Aislamiento de las vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar murino utilizando una técnica de centrifugación ultrafiltración

Resumen

Aquí, describimos a dos protocolos de aislamiento de vesículas extracelulares, ultrafiltración centrifugación y ultracentrifugación con centrifugación gradiente de densidad, para aislar las vesículas extracelulares de muestras de líquidos de lavado broncoalveolar murino. Las vesículas extracelulares derivadas del líquido de lavado broncoalveolar murino por ambos métodos se cuantifica y caracteriza.

Resumen

Las vesículas extracelulares (EVs) son recién descubiertos componentes subcelulares que desempeñan papeles importantes en muchos biológico funciones de señalización durante los Estados fisiológicos y patológicos. El aislamiento de los vehículos eléctricos continúa siendo un desafío importante en este campo, debido a las limitaciones intrínsecas a cada técnica. La ultracentrifugación diferencial con el método de centrifugación del gradiente de densidad es un enfoque utilizado y se considera que el procedimiento estándar de oro para el aislamiento de EV. Sin embargo, este procedimiento requiere mucho tiempo, mano de obra intensiva y generalmente resulta en baja escalabilidad, que puede no ser adecuado para muestras de pequeño volumen como el lavado broncoalveolar. Demostramos que un método de aislamiento de centrifugación ultrafiltración es simple y tiempo y mano de obra eficiente todavía proporciona un rendimiento de alta recuperación y pureza. Proponemos que este método de aislamiento podría ser una alternativa adecuada para el aislamiento de EV, particularmente para pequeño volumen de especímenes biológicos.

Introducción

Exosomas son el subconjunto más pequeño de los vehículos eléctricos, 50-200 nm de diámetro y tienen múltiples funciones biológicas a través de una amplia gama de señalización de procesos^1,2,3,4,5. Gobiernan la homeostasis celular y el tejido sobre todo facilitando la comunicación intercelular a través de moléculas de carga tales como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos^6,7,8,9 . ....

Protocolo

La utilización de animales y animales todos los procedimientos fueron aprobados por el cuidado de Animal institucionales y comités del uso (IACUC) en el centro médico Cedars-Sinai (CSMC).

1. preparación y murino el lavado broncoalveolar (BALF) de líquido colección

1. Colección de BALF
   1. Eutanasia a ratones con un cóctel de ketamina (300 mg/kg) y xilacina (30 mg/kg) vía intraperitoneal seguido por dislocación cervical.
   2. Inserte un angiocatéter de 22 G en la tráquea. Conecte una jeringa de insulina 1 ml (mL) de fosfato buffer salino de helado Dulbecco estéril (DPBS) e infundir 1 mL de SPD en ambos pulmones a través del ....

Resultados

Realizamos aislamiento de EV de ratón BALF utilizando métodos de aislamiento de UFC y UC-DGC en el mismo día. El método UFC requiere aproximadamente 2.5-3 h, mientras que la técnica de la UC-DGC requiere 8 horas de tiempo de procesamiento. Esto no incluye los amortiguadores y los reactivo tiempo de preparación. Cabe señalar que algunas de las tareas pueden realizarse en los períodos de tiempo de centrifugación. Sin embargo, todo el procedimiento duró casi un día entero para la técnica de .......

Discusión

En las últimas décadas, los científicos han desentrañando los significados de EVs en la homeostasis celular. Más importante aún, EVs desempeñan un papel importante en muchos procesos de la enfermedad mediante la modulación de las células vecinas y distantes a través de sus bioactivos carga moléculas^{1,21,22,26,27 , 28 ,}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Material
Amicon Filtros centrífugos Ultra-15 Ultracel-100K	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	UFC910024
salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)	Corning Cellgro, Manassas, VA	21-031-CV
Sacarosa	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	EMD8550
HEPES	Productos de investigación Internacional, Prospecto, IL	75277-39-3
EDTA	Corning Cellgro, Manassas, VA	46-034-CI
Cloruro de sodio	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	S3014-1KG
OptiPrep	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	MKCD9753	Medio de gradiente de densidad
Ketamina	VetOne, Boise, ID	13985-702-10
Xilacina	Akorn Animal Health, Lake Forest, IL	59399-110-20
Jeringa 1 mL	BD Jeringa, Franklin Lakes, NJ	309656
Angiocatéter 20 G	Jeringa BD, Franklin Lakes, NJ	381703
Tubos de centrífuga 15 mL	VWR, Radnor, PA	89039-666
Tubos de centrífuga 50 mL	Corning Cellgro, Manassas, VA	430828
Ensayo de proteínas de ácido bicinchónico (BCA)	Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL	23235
Anticuerpo TSG101 anti-ratón para conejos	AbCam, Cambridge, MA	AB125011
Anticuerpo PE-CD63 anti-ratón para ratas	Biolegend, San Diego, CA	143904
CD81
CD9
IgG anti-conejo, anticuerpo ligado a HRP	Tecnología de señalización celular, Danvers, MA	7074S
4x LDS
10x Agente reductor (Bolt)
10x Tampón de lisis (Bolt)	Tecnología de señalización celular, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus gel de acrilamida	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	NW04120
iBlot 2 Mini pilas de nitrocelulosa	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	IB23002
Reactivo de detección de anticuerpos HRP quimioluminiscente HyGLO	Denville Scientific, Holliston, MA	E2400
Tubos de ultracentrífuga 17 mL	Beckman Coulter, Pasadena, CA	337986
Tubos de ultracentrífuga 38,5 mL	Beckman Coulter, Pasadena, CA	326823
Filtros de jeringa Corning SFCA 0.2 y micro; m pore	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	09-754-13
Equipment
			concentración de partículas
MACSQuant Analyzer 10 citómetro de flujo	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania-iBlot	de
transferencia	Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad
ChemiDoc MP Imaging System	Bio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10			Software de análisis

solución Centrifuge Eppendorf, Hamburgo, Alemania-Ultracentrífuga Beckman Coulter, Pasadena, CA-Nanosight (NS300)Malvern, Worcestershire, Reino Unido-Para medir la distribución del tamaño de partícula y Aparato