSC40001 | |
| 76 mm Millipore Ultracel 10 kDa corte filtro de membrana de celulosa reconstituida | EMD Millipore | PLGC07610 | |
| DL-dithiothreitol | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
| Sephadex G-25 columna de gal desalinizante grueso | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
| mL Viales con tapa engarzada Unidad de | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
| Oxygraph | PlusHansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
| Cámara de electrodo de oxígeno | Hansatech Instruments | DW1 | |
| Disco de electrodo | Hansatech Instruments | S1 | |
| PTFE (0,0125 mmX25mm) Carrete de 30 m Kit | Hansatech Instruments | S4 | |
| Hansatech Instruments | S16 | ||
| Papel espaciador | Zig Zag | disponible en cualquier gasolinera | |
| Guantera Dri-Lab de la serie He | , empresa de aspiración/atmósferas | ||
| HE-493 Dri-Train | aspiración/atmósferas | ||
| espátula de acero inoxidable microcónica de doble extremo | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| DWK Ciencias de la vida Kimble Kontes Columna flexible Columna económica | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
| 10 μ L, modelo 701 N SYR, cementado NDL 26s GA, 2 pulgadas, jeringa de punto Stlye 2 | Hamilton | 80300 | |
| DWK Ciencias de la vida Kimble Kontes Flex Column Economy | Column Fisher Scientific | K420401-1505 | |
| Emulsiflex-C5 homogeneizador de alta presión | Avestin | ||
| B-PER Reactivo completo de extracción de proteínas bacterianas | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
| Lisozima de clara de huevo de gallina | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
| Dodecil sulfato de sodio | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
| ampicilina | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
| Triptona | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
| Extracto de levadura | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Cloruro de | sodioFisher Scientific | S271-10 | |
| Cloruro de potasio | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Cloruro de magnesio | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Dextrosa | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Hidróxido de sodio | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Clorhidrato de Tris | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Maltosa | Fisher Scientific | BP684-500 | |
| Glicina | Fisher Scientific | G46-500 |
Referencias
- Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
- Barry, K. P., Taylor, E. A.
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Reimpresiones y permisos
