Aislamiento de las vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar murino utilizando una técnica de centrifugación ultrafiltración

Exosomas son el subconjunto más pequeño de los vehículos eléctricos, 50-200 nm de diámetro y tienen múltiples funciones biológicas a través de una amplia gama de señalización de procesos^1,2,3,4,5. Gobiernan la homeostasis celular y el tejido sobre todo facilitando la comunicación intercelular a través de moléculas de carga tales como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos^6,7,8,9 . Un paso crítico en la investigación EV es el proceso de aislamiento. Ultracentrifugación diferencial (UC), con o sin centrifugación de gradiente de densidad (DGC), se considera el enfoque de patrón oro, pero este método tiene limitaciones importantes, incluidos los porcentajes de recuperación de EV ineficientes y escalabilidad baja^{10 , 11 , 12}, restringir su mejor utilización para muestras de volumen más grandes, tales como muestras de la célula cultura exosomas sobrenadante o alta producción. Las ventajas y desventajas de otros métodos, como la exclusión del tamaño por ultrafiltración o cromatografía de inmunoafinidad aislamiento por granos o columnas y microfluídica, están bien descritas, y se han desarrollado modernos procedimientos suplementarios para superar y minimizar limitaciones técnicas en cada enfoque^{11,12,13,14,15}. Otros han demostrado que una centrifugación ultrafiltración (UFC) con una membrana nanoporosa en la unidad de filtración es una técnica alternativa que proporciona pureza comparable a una UC método^16,17,18. Esta técnica podría considerarse como uno de los métodos de aislamiento alternativos.

Lavado broncoalveolar (BALF) contiene EVs que poseen numerosas funciones biológicas en diferentes afecciones respiratorias^19,20,21,22. Estudio de EVs BALF derivados conlleva algunos problemas debido a la invasividad del procedimiento de broncoscopia en los seres humanos, así como una cantidad limitada de recuperación de líquido de lavado. En animales de laboratorio pequeños tales como ratones, sólo unos pocos mililitros pueden recuperarse en afecciones pulmonares normales, mucho menos en los pulmones inflamados o fibrótica²³. Por lo tanto, recoger una cantidad suficiente de BALF para aislamiento de EV por una ultracentrifugación diferencial para aplicaciones posteriores puede no ser factible. Sin embargo, aislando poblaciones EV correcto es un factor crucial para el estudio de las funciones biológicas de la EV. El delicado equilibrio entre la eficiencia y eficacia continúa siendo un desafío en métodos de aislamiento de EV bien establecidos.

En este estudio, demostramos que un enfoque de ultrafiltración centrífugo, utilizando una unidad de filtro del 100 kDa peso molecular (MWCO) de corte nanomembrane, es conveniente para pequeño volumen de muestra biológica como BALF. Esta técnica es simple, eficaz y proporciona escalabilidad para apoyar el estudio de los vehículos eléctricos derivados de BALF y alta pureza.

La utilización de animales y animales todos los procedimientos fueron aprobados por el cuidado de Animal institucionales y comités del uso (IACUC) en el centro médico Cedars-Sinai (CSMC).

1. preparación y murino el lavado broncoalveolar (BALF) de líquido colección

1. Colección de BALF
   1. Eutanasia a ratones con un cóctel de ketamina (300 mg/kg) y xilacina (30 mg/kg) vía intraperitoneal seguido por dislocación cervical.
   2. Inserte un angiocatéter de 22 G en la tráquea. Conecte una jeringa de insulina 1 ml (mL) de fosfato buffer salino de helado Dulbecco estéril (DPBS) e infundir 1 mL de SPD en ambos pulmones a través del angiocatéter.
   3. Retire lentamente el émbolo de la jeringa para recuperar BALF y dispensar el BALF en un tubo cónico de 50 mL. Mantenga el BALF en hielo.
   4. Repita los pasos 1.1.2 y 1.1.3 3 x (4 en total en cada ratón).
      Nota: Aproximadamente 0,8 mL es obtenido generalmente por mililitro de la instilación. También, pueden realizar los siguientes pasos para ratones individuales (es decir, 3 mL de BALF) y agrupación de múltiples muestras BALF permitirá el aislamiento de un lote mayor de EVs para la consistencia en experimentos posteriores.
2. Preparación de BALF
   1. BALF de la piscina de 25 ratones y dividirla en dos grupos iguales (~ 35 mL por alícuota).
   2. Centrifugue el BALF x 400 g, a 4 ° C por 5 min, para eliminar las células y otros desechos celulares y recoger el sobrenadante.
   3. Centrifugar el sobrenadante a 1.500 xg a 4 ° C durante 10 min, para eliminar restos celulares. Recoger el sobrenadante y proceder a las medidas de aislamiento de EV.

2. aislamiento de las vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar murino

Nota: En este estudio, EV dos técnicas de aislamiento, es decir, UFC y ultracentrifugación con boyante utilizan para aislar EVs de BALF. El protocolo detallado de cada método se describe a continuación.

1. Método de enriquecimiento de centrifugado (UFC) de ultrafiltración
   Nota: Este método fue modificado del protocolo descrito anteriormente¹⁰.
   1. Filtrar el sobrenadante del paso 1.2.3 a través de un filtro de jeringa estéril 0,2 μm y mantener el filtrado BALF en hielo.
      Nota: Este es un paso de la exclusión de tamaño por el que sólo vesículas más pequeñas de 200 nm se recogen.
   2. Equilibrar la unidad de filtro centrífugo de 100 kDa MWCO con DPBS estéril durante 10 minutos, centrifugar la unidad centrífuga a 1.500 x g por 10 min a 4 ° C para descartar la DPBS.
      PRECAUCIÓN: Una vez que la membrana en el dispositivo de filtro es equilibrada con DPBS, la membrana debe mantenerse húmeda en todo momento hasta que el dispositivo se utiliza.
   3. Llenar el filtro con 15 mL de muestra de BALF de paso 2.1.1 y centrifugar a 3.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Flujo BALF puede desechado o recogido en un separado tubo canónico y almacenado a-80 ° C para su uso futuro.
   4. Repita el paso 2.1.3 para el restante 0,2 μm filtrado BALF.
      Nota: Tuvo tres repeticiones de centrifugados para concentrar suficientemente la EVs BALF del volumen original a partir de 35 mL. Esto dio lugar a 1 – 1,5 mL de retenido.
   5. Lave el retenido con 14 mL de DPBS estéril transfiriendo un suavemente repetidamente. Centrifugue la unidad filtrante a 3.000 x g, a 4 ° C por 30 min, para eliminar la DPBS y concentrar el retentate EV.
   6. Recoger el servicio voluntario europeo derivado de BALF concentrado desde el dispositivo de filtro por insertar una pipeta en la parte inferior del dispositivo de filtro y retirar la muestra utilizando un movimiento de barrido de lado a lado para asegurar la recuperación total.
   7. Alícuota del SVE derivados de BALF y almacenarlas a-80 ° C por más partículas cuantificación y caracterización (ver paso 3).
2. Ultracentrifugación (UC) con centrifugación de gradiente de densidad boyante (DGC)
   Nota: El siguiente protocolo fue modificado del protocolo descrito previamente²⁴.
   1. Transfiera el sobrenadante del paso 2.1.1 en un tubo de ultracentrífuga 37 mL y centrifugar la muestra a 10.000 x g por 30 min a 4 ° C utilizando la ultracentrífuga. Recoger el sobrenadante y centrifugue a 100.000 x g, a 4 ° C durante 60 minutos. Mientras que las pelotillas de EV se centrifugaron, se preparan diferentes concentraciones de búferes de gradiente de densidad boyante (tabla 1) para paso 2.2.3.
   2. Deseche el sobrenadante y resuspender las pelotillas de la EV en 200 μL de DPBS.
   3. Mezclar la suspensión de la EV con 300 μL de solución de trabajo de 50% iodixanol (tabla 1) y transferir al tubo de ultracentrífuga de 15 mL. Sobre la suspensión de mezcla de 50% EV iodixanol, secuencialmente la siguiente solución tampón en la orden de la parte inferior de la parte superior de la capa: 30% iodixanol (4,5 mL), 25% de iodixanol (3 mL), iodixanol (2,5 mL) de 15% y 5% iodixanol (6 mL). Centrifugar a 100.000 x g, a 4 ° C por min 230.
      Nota: El gradiente de densidad boyante se basa en el porcentaje de iodixanol escalar con la mayor concentración (50%) en la parte inferior a la menor concentración (5%) en la parte superior. Para generar diferentes concentraciones de iodixanol, varias cantidades de medio de homogeneización (tabla 1) se mezclaron con solución de trabajo (50% iodixanol).
   4. Recoger la fracción del 15% y 25% y diluir en DPBS estéril para subir el volumen a 15 mL. Transferirlos a un nuevo tubo de ultracentrífuga pequeño y centrifugue a 100.000 x g, a 4 ° C durante 60 minutos.
   5. Deseche el sobrenadante y resuspender las pelotillas de la EV en 50 μL de DPBS estéril para mayor caracterización.

3. cuantificación de vesícula extracelular

Nota: El rendimiento de recuperación derivados de BALF EVs es cuantificado con dos métricas.

1. Nanopartícula seguimiento medición análisis (NTA)
   1. Diluir la muestra de EV a 1: 200, 1: 500 en 1 mL de DPBS y carga la muestra en una jeringa de insulina. Conecte una jeringa de muestra a una bomba de jeringa y comience a medir el número de partículas y el tamaño (véase Tabla de materiales).
   2. Establecer el nivel de la cámara en el 14 y el umbral de detección en 1 para todas las mediciones de la muestra. Cinco mediciones repetitivas con 1.500 fotogramas de 30 s se registraron para cada muestra, con un retraso de 20 s entre lecturas. Combinar y promedio de los datos de concentración final y tamaño informes.
      Nota: Para la captura precisa de todas las partículas, ajustar el nivel de la cámara como apropiado para visualizar todas las partículas y use similares para todas las mediciones de la muestra en cada experimento.
2. Cuantificación de proteína
   Nota: Ensayo de proteína (BCA) ácido bicinchoninic fue utilizado para medir la concentración de proteína de la EVs derivados de BALF.
   1. Solubilizar las muestras EV en tampón de lisis de x 1.
   2. Cuantificar la cantidad de proteína en la EVs BALF derivado según el protocolo estándar BCA con detección colorimétrica midiendo la absorbancia a 560 nm en un lector de placas.

4. detección de vesículas extracelulares derivadas de BALF

Nota: Exosomas comúnmente conocido marcador superficial proteínas (TSG101, CD63, CD81, CD9) fueron utilizadas para verificar EV recuperaciones por SDS-PAGE y el immunoblotting y el flujo cytometry análisis.

1. SDS-PAGE e immunoblotting
   1. Disolver una cantidad igual de proteínas de EV de cada muestra con una carga de buffer (dodecil sulfato de litio) y 50 mM Ditiotreitol (DTT) en un tubo de 1,6 mL de borrar. Calentar las muestras a 70 ° C durante 10 minutos.
   2. Cargar las muestras en el paso 4.1.1 en un gel de acrilamida Bis-Tris Plus 4 – 12% y ejecutar electroforesis (150 voltios, 35 mA) durante 35 minutos.
   3. Transferencia de proteínas a una membrana de nitrocelulosa, usando un método de transferencia en seco.
   4. Bloquear la membrana con 5% leche desnatada durante 60 min, oscilación en la temperatura ambiente (RT).
   5. Incubar la membrana con un anticuerpo a un marcador de proteína de la superficie de EV, Tumor susceptibilidad genética 101 (TSG101) a dilución 1: 500 en 5% de BSA en Tris-buffer salina Tween-20 (TBST) a 4 ° C, oscilando durante la noche.
   6. Al día siguiente, lavar la membrana 3 x 10 min cada uno Lave, en buffer TBST e incubar con anti-conejo IgG, un anticuerpo ligados por la HRP, en dilución de 1:5,000 durante 60 min a TA.
   7. Lavar la membrana 3 x 10 minutos cada lavado, en buffer TBST. Desarrollo de la membrana con quimioluminiscencia reactivo de detección de anticuerpos HRP y la imagen (véase Tabla de materiales para sistema de imagen).
2. Citometría de flujo
   1. Diluir el EVs derivados de BALF en 49 μL de buffer (PBS + EDTA 5 mM + 0,5% BSA, filtrada a través de una membrana de filtro de jeringa de 0.1 μm) la coloración de la Junta.
   2. Añadir a cada uno de los siguientes anticuerpos en cada muestra individual: 1) anticuerpo de rata anti-ratón CD63 PE (100 ng por reacción); 2) anti-mouse rata PE CD81 (500 ng); 3) anti-mouse rata CD9 FITC (200 ng). Incubar a 4 ° C, oscilación de 60 minutos en la oscuridad.
   3. Diluir las muestras con 450 μL de filtrado de membrana PEB tampón de tinción y someter las muestras a análisis de citometría de flujo (véase Tabla de materiales)²⁵.
   4. Ajustar la configuración de citómetro de flujo de la siguiente manera: 1) activado todos los canales de registro hyper (hlog); 2) Coloque el gatillo en SSC en 4; 3) Apague el gatillo secundario. Ejecutar los ejemplos en un entorno de baja velocidad y adquirir por lo menos 10.000 eventos en cada muestra.
   5. Realizar citometría bajo análisis de los datos en cada muestra utilizando el software de análisis (véase Tabla de materiales).

Realizamos aislamiento de EV de ratón BALF utilizando métodos de aislamiento de UFC y UC-DGC en el mismo día. El método UFC requiere aproximadamente 2.5-3 h, mientras que la técnica de la UC-DGC requiere 8 horas de tiempo de procesamiento. Esto no incluye los amortiguadores y los reactivo tiempo de preparación. Cabe señalar que algunas de las tareas pueden realizarse en los períodos de tiempo de centrifugación. Sin embargo, todo el procedimiento duró casi un día entero para la técnica de aislamiento de UC-DGC.

EVs BALF derivadas de ratones normales aislados por el método UFC muestran un tamaño más pequeño y una distribución más uniforme de tamaño (148.8 ± 1.1 nM, figura 1A) en comparación con el UC-DGC EVs (176.7 ± 7,8 nM, figura 1B). La técnica UFC tuvo un profundo 65-fold partícula total mayor cuenta en comparación con el aislamiento de la UC-DGC (29,4 ± 18.4 vs 0,5 ± 0,1 x 1010 partículas; p < 0.05; Tabla 2 y figura 1). La recuperación de proteína total (en μg) de los vehículos eléctricos de la UFC fue mayor (3.136 ± 1.860 vs 73,7 ± 38.3 μg; p < 0.05; Tabla 2 y figura 1). Así, UFC es tiempo y esfuerzo eficiente y proporciona un mayor rendimiento de EV.

Para caracterizar fenotípicamente las poblaciones derivadas de BALF EV, se examinó la presencia de marcadores de proteínas de superficie de exosomas conocida: CD63, CD9 y CD81 por citometría de flujo y TSG101 immunoblotting. Usando análisis de citometría de flujo, demostramos que UFC EVs y UC-DGC EVs expresaran CD63 (figura 2A -2 C), CD9 (Figura 2D -2F) y CD81 (figura 2 -2I). La expresión de la media geométrica (gMFI) de CD63, CD9 y CD81 fue cuantificada y no estadísticamente diferentes entre las dos condiciones (Figura 3A -3F).

A continuación, examinamos otro EV proteína marcador, TSG101, immunoblotting. Demostró que los 20 μg de la muestra de UFC a través de flujo (UFC-FT) no contenían proteínas TSG101, sugiriendo que la técnica de aislamiento de UFC eficientemente seleccionado y había conservado la población de EV de la muestra BALF (figura 4). Cuando igual cantidad de proteína total (20 μg) de la muestra de BALF-EV fue cargado, nos encontramos con que UFC EVs expresa un mayor nivel de TSG101 que UC-DGC EVs (figura 4). También demostramos que la pureza de la proteína de la UFC-EV fue aceptable, demostrado por una banda de solo proteína aislada.

Para todos los resultados, de Student t-test se utilizó para la comparación de dos grupos. Los resultados se presentan como media ± SEM (error estándar de la media), y p < 0.05 se consideró significativo.

Figura 1: centrifugación ultrafiltración de murino de lavado broncoalveolar (BALF)-EVs derivadas demostraron una más homogénea distribución de tamaño de ultracentrifugación con la centrifugación de gradiente de densidad de murinos derivados de BALF EVs y tenía un significativamente mayor partícula total recuento y proteína contenido. La distribución de tamaños de partícula de EV se midió por nanopartículas seguimiento análisis (NTA) y el contenido de proteínas totales fue medido por el ensayo ácido bicinchoninic. Gráfico de distribución de tamaño NTA de EVs de la UFC-BALF (A). Gráfico de distribución de tamaño de EVs de la UC-DGC-BALF (B). Recuento de partículas totales (C) por NTA (media ± SEM x 1010 partículas; * p < 0.05). (D) contenido de proteína Total (en μg, * p < 0.05). Los datos se derivan de tres experimentos independientes. UFC: centrifugación ultrafiltración; UC-DGC: ultracentrifugación con centrifugación de gradiente de densidad; EVs: vesículas extracelulares; SD: desviación; Conc: concentración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: lavado broncoalveolar murinas derivadas líquido EVs aislados por centrifugación ultrafiltración y ultracentrifugación con métodos de centrifugación del gradiente de densidad expresa proteínas tetraspanina CD63, CD9 y CD81. Demostrado son porcentajes de EVs mancharon el positivos por las técnicas de aislamiento de UFC y UC-DCG, ilustradas por parcelas de pseudocolor, para (A - C) PE-CD63, (D - F) FITC-CD9 yG - PE-CD9. Los datos se derivan de tres experimentos independientes. UFC = centrifugación ultrafiltración; UC-DGC = ultracentrifugación con centrifugación de gradiente de densidad; SVE = vesículas extracelulares; SSC-A = lado análisis de dispersión; PE = ficoeritrina; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: el lavado broncoalveolar murino aislado por centrifugación ultrafiltración líquido derivado de EVs expresó una similar densidad fluorescente de tetraspanina proteínas aisladas de ultracentrifugación EVs. (A y D) Expresión (gMFI) del histograma y la media geométrica de PE-CD63+-manchado EVs. (B y E) histograma y gMFI de FITC-CD9+-manchado EVs. (C y F) histograma y gMFI de PE-CD81+-manchado EVs. Estos datos se derivan de tres experimentos independientes. UFC: centrifugación ultrafiltración; UC-DGC = ultracentrifugación con centrifugación de gradiente de densidad; EVs: vesículas extracelulares; SSC-A: Análisis de dispersión de lado; PE: ficoeritrina; FITC: isotiocianato de fluoresceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: lavado broncoalveolar murinas derivadas líquido EVs aislados por centrifugación ultrafiltración y ultracentrifugación con métodos de centrifugación del gradiente de densidad expresa la proteína de la superficie de los exosomas, TSG101. Este panel muestra el immunoblotting de murinos derivados de BALF EVs para el anticuerpo TSG101 (47 kDa). UFC = centrifugación ultrafiltración; UC-DGC = ultracentrifugación con centrifugación de gradiente de densidad; SVE = vesículas extracelulares; FT = flujo a través; TSG = gen de susceptibilidad tumoral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: buffers gradiente densidad boyante. Esta tabla muestra la relación entre composición y buffer de cada solución de gradiente que se utiliza para purificar poblaciones de vesícula extracelular líquido derivado de lavado broncoalveolar murino aisladas por la técnica de ultracentrifugación. * La solución de trabajo fue 50% iodixanol (25 mL de medio de gradiente de densidad [véase Tabla de materiales] + 5 mL de solución diluyente [pH 7.4 de sacarosa de 0,25 M + 120 mM HEPES + 0,9 M de NaCl]). ** Medio de homogeneización (pH 7.4 de sacarosa de 0,25 M + 20 mM HEPES, 150 mM NaCl)

Tabla 2: el método de aislamiento de centrifugación ultrafiltración proporciona un rendimiento de derivados del líquido extracelular vesícula lavado broncoalveolar murino alta. La concentración de partículas y recuento de partículas totales se midieron por nanopartículas seguimiento análisis (NTA). La concentración de la proteína y la cantidad total de proteína se midieron por un análisis de proteína ácido bicinchoninic. * Concentración de partículas de BALF EVs (media ± SEM x 108/μL de tres experimentos independientes). † Partículas total de BALF EVs (media ± SEM x 1010 partículas de tres experimentos independientes). ‡ Concentración de la proteína de BALF EVs (media ± SEM μg/μl de tres experimentos independientes). § Proteína total de BALF EVs (media ± SEM mg de tres experimentos independientes).
UFC: centrifugación ultrafiltración; UC-DGC: ultracentrifugación con centrifugación de gradiente de densidad; Conc: concentración; NTA: nanopartículas seguimiento análisis; SEM: error estándar de la media.

Los autores no tienen nada que revelar.