Cuantificar distancias intermembrana con dilataciones de imagen Serial

Summary

El objetivo de este algoritmo es para continuamente medir la distancia entre dos bordes de 2 dimensiones usando pathfinding y dilataciones de la serie de la imagen. Este algoritmo puede aplicarse a una variedad de campos como la biología estructural cardiaca, biología vascular e ingeniería civil.

Abstract

Un nanodomain extracelular recientemente descrito, denominado perinexus, se ha implicado en ephaptic acoplamiento, que es un mecanismo alternativo para la conducción eléctrica entre cardiomyocytes. El método actual para la cuantificación de este espacio por segmentación manual es lento y tiene baja resolución espacial. Hemos desarrollado un algoritmo que utiliza dilataciones imagen serial de un esquema binario para contar el número de píxeles entre dos opuestos 2 bordes tridimensionales. Este algoritmo requiere menos horas hombre y tiene una resolución espacial más alta que el método manual conservando la reproducibilidad del proceso manual. De hecho, experimentados y noveles investigadores fueron capaces de recapitular los resultados de un estudio anterior con este nuevo algoritmo. El algoritmo está limitado por la entrada humana necesaria para delinear manualmente el perinexus y el poder computacional gravado principalmente por un algoritmo pathfinding preexistente. Sin embargo, el algoritmo capacidades de alto rendimiento, alta resolución espacial y reproducibilidad hacen una herramienta de medición versátil y robusto para el uso en una variedad de aplicaciones que requieren la medición de la distancia entre cualquier 2 dimensiones (2D ) los bordes.

Introduction

El siguiente algoritmo fue desarrollado para medir la distancia intermembrane entre dos cardiomiocitos estructuralmente acoplados en el punto que se separan unos de otros en el borde de una placa de ensambladura de gap en un nanodomain llamado la perinexus¹, que tiene ha implicado en ephaptic acoplamiento^2,3,4,5. En el proceso de analizar cientos de imágenes de microscopía electrónica (TEM) de transmisión de perinexi usando un método de segmentación manual de un anterior estudio⁶, se identificó la necesidad de un método de mayor rendimiento que muestreados mayor ancho de perinexal resolución espacial mientras que preserva la exactitud del proceso de segmentación manual anterior durante la segmentación manual, se dibujan líneas a intervalos 15 nm aproximadamente ortogonales a la línea central, con el fin de medir el ancho de perinexal. El nuevo algoritmo toma un esquema binario grueso de un píxel de dos líneas paralelas y dilataciones imagen serial utiliza para contar el número de píxeles entre las dos membranas. Mientras que dilataciones de imagen comúnmente se han utilizado en una miríada de aplicaciones de procesamiento de imagen, incluyendo el contorno o borde detección^7,8, este algoritmo utiliza dilataciones como un mecanismo de conteo. La línea central es entonces aislado usando una pathfinding algoritmo⁹ y perinexal la anchura se mide con una resolución a lo largo de la longitud del perinexus igual a la resolución de la imagen. En este caso, la diferencia en resolución es 1 medida por 15 nm para la segmentación manual y 1 medición por 0.34 nm con el nuevo algoritmo, un 44-fold aumento en la frecuencia de muestreo espacial. Además, esta mayor frecuencia de muestreo se realiza en aproximadamente 1/5^th el tiempo necesario para la segmentación manual.

Este algoritmo se utilizará en su forma actual para medir el ancho de perinexal en el convencional 0-150 nm desde el borde de un gap junction placa⁵ (GJ), así como dentro de una región determinada de interés, donde el perinexus mesetas entre 30 y 105 nm^{2 , 3 , 10}. la mayor frecuencia de muestreo reduce la variabilidad en las mediciones de perinexus individuales en comparación con segmentación manual y acorta significativamente el tiempo de análisis, lo que permite un procesamiento eficiente de grandes conjuntos de datos. Sin embargo, este programa no se limita a imágenes TEM de nanoescala de cardiacos discos intercalados. El mismo enfoque podría utilizarse para cuantificar el diámetro vascular, fracción de eyección ventricular o incluso no biológico fenómenos como erosión fluvial e inundación. Este algoritmo es apropiado para la cuantificación de la distancia entre cualquier dos bordes casi paralelos.

Protocol

Nota: Requiere el Software son ImageJ (o software similar modificación de imagen) y Matlab R2015. El usuario puede encontrar problemas de compatibilidad con otras versiones de Matlab.

1. preprocesamiento de imágenes

1. Para cualquier imagen en escala de grises, garantizar el valor de la intensidad máxima de un determinado píxel es < 255. Esto normalmente se hace restando el valor 1 de la imagen en el programa personalizado de Matlab "ImageSub.m", incluido en archivo suplementario S1.

2. esquematización de la Perinexus

1. Esquema del perinexus en ImageJ u otro software de procesamiento de imágenes.
2. Asegúrese de que el contorno es un píxel de grosor y se establece en el valor más alto de intensidad en una imagen (255 en una imagen en escala de grises de 0 a 255).
3. Identificar el GJ por su estructura de pentalaminar^11,12y definir el principio de la perinexus como el punto en que divergen las dos bicapas de membrana de la célula de oposición, como se muestra en la figura 1A. Inicio ~ 200 nm desde el borde de la GJ, trazado a lo largo de la membrana interna de la primera célula y a lo largo de la membrana interna de la segunda célula. En ImageJ, soltar la pluma para cerrar automáticamente el esquema. Este cierre artificial se recortarán más adelante hacia fuera.
   Nota: Es fundamental delinear el perinexus con mucho cuidado en lo más alto una ampliación de lo posible, pues incluso pequeñas aplicaciones mal del contorno pueden hacer varios nanómetros de error en la medición final.

3. configuración del algoritmo y selección de Perinexus de interés

Nota: El algoritmo pathfinding requiere el autógrafo, borde, grafo, nodo y Pathfinding funciones⁹ que en el mismo directorio que el archivo m MembraneSepDist. Todos los archivos se pueden encontrar en archivo suplementario S1.

1. Seleccione Guardar ubicaciones de datos y cifras. Estas son actualmente codificadas en el m-file.
   Nota: La primera línea del programa es una función para borrar todas las variables, cerrar todas las ventanas y limpiar la ventana de comando. Guardar variables deseadas ni figuras antes de ejecutar el archivo de m.
   Nota: Imágenes de Software se incluyen en el archivo suplementario S2 para todos los valores codificados.
2. Ejecute el programa "MembraneSepDist.m".
3. Establecer los parámetros.
   Nota: Una GUI aparecerá con los parámetros por defecto para el umbral de gradiente, escala, región de interés y arranque manual. Los valores por defecto pueden cambiarse en el archivo de m, o se pueden cambiar para cada imagen individual.
   1. Umbral degradado derivado espacial fijado.
      Nota: Los valores más altos resultan en más puntos seleccionados en el aislamiento de la línea central. Valores que son demasiado alta o demasiado baja (fuera de un rango de aproximadamente 3.0-7.9) pueden resultar en ineficiencia computacional o una imprecisa selección de puntos de la línea central produciendo aislamiento imprecisa línea central (ver figura 2A-C).
   2. Establecer la escala en unidades de píxeles y escala.
   3. Establecer los límites inferiores y superiores espaciales para la región de interés.
      Nota: Por Convención de nuestro laboratorio, la región definida de interés es entre 30 y 105 nm desde el borde de la GJ^2,3,10.
   4. Configurar el inicio automático/manual. En la mayoría de los casos, el algoritmo detecta con precisión el punto de partida donde comienza el gap junction extremos y perinexus. Sin embargo, en algunos casos de forma irregular perinexi, el usuario debe identificar el punto de inicio manualmente. Establezca este valor en 0 para automáticos, 1 manual.
4. Seleccione la imagen deseada.
   Nota: La carpeta seleccione archivo puede cambiarse en el m-file.
5. Recortar la imagen para seleccionar el perinexus de interés.
   1. Cuando la imagen, el cursor automáticamente cambiará a una cruz. Recortar la imagen, arrastre un cuadro alrededor de la perinexus de interés (ver figura 3). El CropBox se puede ajustar mediante el uso de las plazas en las esquinas y los lados para que sea más grande o más pequeño.
   2. Cuando el cultivo asegurar el extremo "abierto" de la perinexus (más alejado de la GJ, ver figura 3) es recortada para que los contornos de dos membrana alcanzan el borde de la imagen recortada.
      Nota: Se recomienda hacer la imagen de pantalla completa más fácilmente ver la perinexus de interés y recortar adecuadamente.
6. Seleccione el cultivo final haciendo doble clic con el cursor entre los bordes opuestos a medir.
   Nota: Es fundamental realizar el doble clic dentro de la perinexus. Si el programa no puede identificar una línea central, reinicie el programa y asegúrese de que el clic se produce dentro de la perinexus.
7. Observar la línea central final después de todas las dilataciones y erosiones pop para una evaluación de usuario final de la eficacia del programa.
   Nota: Un cuadro de diálogo aparecerá en la pantalla mientras el programa está funcionando para informar al usuario que Matlab no podrá procesar cualquier comandos adicionales hasta que el programa haya terminado. Este proceso tarda depende de tamaño de la matriz (imagen) y potencia de procesamiento del ordenador.
8. Si se habilita el punto de inicio manual, observar la imagen de la línea central pop-up sobre la imagen anatómica original, junto con un cursor de Cruz (ver figura 2E). Seleccione un punto fuera de la perinexus cerca del punto de inicio deseado.
   Nota: El programa de encontrar el punto de la línea central más cercano al píxel seleccionado y utiliza como punto de inicio.
9. Datos del registro.
   Nota: Una vez finalizado el programa, el programa devolverá una línea central asignada, parcela de perinexal de ancho en función de la distancia desde el borde de la GJ. Además, el programa devolverá el ancho promedio perinexal hasta 150 nm desde el borde de la GJ, así como la media de dentro de la región definida de interés en la línea de comandos de Matlab. Valores de_p W y Distancias desde el GJ se almacenan en la variable "WpList" o el usuario manualmente puede grabarlas por separado.

4. algoritmo solución de problemas

1. Si la línea central no está correctamente identificados (figura 2A), abra la figura "Gmag" y utilizar el índice para identificar un umbral de gradiente adecuado (figura 2C).
2. Si no se identifica correctamente el punto de inicio, establecer el punto de inicio manualmente (ver protocolo de 3.8).

Results

Métodos estadísticos: Se hicieron comparaciones entre grupos experimentales del estudiante t-pruebas. Un valor de p < 0.05 se consideró significativo y todos los valores se representan como media ± desviación estándar.

Segmentación manual. La cuantificación de la anchura de nanodomain de perinexus GJ adyacentes (con_p) normalmente se logra por segmentación manual. Este proceso de segmentación manual se demuestra en la figura 1A y fue descrito previamente⁶. El observador identifica el borde de la GJ (figura 1, punto rojo), mide 5nm en el centro de la perinexus y mide la distancia entre las membranas en ese momento. El proceso entonces se repite en 10, 15, 30 y cada 15 nm hasta 150 nm. Esta técnica, al mismo tiempo eficaz, tiene limitaciones de tiempo y muestreo espacial menores a lo largo de la longitud de la perinexus.

Significa que las mediciones de_p W de los estudios anteriores pueden variar de aproximadamente 10 a 20 nm^2,3,10y 3 nm parece ser la diferencia de medias es necesaria para detectar la significación estadística, que es muy por encima de la frecuencia de Nyquist espacial de 0,7 nm por medición basado en una resolución interpixel de 0.34 nm. Por lo tanto, mientras que la segmentación manual es lento, el método es suficiente para medir diferencias en W_p asociada a un estado de enfermedad o intervención.

Dilataciones imagen serial. Para medir la perinexus de una manera más rápida y reproducible con resolución espacial adecuada, hemos desarrollado un programa basado en las dilataciones imagen serial para contar los píxeles entre dos membranas remontado manualmente, que pueden verse en la figura 1B .

El proceso de dilatación serie se ilustra en la figura 4. Como se dilata la imagen binaria (Figura 4A-4D), que dilatación es luego invertida y añadida a una imagen de trabajo - la forma no-binaria del contorno original (figura 4E-4 H). El proceso se repite hasta que el contorno se rellena completamente (figura 4D). En este punto, la imagen final del trabajo (figura 4H) es un recuento del número de veces que un píxel particular ha permanecido sin dilatación. Como tal, los valores de cerca el contorno de las membranas celulares son muy bajos, mientras que los valores en el centro son más altos. Al contar el número de dilataciones para rellenar el área en cada punto, se puede calcular la distancia entre los bordes de la membrana. El próximo desafío es identificar y aislar a la línea central para cuantificar anchura perinexal en función de la distancia de GJ, que se realiza aplicando primero un derivado espacial a la imagen final del trabajo (figura 2-imagen pasada y figura 5 A). Un segundo ejemplo de un perinexus de forma irregular se puede encontrar en archivo suplementario S3.

Identificación de la línea central. El gradiente de la imagen final del trabajo se puede cuantificar por un derivado espacial, como cuenta de dilatación valores de borde a borde cambian de alta a baja a alto otra vez (figura 5A de izquierda a derecha). Considerando sólo la magnitud de la derivada espacial (figura 5B), el contorno y la línea central, con flechas blancas, son inmediatamente identificables como áreas de discontinuidad. En estos lugares, la dirección del degradado cambia de creciente a decreciente o viceversa. Aplicación de un umbral (figura 5C) produce una imagen binaria de la línea central y el contorno, y restando el contorno original rinde la línea central aislada(figura 5). Mientras que este método de aislamiento de la línea central es computacionalmente eficiente, el umbral aplicado a la derivada espacial crea huecos en la línea central resultante. Llenar estos vacíos (figura 5D, insertar) para proporcionar una medida exacta de la distancia de la GJ y para que la perinexus se mide en su totalidad. En primer lugar, la línea central se dilata para rellenar los huecos (figura 5E), seguidos por una erosión (figura 5F) y una función de "bwmorph" (operación = 'skel', n = inf) para eliminar la mayor cantidad de puntos posible dejando un línea central continua, aumentando la eficiencia computacional de un algoritmo pathfinding posteriores desarrollado por Wasit Limprasert y disponible en MATLAB Central⁹. Esta función de dilatación la erosión produce la completa línea de central, que se combina con la imagen del trabajo final (figura 5G). Sin embargo, esta línea central es a menudo más de un píxel de grosor y por lo tanto no es un aislamiento preciso de la línea central.

El algoritmo pathfinding de Wasit Limprasert se utiliza para determinar la línea central de perinexus. El algoritmo pathfinding es capaz de rastrear los valores más altos - en este caso los valores más cercanos al centro que seguía siendo no-dilatado a través de más iteraciones a lo largo de la línea central (figura 5G, coloque). El resultado es un seguimiento automático de la línea central, como se muestra en la figura 6. Aislando la línea central, ancho de perinexal puede presentarse como una función de la distancia desde el extremo de la GJ, como se muestra en la figura 6B (arriba), o como el ancho promedio de una región determinada de interés.

Análisis de núcleo. Es importante tener en cuenta que imágenes convertidas a digital se basan en arreglos de discos de Plaza y núcleos de dilatación se basan además en matrices cuadradas. Esto significa que la distancia de dilatación a través de una diagonal es mayor que ortogonales. Por lo tanto, a continuación intentamos determinar si el núcleo afectado los resultados del algoritmo. Para cuantificar la variabilidad específica de núcleo, se analizaron cinco formas diferentes kernel: "Plus" (la forma utilizada en los análisis anteriores), "X", "caja" y "línea", como se describe en la figura 7A. El núcleo se aplica en cada punto cero de una imagen binaria. La estrella en cada núcleo de la figura 7A representa el centro, donde es un valor de 1 blanco y negro es un valor de 0 para el núcleo de la dilatación.

Influencia de cada núcleo en la medida de_p W media de una sola imagen perinexal aproximadamente horizontal (figura 7B, arriba), cuantificadas por un usuario experimentado, se determinó girar la imagen con el comando "imrotate" de Matlab y Computación con_p en pasos de 10 °. Los valores de medición W_p (figura 7B, fondo) fluctúan con la orientación de la imagen de una manera sinusoidal rectificada con un Plus en forma de núcleo. Los valores más bajos ocurren cuando un perinexus relativamente recta está orientado vertical u horizontalmente. Granos el X, caja, ni línea proporcionan alguna ventaja sobre el núcleo en forma de plus. Los kernels de X y la caja producción resultados idénticos, pero los valores de significan W_p fueran fuera de fase con th_e núcleo Plus por 45 °. El núcleo de la línea ha podido dilatar completamente la imagen en ciertos ángulos como se aprecia por la ausencia de datos en el rastro verde de imágenes giradas a menos de 30 o más de 145 °. Así, el núcleo de dilatación más ortogonal sobrestimó la separación de membrana cuando dilatando un perinexus con un eje orientado diagonalmente por ejemplo a aproximadamente 45 °, y los granos X y caja subestimaron media W_p cuando el eje largo de la perinexus estaba también en 45°. Basándonos en este análisis, hemos creado un factor de corrección que se aplica a los valores generados a partir de dilatación con el núcleo en forma de plus. Para tener en cuenta la sobrestimación de la separación de membrana asociada a la orientación de la imagen, este factor de corrección multiplicado por el valor de anchura medidos según la orientación de la imagen (ecuación 1).

Si θ < 45°
     W_{p corregido} = cosd(θ) * W_{p medido}
Si θ ≥ 45 °
     W_{p corregido} = cosd(θ) * W_{p medido} (ecuación 1)

En esta ecuación, W_p medido es el valor original de_p W generado por el algoritmo anterior y θ es el ángulo calculado de horizontal, en grados. Θ se calcula tomando la tangente inversa del cambio total en la dirección horizontal dividida por el cambio total en la dirección vertical de la línea central de perinexal. La corrección anterior aproxima el ángulo promedio, con respecto a la horizontal, de la perinexus (figura 8A, izquierda-arriba) y los resultados en una medida como si de un perinexus horizontal (figura 8A, esquina inferior izquierda). La lógica detrás de esta ecuación viene del hecho de que el núcleo en forma de plus (figura 7A) es esencialmente dos en forma de línea de núcleos dispuestos ortogonalmente entre sí. Así, por debajo de 45° (más cercano a la horizontal), las dilataciones se producen verticalmente y por lo tanto multiplicando por el coseno del ángulo da la medida correcta. Por el contrario, para los ángulos por encima de las dilataciones (más cercanos a la vertical), 45° se producen horizontalmente y el seno se utiliza para determinar la medida correcta. A exactamente 45°, el seno y el coseno son iguales. Archivo suplementario S4 proporciona una representación de este concepto. Tenga en cuenta que esta corrección se basa en el ángulo medio y debe tener precaución al analizar formas sustancialmente lineal. Este proceso se repitió en 20 perinexi seleccionadas al azar y las medidas corregidas fuertemente correlacionaron con las mediciones obtenidas por rotación manualmente y volver a analizar las imágenes (figura 8A, derecho). Para confirmar la corrección exacta para la orientación de la imagen, dos conjuntos de bordes fantasmas fueron generados (figura 8B, izquierda) y girar 180 °. Con la corrección de funciones trigonométrica, el algoritmo devuelve exactamente el valor correcto en cada orientación, independientemente de la resolución espacial o tamaño de la imagen (figura 8B, derecha).

Aplicación analítica y reproducibilidad con corrección de orientación. Recordando que estudios previos usando segmentación manual informe estadísticamente significativo quiere decir diferencias de_p W mayores que o igualan a 3 nm, era importante determinar si el algoritmo se podría utilizar para recapitular los resultados anteriores con un conjunto de datos completo. Mediante el algoritmo nuevo, dos observadores - una experiencia y una inexperta con análisis perinexal (OBS. 1 y 2 OBS., respectivamente)-analizaron las mismas imágenes de un estudio anterior⁶ que incluyó 12 pacientes que fueron diagnosticados con la fibrilación auricular (FA) antes de la colección de tejidos y 29 pacientes que no tiene AF preexistente (No-AF). El usuario experimentado encontró que con_p fue significativamente mayor en pacientes con FA que sin FA (21.9±2.5 y 18.4±2.0 nm, respectivamente, figura 9A). Estos valores con el factor de corrección aplicado son similares a ésos divulgados previamente (24.4±2.2 nm y 20.7±2.4 nm, respectivamente)⁶. Lo importante es que, un usuario inexperto encontró la misma diferencia significativa (22.1±2.8 nm y 20.1±2.6 nm, respectivamente) entre los Estados de la enfermedad con el programa automatizado. Además, la desviación estándar de los valores de_p W no cambió con el factor de corrección, que indica que la desviación estándar de 2-3 nm no es un artefacto del algoritmo pero de la estructura sí mismo y el proceso de tejido. Estos resultados demuestran que el método automatizado propuesto es capaz de recapitular los resultados de estudios anteriores.

Importante, la perinexus es una estructura recientemente definidos y no hay consenso sobre el rango de los valores absolutos de la separación de la membrana adyacente a la GJ^2,3. Desde ancho GJ-membrana-a-externo-membrana externa se ha estimado previamente en 20 nm¹³, se procuró determinar la eficacia del algoritmo midiendo también anchura GJ. Ambos observadores no encontrados diferencias significativas entre anchos de ensambladura de gap (GJW) de los pacientes con o sin FA preexistente (figura 9B). Valores absolutos de GJW de AF y AF no pacientes fueron 20.5 ± 2,5 nm y 20,3 ± 1.9 nm, respectivamente, para el observador experimentado y 21.0 ± 3.1 nm y 20,0 ± 2.2 nm para el observador inexperto, similar a lo que se ha divulgado previamente.

Para determinar si el algoritmo automatizado requiere menos tiempo para analizar los datos de la segmentación manual, tanto los usuarios experimentados y sin experiencia registran el tiempo necesario cuantificar una formación de imagen de 10 set (archivo suplementario S5). Tabla 1 demuestra que los usuario experimentado y sin experiencia disminuyó el tiempo de análisis por 4.7 - y 8.3 veces respectivamente, utilizando el algoritmo automatizado en relación con el enfoque de la segmentación manual, con un aumento de aproximadamente 43-fold espacial resolución a lo largo de la perinexus.

Algoritmo de resolución de problemas. El error más común cuando se ejecuta el algoritmo ocurre cuando la línea central final no termina en el borde de la imagen. En tales casos, no hay suficientes puntos se seleccionaron el mapa derivado espacial, haciendo que el programa falle y producir un mensaje de error asesorando al usuario para seleccionar un área de cultivo más grande o aumentar el umbral derivado espacial. Dibujo una caja más grande de cultivo mejorará la confiabilidad del programa en algunos casos como los cambios espaciales derivados drásticamente cerca de los bordes de la figura, que puede interrumpir los algoritmos de detección de pathfinding o borde.

También es posible para el algoritmo pathfinding a no identificar correctamente la línea central, incluso si la línea central alcanza el borde de la imagen, particularmente si el gradiente es muy baja (figura 2A). Si el umbral de gradiente se establece demasiado alto, habrá más puntos innecesario incorporadas el algoritmo pathfinding (figura 2B), disminución de eficiencia computacional. Si el usuario es incapaz de determinar un umbral adecuado, la matriz de la imagen "GMag" (figura 2C), que es generado por el programa y puede encontrarse en el espacio de trabajo, ayuda al usuario determinar el umbral. Encontrar los puntos a lo largo de la línea central y establecer el umbral ligeramente por encima de su valor de índice para asegurar que estos puntos se seleccionan. En el ejemplo, un umbral adecuado sería encima de ~5.1 (figura 2C, insertar).

El punto de inicio también puede no llegar al inicio de la perinexus (figura 2D). En este caso, vuelva a ejecutar el programa y establezca el valor de Arranque Manual en 1. Después de la línea central se ha aislado, el usuario selecciona un punto fuera de la perinexus y el punto de la línea central más cercano al píxel seleccionado (figura 2E, cuadrado rojo) se establecerá como el punto de inicio. El resultado es la línea central completa (figura 2F).

Figura 1 : Imágenes TEM con los procesos de cuantificación. El proceso de segmentación manual (A) requiere que el usuario realizar mediciones intermembrane individuales 12 mientras que la estimación de la línea central. El proceso automático (B) requiere un seguimiento manual, continuo del contorno de la perinexus. El punto rojo en cada imagen representa el extremo usuario identificado de la GJ y el comienzo de la perinexus. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figura 2 : Solución de problemas de línea central. Dos modos principales de falla para la identificación de la línea central y sus soluciones: cada imagen se etiqueta con el nombre de matriz en Matlab. Si el gradiente umbral es demasiado bajo (A, umbral de 0,2) puede fallar el algoritmo de la línea central. Ajuste el umbral demasiado alto (B, umbral 70) puede reducir la eficiencia computacional del algoritmo pathfinding. Puede determinarse un umbral de gradiente adecuado de la matriz de GMag (C, insertar). Si la línea central no puede alcanzar el borde del comienzo de la perinexus (D), el usuario puede optar por seleccionar manualmente el punto de inicio. Después el "Start Point" opción se establece en 1 en el GUI de la apertura, el usuario, luego selecciona un punto fuera de la perinexus de interés (E). El resultado final debe ser una línea central que representa con precisión la totalidad de la perinexus (F). Todas las etiquetas en las citas (A-F) corresponden a los nombres de variables en Matlab. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Selección de Perinexus. Para recortar el perinexus, haga clic en y mantener para arrastrar un cuadro alrededor de ella (la herramienta Recortar está seleccionada automáticamente) como se muestra por la flecha azul. Este cuadro puede ajustarse mediante el uso de las plazas en las esquinas y lados para hacerla más grande o más pequeño. La flecha verde representa el final de la perinexus, que el usuario debe asegurarse se mantiene "abierto". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Dilataciones de imagen serial. El esquema binario repetidamente es dilatado en incrementos de un píxel (A-d) y añadido a la imagen de trabajo (la forma no-binaria de la imagen, E-H) después de cada dilatación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: pathfinding y aislamiento de la línea central. Un derivado espacial se calcula a partir de la imagen final del trabajo (A) y la magnitud de ese derivado espacial (B) se utiliza para aislar el contorno y la línea central (flechas blancas). Un umbral definido por el usuario identifica el contorno y la línea central y restando el contorno original rinde la línea central (D). Sin embargo, las brechas aparecen en la línea central como resultado del umbral (D - insertar). Para producir una línea central continua, una dilatación secundaria se realiza en la línea central aislada (E), seguida por una erosión secundaria para aumentar la eficiencia computacional de un algoritmo pathfinding posterior. Esta imagen erosionada (F) se combina con la imagen final del trabajo, lo que permite la identificación de una línea central continua, un pixel de grosor (G - insertar). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 : Presentación de datos final. El programa de salidas el contorno final encima de la imagen original de TEM (A). La línea es de color verde para 0-150 nm, azul para la región definida por el usuario de interés y el rojo para la zona más allá de 150 nm. Además, el programa de salidas de un gráfico similar color representando con_p como una función de la distancia desde el inicio de la perinexus y para la región de interés (B), así como el promedio de W_p (recuadro gráfico respectivo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7 : Análisis de forma de dilatación núcleo. Formas para núcleos de dilatación (A): la estrella en el centro representa los píxeles dilatados. Cajas blancas son píxeles afectados por la dilatación, en forma de un plus, X, cuadro o línea. Un perinexus aproximadamente horizontal (superior, con una línea roja que indica 0° B) se gira hacia la derecha de 0 a 180° en pasos de 10° y varias ocasiones dilatada usando las formas kernel diferentes (B, fondo). Núcleos en forma de Plus y línea producen resultados similares, aunque el núcleo de la línea falla en ciertas orientaciones, mientras que los núcleos en forma de caja y X son fuera de fase de 45 °. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8 : Corrección de orientación de la imagen. A correcta para la orientación de la imagen, el ángulo medio de la perinexus se calcula de las posiciones de la salida - y final puntos (A, izquierda, principio y fin de línea negra). La tangente inversa del cambio en la dirección y (A, línea izquierda, verde) había dividido por el cambio en el rendimiento de la dirección de x (A, izquierda, línea roja) el ángulo de corrección, θ (A, a la izquierda, amarillo). El objetivo es corregir entonces el valor promedio de_p W para dar la distancia mínima entre los bordes, como si la perinexus había sido fotografiada aproximadamente horizontalmente (una, abajo a la izquierda). La aplicación del factor corrección descrita por la ecuación 1 se comparó con rotación manualmente cada una de las 15 imágenes seleccionadas al azar por el θ calculado antes del análisis. Los valores corregidos fuertemente correlacionaron con los valores de la imagen rotada (R² = 0.991, A, derecha), que indica la ecuación 1 es un factor de corrección válida para orientación de la imagen. Para confirmar que el factor de corrección es adecuado, se generaron dos fantasmas de bordes perfectamente paralela con una distancia conocida entre ellos (B, a la izquierda). Fantasma 1 y 2 de fantasma tienen resoluciones espaciales de 2,833 pixeles / mm y 71,6 píxeles/pulgada, respectivamente. Como se muestra por los diamantes azules y cuadrados rojos en B, a la derecha, el algoritmo exactamente calcula sus anchos en 180 grados de rotación de la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9 : Reproducibilidad de algoritmo. Con el proceso automático de corrección de orientación de la imagen, un observador experimentado e inexperto diferencias significativas entre AF y AF No grupos (A), consistentes con un estudio previo, detectar una diferencia mínima de 2.6 nm. Además, ni observador encontró una diferencia significativa en GJW (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

	Manual	Automático
Tiempo - OBS. 1 (s)	205±11	44±14
Tiempo - OBS 2 (s)	248±18	30±5
Resolución espacial (mediciones/nm)	0.08	3.45

Tabla 1: comparación de los procesos manuales y automáticos de. Ambos observadores requieren menos tiempo por imagen para trazar el contorno de to realizar el proceso de segmentación manual para un sistema de formación de la imagen 10. Además, el proceso automático tiene una mayor frecuencia de muestreo, registrando 3,45 mediciones por nm, en comparación con un promedio de 1 medida cada 12.5 nm para el proceso manual. El entrenamiento conjunto imágenes en suplementario S5 de archivo, junto con esquemas y medidas como realizada por un usuario experimentado.

Discussion

El algoritmo utiliza dilataciones imagen serial para contar el número de píxeles entre dos bordes opuestos de 2D en una imagen binaria, que en este caso es la separación entre la membrana de la perinexus^2,3,14. Un derivado espacial y un algoritmo pathfinding entonces se utilizan para aislar la línea central, seguida por una secuencia de dilatación y erosión secundaria para llenar boquetes en la línea central, similar a lo que se ha hecho antes del¹⁵. La línea central se combina con la imagen de la cuenta final de la dilatación para representar perinexal ancho en función de la distancia desde el principio de separación de borde, en este caso el final de la GJ y principio de la perinexus¹⁶.

Cuatro parámetros primarios son definidos por el usuario en un GUI en el inicio del programa:

1. Umbral de gradiente
2. Escala
3. Región de la gama de interés
4. Punto de selección método del comienzo (automático o manual)

El mecanismo más común de fracaso para el algoritmo es el fracaso de la línea central hasta el borde de la imagen, que es cómo se determina el punto final para el algoritmo pathfinding. Para resolver tal cuestión, el usuario puede aumentar el gradiente umbral descrito en el paso 3.3.1, que hará que el programa seleccionar más puntos de la imagen derivada espacial, lo que aumentará el tiempo de cómputo requerido por el algoritmo pathfinding. Por lo tanto, este algoritmo requiere de un compromiso entre la integridad de velocidad y la línea central de cómputo. Es importante tener en cuenta que mientras todos los puntos de la línea central se identificaron a partir de la derivada espacial, junto con un punto de partida adecuado, el umbral derivado espacial no tendrá efecto en la medida de separación del borde.

Orientación de la imagen parece afectar valores de dilatación, ya que el núcleo se dilata en pasos de 90 grados, que pueden introducir un error si la mayoría de la región de interés está a un ángulo 45° con los ejes de matrices de dilatación. Por lo tanto, la cuenta de la dilatación no sea siempre una representación precisa del espacio entre los bordes. Esta limitación ha sido abordada por un factor de corrección de funciones trigonométricas, pero potencialmente puede ser ignorada si todas las imágenes de un conjunto de datos se alinean en la misma orientación. Además, debe tener precaución en la interpretación de resultados, como es posible que los planos de sección no son perfectamente perpendiculares a las dos membranas. En la figura 9B, utilizamos GJW para sugerir que nuestras imágenes perinexus fueron en el plano. Aún así, es imperativo que tamaños de muestra suficientemente grande para tener en cuenta las variaciones seccionamiento entre imágenes. Además, nuestras mediciones de anchura de perinexal no deben ser interpretados para reflejar espacios en vivo , pero este enfoque se utiliza para medir las diferencias de medias de perinexal ancho en relación a algún Estado de enfermedad o intervención.

El algoritmo actual también requiere un esquema de trazado manual de los bordes como una entrada. Es importante tener en cuenta que siempre y cuando la escala está establecida correctamente, resolución espacial no tiene ningún efecto sobre las mediciones del algoritmo, como lo demuestran las diferentes resoluciones de imágenes en la figura 6 y una imagen de baja resolución adicional en suplementario archivo S6. El siguiente paso en la mejora del algoritmo está quitando intervención humana de generación de esquema junto con una herramienta que puede seleccionar el área de interés. Estas características probablemente mejorarían la precisión de la medida y reducir el sesgo del usuario.

Este algoritmo computacionalmente eficiente proporciona un método más rápido, que requiere aproximadamente una quinta parte las horas-hombre, de cuantificar el perinexus sin penalizaciones detectable a reproducibilidad en comparación con el proceso de segmentación manual. Además, el proceso de segmentación manual utiliza una medición cada 15 nanómetros para cuantificar anchura de perinexal, que puede llevar a bajo muestreo como la separación de la membrana de la perinexus puede cambiar substancialmente dentro de ese rango nm 15. Por el contrario, el programa automatizado tiene una resolución espacial igual a la de la modalidad de imagen, en este caso 2,9 píxeles por nanómetros a lo largo de la longitud de la perinexus, por lo tanto entregar un promedio más finalmente resuelto de perinexal ancho.

Mientras que las aplicaciones en el campo de la biología estructural cardiaca son emocionantes y prometedoras, aplicaciones de este algoritmo no se limitan a las imágenes TEM. Cualquier campo que requieren una medida exacta, alta resolución de dos bordes 2D cuasi-paralelos puede hacer uso de este algoritmo. El algoritmo podría utilizarse para cualquier seguimiento de patrones de erosión e inundaciones de Ribera de imágenes de satélite al desarrollo vascular con microscopía brightfield o fluorescentes. Una de las más prometedoras aplicaciones potenciales es en el campo de la cardiología y la medición de fracción de eyección ventricular (fe) con punto de atención cardiaca ecocardiografía. Actualmente, la técnica estándar es el método biplano de discos¹⁷, aunque un algoritmo más reciente, AutoEF, es actualmente la última cuantificación de EF método^18,19. Para el método biplano de discos, la cámara en cuestión está trazada manualmente y cuantificó usando el método modificado de Simpson, por el volumen total es calculado automáticamente por la adición de discos elípticos apiladas. La principal limitación con este método es que sólo puede devolver el área transversal total de la cámara deseada, con ninguna resolución para identificar las regiones específicas de interés y también requiere conocimientos y sustancial entrada humana. El método más nuevo, AutoEF, identifica y describe el borde del ventrículo mediante un algoritmo speckling 2D y luego calcula el área transversal ventricular. Este proceso, mientras que precisa y eficiente para medir el área ventricular gruesa, también tiene una limitación inherente similar de sólo medir el área transversal total. Este inconveniente principal limita capacidades de diagnóstico y tratamiento de los médicos. Por el contrario, el algoritmo presentado en este manuscrito puede identificar una línea de media y tiene una resolución equivalente a la resolución de la modalidad de imagen para detectar regiones específicas de interés. Esto es importante porque ecógrafos con resolución espacial de micrómetro son comercialmente disponibles^20,21, lo que implica que este algoritmo podría detectar anormalidades del movimiento de pared localizada en la resolución de micrómetros en lugar de centímetros. Mientras que esta aplicación necesita ser validado experimentalmente, es una de las aplicaciones más prometedoras de este algoritmo. De hecho, fácilmente podría combinarse con la capacidad de AutoEF de seguimiento de marcas en o los rastros manual utilizaron en planimetría manual para proporcionar información de mayor resolución en paralelo con datos EF convencionales.

Como versátil y aplicable como es el algoritmo actual, fue desarrollado para imágenes 2D. Sin embargo, como tecnologías imagenológicas continúan mejorando, hay una creciente demanda de tecnologías de cuantificación D 3 y 4. Por lo tanto, la siguiente iteración del algoritmo es adaptar el mismo enfoque, dilatando en serie una imagen binaria, para un objeto de 3 dimensiones, donde automáticamente definiendo una línea central está actualmente más allá de las capacidades de los programas actuales de proyección de imagen. Tal un algoritmo tendría amplias aplicaciones clínico y experimental en el campo cardíaco solamente, incluyendo ecocardiogramas cardiacos 3D^22,23, microscopia electrónica 3D^{24,25, 26}y 3D de resonancia magnética de^27,28,29.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Monitor de pantalla táctil	Dell	S2240T	Necesita lápiz óptico de punta blanda
Computadora de escritorio	Dell	Precision T1650	8 GB
de RAM Sistema operativo	Microsoft	Windows 7 Enterprise	de 64 bits Plataforma del
programa	Mathworks	Matlab R2015b	El programa puede ser incompatible con las versiones más recientes o antiguas de Matlab