Realización de múltiples modos de la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia

Summary

Aquí presentamos una guía práctica de la construcción de un sistema de microscopía integrado, que combina la proyección de imagen de epi-fluorescente convencional, proyección de imagen de una sola molécula basada en la detección de súper resolución y detección de una sola molécula de varios color, incluyendo transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de una sola molécula la proyección de imagen, en una puesta en marcha de una manera costo-eficiente.

Abstract

Microscopía de fluorescencia es una potente herramienta para detectar moléculas biológicas en situ y monitorear su dinámica y las interacciones en tiempo real. Además de microscopía de epifluorescencia convencional, han desarrollado varias técnicas de imagen para lograr objetivos experimentales específicos. Algunas de las técnicas ampliamente utilizadas incluyen la fluorescencia de una sola molécula resonancia transferencia de energía (smFRET), que puede reportar cambios conformacionales y las interacciones moleculares con la resolución del angstrom y basado en la detección de una sola molécula súper resolución (SR) la proyección de imagen, que puede mejorar la resolución espacial de aproximadamente diez a twentyfold comparado con microscopia de difracción limitada. Aquí presentamos un sistema integrado cliente-diseñado, que combina varios métodos de proyección de imagen en un microscopio, incluyendo proyección de imagen de epi-fluorescente convencional, una sola molécula basada en detección SR la proyección de imagen y detección de una sola molécula de varios color, incluyendo la proyección de imagen smFRET. Diferentes métodos de proyección de imagen pueden conseguirse fácilmente y reproducible elementos ópticos. Este montaje es fácil de adoptar por cualquier laboratorio de investigación en ciencias biológicas con la necesidad de rutina y diversos experimentos de imagen a un coste reducido y el espacio en relación con la construcción de microscopios distintos fines individuales.

Introduction

Microscopios de fluorescencia son herramientas importantes para la investigación de la ciencia biológica moderna y la proyección de imagen fluorescente se realiza de manera rutinaria en muchos laboratorios de biología. Por etiquetado de biomoléculas de interés con fluoróforos, directamente podemos visualizar al microscopio y registrar los cambios dependientes del tiempo en la localización, conformación, interacción y Asamblea estado in vivo o in vitro. Microscopios de fluorescencia convencionales tienen una resolución espacial limitada de la difracción, que es ~ 200-300 nm en la dirección lateral y ~ 500-700 nm en la dirección axial^....

Protocol

1. montaje y diseño del microscopio

1. Camino de la excitación
   Nota: La ruta de excitación incluye láseres, componentes de interferencia diferencial (DIC) de contraste, el cuerpo del microscopio y el brazo de iluminación.
   1. Preparar una tabla óptica aislado de vibraciones. Por ejemplo, una tabla de amortiguación estructural de 48 x 96 x 12'' da suficiente espacio para todos los componentes.
      Nota: Construir la instalación en una sala con control de temperatura (por ejemplo, 21,4 ± 0,55 ° C). Estabilidad de la temperatura es fundamental para mantener la alineación óptica.
   2. Instalar un cuerpo de microscopio que está....

Results

Este microscopio permite flexible y reproducible de la conmutación entre diferentes métodos de proyección de imagen. A continuación os mostramos imágenes de la muestra con cada módulo de proyección de imagen.

Figura 5 muestra la PSF de la molécula de parpadear en durante la adquisición del SR. Miles de tales imágenes se reconstruyen para generar la imagen final de SR (figura 5E<.......

Discussion

Este sistema de microscopio híbrido elimina la necesidad de comprar varios microscopios. El costo total para todas las partes, incluyendo la tabla óptica, mano de obra de instalación tabla, software y estación de trabajo, es aproximadamente $230.000. Piezas mecanizadas de costumbre, incluyendo la lente de mag y lentes 3-d, cuestan alrededor de $700 (el costo depende de las cargas reales en diversos institutos). Típicos disponibles en el mercado sistemas integran para microscopia de SR basados en la detección de una sola .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soporte de microscopio Nikon Ti-E	Nikon	Ti-E
	Nikon	100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Software de imagen de microscopía	Nikon	NIS-Elements Advanced Research/HC	HC incluye el módulo "JOBS", el módulo de adquisición programada que se utiliza para la obtención de imágenes SR.
El brazo de iluminación	Nikon	Ti-TIRF-EM Unidad de iluminación motorizada M	Este brazo tiene una ranura para una lente de aumento
Bloque de análisis	Nikon	Ti-A	Esto se instala en la torreta del filtro.
Sistema de corrección de deriva Z	Nikon	PFS	Este sistema está compuesto por el motor paso a paso en la boquilla del objetivo, un LED IR y un detector.
Tablero óptico de sobremesa	TMC	783-655-02R
Bases de mesa ópticas	TMC	14-426-35
láser de 647 nm	Cobolt	90346 (0647-06-01-0120-100)	Diodo láser modulado de 647 nm 120 mW incl. cabezal láser, caja de control CDRH, cable USB y fuente de alimentación (unidad de fuente de alimentación)
de	561 nm	1280721	OBIS 561nm LS 150mW Láser
	de 488 nmCobolt	90308 (0488-06-01-0060-100)	Diodo láser modulado 488nm 60mW incl. cabezal láser, caja de control CDRH, cable USB y fuente de alimentación (unidad de alimentación)
Cristalizador	láser de 405 nm	DL405-025-O	405 (+/-5)nm, 25mW, Circular, M2 < 1.3, bajo nivel de ruido, CW, TTL hasta 20MHz. 2 conectores BNC para TTL & Ajuste analógico
Disipador de calor	Cobolt	11658 (HS-03)	Dos unidades, Disipador de calor sin ventilador HS-03, Disipador de calor para láseres de 647 nm y 488 nm
Disipador de calor	coherente	1193289	Obis con ventilador, 165 x 50 x 50 mm para el láser de 561 nm
CAB-USB-miniUSB	Cobolt	10908	Dos unidades, cable de comunicación para láseres de 647 nm y 488 nm
de aluminio para ajuste de altura	McMaster-Carr	9146T35	Multipropósito 6061 Aluminio, Barra Rectangular, 4MM X 40MM, 1' de Largo para elevar Aluminio láser de 561 nm
para ajuste de altura	McMaster-Carr	8975K248	Multipropósito 6061 Aluminio, 1-1/4" de espesor x 3" de ancho x 1' de largo para elevar Cable BNC láser de 405 nm
	L-com	CC58C-6	Cable coaxial RG58C, BNC macho / macho, adaptador BNC de 6,0 pies
	L-com	BA1087	Adaptador coaxial, mamparo BNC,
adaptador SMA a BNC conectado a	HOD	SMA-870	Los láseres Cobolt MLD tienen interfaz SMA, por lo que este adaptador se utiliza para la conexión BNC.
Adaptador SMB a BNC	Microondas Fairview	FMC1638316-12	Enchufe SMB a cable de mamparo hembra BNC RG316 en 12 pulgadas para láseres Obis coherentes
Tarjeta de adquisición de datos	Instruments	PCI-6723	13 bits, 32 canales, 800 kS/s Dispositivo de salida analógica para controlar láseres, LED DIC, etc
Controlador de rueda de filtro de barrera	Sutter Instrument	Lambda 10-B	Cambiador
de filtro ópticoDivisor de emisiones	Cairn	OptoSplit III
Divisor de haz dicroico	Chroma	T640LPXR-UF2	Divisor de haz dicroico que separa la emisión roja de la emisión verde en OptoSplit III
Divisor de haz dicroico	Chroma	T565LPXR-UF2	Divisor de haz dicroico que separa la emisión verde y roja de la emisión azul en OptoSplit III
Filtro de emisión	Chroma	ET700/75M	Dos unidades, Filtro de emisión para emisión roja (como Alexa Fluor 647) en OptoSplit III, así como en la rueda de filtros de barrera
Filtro de emisión	Chroma	ET595/50M	Dos unidades, Filtro de emisión para emisión amarillo/verde (como Cy3B) en OptoSplit III, así como en la rueda de filtros de barrera
Filtro de emisión	Chroma	ET525/50M	Dos unidades, Filtro de emisión para emisión azul (como Alexa Fluor 488/GFP) en OptoSplit III, así como en la Rueda de filtro de barrera
Filtro de emisión	Semrock	FF02-447/60-25	Filtro de emisión para emisión violeta (como DAPI/Alexa Fluor 405), instalado en la Rueda de filtro de barrera
Dichroico divisor de haz	Chroma	zt405/488/561/647/752rpc-UF3	Divisor de haz dicroico multibanda para excitaciones láser de 647, 561, 488 y 405 nm dentro del cuerpo del microscopio
Juego de filtros DAPI	Chroma	49000	instalado en el cuerpo del microscopio
Nikon láser/TIRF filtercube	Chroma	91032
590 filtro de paso largo	Chroma	T590LPXR-UF1	para combinar láser de 647 nm y láser de 561 nm
Filtro de paso largo 525	Chroma	T525LPXR-UF1	para combinar láseres ya combinados de 647 nm y 561 nm con láser de 488 nm
Filtro de paso largo 470	Chroma	T470LPXR-UF1	para combinar láseres ya combinados de 647 nm, 561 nm y 488 nm con láser de 405 nm
Filtro de limpieza láser (647)	Chroma	zet640/20x	para limpiar otras longitudes de onda del láser de 647 nm
Filtro de limpieza láser (488)	Semrock	LL01-488-25	para la limpieza de otras longitudes de onda del láser de 488 nm
Fuente de luz LED	Excelitas	X-Cite120LED	utilizado solo para imágenes DAPI
Montaje en espejo	Newport	SU100-F3K
Postes ópticos	Newport	PS-2
	de
potencia	Newport	PMKIT	para medir la potencia del láser
Montura combinadora de haces dicroica	Edmund Optics	58-872	Montura en C Montura cinemática, para sujetar combinadores de haces dicroicos en el conjunto de excitación láser
Anillo de retención	Thorlabs	CMRR	utilizado para monturas dicroicas de combinadores de haces
Placa adaptadora de fibra	Thorlabs	SM1FC	FC/PC Placa adaptadora de fibra con rosca externa SM1 (1.035"-40)
Montura traslacional del eje Z	Thorlabs	SM1Z	Montura de traslación del eje Z, lente
doble acromática	Thorlabs	AC050-008-A-ML	Ø 5 mm, jubones acromáticos montados, recubiertos de AR: Placa de jaula de 400 - 700 nm
	Thorlabs	CP1TM09	Placa de jaula de 30 mm con roscas internas M9 x 0.5, 8-32 varilla de ensamblaje de jaula
	de grifo Thorlabs	ER4	Varilla de ensamblaje de jaula, 4" de largo, & Oslash;
Soporte de montaje de jaula	Thorlabs	CP02B	Soporte de montaje de jaula de 30 mm
Fibra óptica monomodo	Thorlabs	P5-405BPM-FC-2 Cable de	conexión, PM, FC/PC a FC/APC, 405 nm, Panda, fibra
óptica multimodo de	Thorlabs	M42L01	Ø 50 y micro; m, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Cable de conexión de fibra,
lente doble acromática de 1 m (lente magnética)	Thorlabs	ACN127-025-A	ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø Doblete acromático de 1/2", ARC: 400-700 nm, una lente cóncava en la "lente magnética"
Lente doble acromática (lente magnética)	Thorlabs	AC127-050-A	f=50.0 mm, Ø Doblete acromático de 1/2", ARC: 400-700 nm, una lente convexa en el anillo de retención "mag lens"
	Thorlabs	SM05PRR	SM05 Anillo de retención de plástico para Ø Tubos y monturas de lente de 1/2", para "lente magnética"
Tornillo con punta de nailon	Thorlabs	SS3MN6	M3 x 0,5 Tornillo de fijación con punta de nylon, 6 mm de largo, para sujetar "lente 3D"
Lente 3D	Óptica láser CVI	RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700	f=10 m, lente cilíndrica rectangular
Cámara EMCCD	Andor	iXon Ultra 888
100 nm perlas multicanal	Thermo	T7279, TetraSpeck microesferas colorante
rojo	Thermo	Alexa Fluor 647
tinte amarillo-verde	GE Healthcare	Cy3
colorante verde	Healthcare	Cy3B
tinte azul	Thermo	Alexa Fluor 488