Artículo de método

Un análisis de anaerobios biosensores para la detección de mercurio y cadmio

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DOI:

10.3791/58324

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17 de diciembre de 2018

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1Department of Biology, University of Ottawa

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para utilizar un biosensor microbiano anaerobio de células completas para evaluar diferentes variables ambientales afectan la biodisponibilidad de Hg y Cd a las bacterias en ambientes anóxicos.

Resumen

Biodisponibilidad de mercurio (Hg) de microbios es un paso clave para tóxicos Hg biomagnificación en redes tróficas. Cadmio (Cd) transformaciones y biodisponibilidad para las bacterias controlan la cantidad que se acumulará en cultivos de alimentos básicos. La biodisponibilidad de estos metales depende de su especiación en solución, pero más particularmente bajo condiciones anóxicas donde Hg es metilado para monomethylmercury tóxicos (MeHg) y Cd persiste en la rizosfera. Biosensores microbianos celulares dan una señal cuantificable cuando un metal entra en el citosol y por lo tanto es herramientas útiles para evaluar la biodisponibilidad del metal. Por desgracia, mayoría de biodetección los esfuerzos hasta ahora ha sido obliga a oxic ambientes debido a la limitada capacidad de las proteínas existentes de reportero para funcionar en ausencia de oxígeno. En este estudio, presentamos nuestro esfuerzo para desarrollar y optimizar un ensayo de biosensores de célula entera capaz de funcionar anaeróbicamente que puede detectar metales bajo condiciones anóxicas en tiempo cuasi-real y dentro de las horas. Describimos cómo el biosensor puede ayudar a evaluar cómo químicas variables relevantes para el ciclo ambiental de metales afectan su biodisponibilidad. El siguiente protocolo incluye métodos para (1) preparar Hg y Cd estándares bajo condiciones anóxicas, (2) preparan el biosensor en ausencia de oxígeno, (3) diseño y ejecutan un experimento para determinar cómo afecta a una serie de variable biodisponibilidad Hg o Cd y (4) para cuantificar e interpretar datos de biosensor. Mostramos las gamas lineares de los biosensores y proporcionar ejemplos que muestran la capacidad del método para distinguir entre toxicidad y biodisponibilidad de metales utilizando cepas metal-inducible y constitutivas.

Introducción

Mercurio (Hg) es un contaminante global y su biodisponibilidad a Hg metilación microbios es el primer paso hacia su biomagnificación a través de redes tróficas y sus posibles efectos neurotóxicos en humanos y fauna1. Se piensa actualmente que metilación del Hg microbiana es un proceso intracelular que requiere: i) las especies de Hg al ser biodisponible2,3,4,5,6,7 y ii) para la célula de ser fisiológicamente capaz de metilación de Hg8,9,10. Cadmio (Cd) se bioacumula en los organismos, pero no no biomagnifica en foodwebs y es ampliamente utilizado en procesos industriales y comerciales que comúnmente causan exposición aguda en las personas y el medio ambiente11. Aunque microbios desempeñan varias funciones clave en el destino de Hg en el ambiente, la mayoría de los estudios en Cd geoquímica y Ecotoxicología centrarse en eukaryotes microbianos12. El consumo de cultivos agrícolas (por ejemplo, arroz) es la principal fuente de exposición directa al cadmio; en este caso, la biodisponibilidad de Cd a los microbios de la rizosfera influye directamente en la cantidad las plantas pueden acumular13.

Vías de transporte de Hg son complejas y posiblemente implican un transporte activo paso14. Cuando participa un transportador, el trabajo reciente sugiere que HgII utiliza un ZnII o MnII transportador7,15,16,17. Mientras que el CdII se presume para ser transportado accidentalmente en el citosol a través de vías de transporte de metales divalentes (especialmente manganesoII o ZnII), de mecanismos de CdII transportan interior las células permanecen vía de transporte especulativo y no específicos del Cd ha sido identificado13,18. Independientemente de la naturaleza de los transportadores implicados tres factores mecanicistas en última instancia determinan la capacidad de los metales para entrar en una célula: i) la especiación de metales en solución2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) las propiedades biophysiochemical de la membrana de la célula17,24,25,26,27,28,29 ,30,31y iii) la capacidad del metal acceder a un sitio de transporte7,32. CD y Hg están poco probable que existe como iones libres en condiciones fisiológicamente relevantes microbianas debido a su alta afinidad para disuelto orgánico materia (DOM), quelantes de contaminantes (por ejemplo, EDTA) o reducido sulfuro moieties33, 34,35 (CdII puede existir como una forma o ion ion-pares libres en ausencia de estos ligandos). Hay una falta de métodos eficaces para determinar cómo estas especies metálicas son biodisponibles en condiciones relevantes a su suerte en el medio ambiente. Por ejemplo, Hg es desnaturalizado bajo condiciones anaeróbicas14y cadmio y Hg son metales blandos (o clase B cationes), que requieren que la especiación sea investigado bajo condiciones que mantienen la integridad de grupos reducidas del sulfuro.

Biosensores microbianos son células bacterianas que emiten una señal cuantificable en respuesta a las concentraciones intracelulares de un metal, en este caso Hg o Cd. Como tal, son herramientas ideales para entender cómo los metales entrar en una célula36, siempre que las condiciones de exposición son cuidadosamente controladas para. Biosensores de Hg típicamente contienen fusiones de genes entre los circuitos de regulación de la mer-operon (incluyendo los genes que codifican para el regulador de la transcripción MerRas así como el operador y el promotor regiones del operon) y genes de reporting (por ejemplo, Lux, gfp, lac genes). Cuando Mercurio está presente en el citoplasma, se unirá a MerR, dando por resultado la transcripción de los genes informes y señal subsecuente producción19,37. Biosensores específicos de Cd están diseñados generalmente usando la cadC, cadAC, zntA o zntR codificado de los reguladores de transcripción38, pero cabe destacar que MerR tiene una afinidad más baja, pero cuantificable a Cd5. Debido a la restricción aerobia de la mayoría utiliza proteínas fluorescentes o luminiscentes reportero, hasta biosensores microbianos recientemente seguía siendo incapaces de ofrecer penetraciones en la biotransformación de los metales bajo condiciones anóxicas. Esto hace anaerobio detección de biodisponibilidad de metales muy difícil en un rango de condiciones relevantes a su destino ambiental, específicamente en la presencia de redox sensibles ligandos (por ejemplo, sulfuros y tioles)4, 5 , 39.

Para aliviar el obstáculo metodológico de viva imagen en ausencia de oxígeno, Drepper et al. (2007) han desarrollado una proteína fluorescente base de flavin (FbFp), basado en el dominio de tensión de oxígeno luz de SB2 proteína de p. putida. Esta familia de proteínas que es capaces de emitir fluorescencia en ausencia de oxígeno40. Basándose en el trabajo de Drepper et al., nuestro laboratorio ha diseñado un biosensor anaeróbico que permite el estudio de biodisponibilidad de Hg en condiciones anóxicas y óxicas y en un amplio rango de salinidad 17. En el documento actual, se describe cómo preparar y utilizar el biosensor para probar la influencia de las variables ambientales en la biodisponibilidad de Hg o Cd. Aunque hemos desarrollado el biosensor para HgII, optamos por realizar experimentos con CdII como medio para llamar la atención del lector al hecho de que los biosensores también pueden responder a múltiples factores estresantes que ocurren en el medio ambiente matrices; en este caso CdII fue investigado porque se sabe para enlazar con el regulador transcripcional MerR5. Aquí, mostramos calibración representativa y funcionales rangos lineales con respecto a cualquiera de los dos metales. También damos un ejemplo cuando resultados de biosensor son concluyentes (MgII y MnII sobre biodisponibilidad de Hg) y concluyente (ZnII sobre biodisponibilidad de Hg).

Protocolo

1. crecimiento medios y preparación de medios de exposición

  1. Para 250 mL de medio de cultivo:
    Nota: Si la solución de elementos traza #1 y #2 oligoelementos solución ya están preparados, vaya al paso 1.1.5.
    1. Preparar solución de oligoelementos 1 en un matraz aforado limpio (200 mL) para contener la molaridad final de 1.5 x 10-3 M de Na2MoO4, 6.5 x 10-4 M de Na2SeO4, 5 x 10-3 M H3BO 3y 0,1 M de NaOH.
      PRECAUCIÓN: Bases fuertes (NaOH) son corrosivos. Hacer seguro de pesaje cuando los reactivos para que la molaridad final representa los principales elementos traza; Mo, Se y B.
    2. Bajo un campo estéril, filtro esterilizar con un filtro de jeringa 0,22 μm polyethersulfone en un frasco de plástico estéril limpiar/politetrafluoroetileno (PTFE).
    3. Preparar la solución de elementos traza #2 en un matraz aforado limpio (200 mL) para contener la molaridad final de 0,01 M MnSO4, 5 x 10-4 M de ZnSO4, 3.25 x 10-3 M de CoCl2, 6,25 x 10-3 M NiCl 2y 0,1 M de H2por4.
      PRECAUCIÓN: Los ácidos fuertes (H2SO4) son corrosivos. Hacer seguro de pesaje cuando los reactivos para que la molaridad final representa los principales elementos traza; MN, Zn, Co y Ni.
    4. Bajo un campo estéril, filtro esterilizar con un filtro de jeringa 0,22 μm polyethersulfone en un frasco limpio de vidrio.
    5. Bajo un campo estéril, en una botella de vidrio limpia estéril (mínimo 250 mL); Añadir 200 mL de agua ultrapura, 42,5 mL de sales mínimo M9 (x 5; Véase Tabla de materiales), 2,5 mL de glucosa M 2, 125 μl de 2 M MgSO4, 1200 μl de 0,6 M tiamina HCl de una alícuota congelada de (-20 ° c), 1.25 mL de NaNO de 4 M3 , 770 μl de 0.075 M L-leucina / isoleucina L / solución de valina 250 μl oligoelementos #1, 250 μl de elemento #2y 250 μl de sódico de 0.01 M de sal.
      Nota: Todos los reactivos en el paso 1.1.5 deben estar preparados antes y filtro esterilizado usando un filtro de jeringa de polyethersulfone de 0,22 μm. Agua ultrapura puede esterilizarse mediante autoclave.
    6. Tomar la botella de vidrio que ahora contiene solución de paso 1.1.5. libremente colmo y ciclo a través del bolsa de aire de la cámara anaerobia .
    7. En la cámara de anaerobio, añadir 15 μl de 0,225 M FeSO4 0,2 M H24, tapa botella herméticamente y agite hasta que desaparezcan todos los precipitados blancos.
      Nota: Todos los reactivos en el paso 1.1.7 deben estar preparados antes y filtro esterilizado usando un filtro de jeringa de polyethersulfone de 0,22 μm. Almacenar el 0,225 M FeSO4 en 0,2 M H2hasta4 en la cámara de anaerobios.
    8. Retire la tapa de la botella, espere 1 minuto para el cambio, vuelva a colocar la tapa de la botella de aire y luego agite vigorosamente. Repita este paso una vez.
    9. Sujete la tapa firmemente en la botella, quitar de la cámara anaerobiay almacenar el frasco en nevera (4 ° c) hasta su uso.
    10. Medio de crecimiento debe rehacer una vez a la semana repitiendo los pasos 1.1.5 a 1.1.9.
  2. Para hacer 100 mL de medio de exposición de 2 x 50 mL tubos de centrífuga de polipropileno estéril cónico:
    Nota: Se recomienda medio exposición preparada en el día del ensayo de la exposición para minimizar el riesgo de contaminación, sin embargo puede ser hecho por adelantado y almacenado en el refrigerador.
    1. En la cámara anaerobia, a cada 50 mL tubo de centrífuga añadir 42 mL de agua ultrapura anaerobio, fregonas de 350 μl de 1 M sodio Beta-Gylcerophosphate de una alícuota congelada (-20 ° c), 2 mL de 1 M libre de ácido, 50 μL de 1 M (NH4)2hasta4 , 125 μL de 2 M de glucosa, 300 μL de KOH de 2,5 M y 200 μL de NaOH de 2,5 M.
      Nota: Todos los reactivos en el paso 1.2.1 deben estar preparados antes y filtro esterilizado usando un filtro de jeringa de polyethersulfone de 0,22 μm. Agua ultrapura puede ser esterilizado mediante autoclave de calor. 2,5 NaOH de M y 2,5 M NaOH deben almacenarse en botellas de plástico/PTFE. Todos los reactivos enumerados deben almacenarse en la cámara de anaerobio excepto sodio Beta-Gylcerophosphate, que se almacena en un congelador (-20 ° c). En general, es buena práctica dejar todas las piezas de plástico o vidrio y contenedores por varios días en la cámara de anaerobia para asegurar que no hay rastros de oxígeno.
    2. Tapa los tubos de centrífuga de 50 mL, agite bien y sacar una alícuota de 10 mL para medir el pH. El pH medido de este medio de exposición siempre debe medir 7.00 ± 0.02 a 25 ° c. Si el pH no mide dentro de esta gama, vuelva a ajustar el volumen de agregado 2,5 M de KOH para corregir para esto.
      Nota: Nunca valorar la solución para corregir el pH con una sonda de pH. sondas de pH representan una fuente de contaminación para el medio de exposición. El pH debe ser siempre un producto de los reactivos añadidos en el paso 1.2.1.
  3. Preparar una solución stock de 5-10 mM de NaNO3 y dejar en cámara de anaerobio para ser utilizado durante el tiempo del ensayo de la exposición.
    Nota: Es más fácil diluir un concentrado primario NaNO3 estándar en lugar de hacer un 5-10 mM NaNO3 patrón primario.

2. preparación de mercurio y cadmio.

  1. Preparar una solución de mercurio (HgII) 4-8 μm en 0,2 M de H2SO4.
    1. Preparar un estándar de Hg2 + haciendo un milimolar (1-10 mM) HgCl2, HgNO3 HgSO4 solución 0,2 M de H2SO4.
      PRECAUCIÓN: El mercurio es altamente tóxico y H2por4 es corrosivo. Operar en campanas con equipo de protección personal necesario.
    2. En una botella PTFE, diluir estándar de 2.1.1. a 0,2 M de H2SO4 para obtener una concentración dentro del rango de 4 a 8 μm Hg2 +.
      Nota: El ácido utilizado debe ser grado analítico H2hasta4.
    3. La concentración de Hg de 2.1.2 debe validarse utilizando un analizador de mercurio (véase Tabla de materiales).
      Nota: Pueden utilizar otros métodos para validar la concentración de Hg.
  2. Preparando un Cd de 10 μmII solución 10 mM de H2SO4.
    1. Preparar un estándar primario de CdCl2 (rango de 10-50 mM para el pesaje exacto de polvo) en 0,1 M de H2SO4.
    2. En una serie de diluciones seriadas en ácido limpio enjuagado 20 mL viales de vidrio borosilicato con negro tapones fenólicos con PTFE frente forros de caucho, diluir el estándar de 2.2.1 a 10 μm Cd2 +. Asegúrese de que la concentración de H2por lo que permanece de4 en cada dilución seriada posterior 10 mM.

3. preparación del Biosensor para análisis de exposición anaerobio

  1. Placa el biosensor de mercurio inducible (E. coli NEB5α que PUC57merR-PpFbFp) y el biosensor constitutivamente expresado (E. coli NEB5α que PUC19Balch-PpFbFp) de-80 ° c cryostock en platos de caldo de lisogenia que contiene 120 ampicilina ug/mL. Ver nuestro trabajo publicado anteriormente para obtener más información sobre la producción de estos biosensores17.
  2. En 4:30-17:00, inocular un cultivo en 10 mL de LB (+ amp) y crecer durante la noche.
    Nota: A partir de un plato toma 2 días para preparar la cultura anaerobia para el ensayo de exposición (es decir, una cultura comenzó el lunes por la tarde (4:30-17:00) estará listo para el ensayo de exposición al mediodía el miércoles). Los siguientes pasos son las requiere técnicas microbiológicas necesarias para preparar las culturas en el día del ensayo de la exposición.
    1. Una colonia de la cultura de la placa y añadir a 10 mL de caldo de lisogenia (LB) con 21 μl de una solución madre de 100 mg/mL ampicilina de sal de sodio (concentración final es de 210 amp ug/mL) en un tubo de cultivo estéril.
    2. Coloque el cultivo en un Incubador/agitador y crecer durante la noche a + 37 ° c con agitación a 220 rpm.
  3. A la mañana siguiente a las 9-10 AM, suspender la cultura y crecer anaeróbicamente durante todo el día (20% de inóculo).
    1. Incorporar la cultura de la incubadora (paso 3.2.1) y el medio de crecimiento (paso 1.1.9) la cámara anaerobia.
    2. Añada 8 mL de fresco medio del crecimiento y la ampicilina (210 μg/mL) en un tubo estéril de Balch.
    3. Recolectar 2 mL del cultivo crecido durante la noche y transferencia en un tubo de microcentrífuga de 2 mL. Centrifugar a 10.000 paso RCF durante 90 segundos, volcar el sobrenadante y resuspender en 2 mL de fresco medio de crecimiento. Añadir la cultura resuspendida al Balch tubo que contenga 8 mL de fresco medio del crecimiento y la ampicilina.
    4. Utilizando una técnica estéril, coloque con cuidado un tapón de caucho en el tubo de Balch. Retire de la cámara anaerobia y coloque en una incubadora/la coctelera y crecer anaeróbicamente hasta 3-17:00 a + 37 ° c con agitación a 220 rpm.
  4. Entre 3 y 17:00, realizar un inóculo anaerobio 1% en fresco medio de crecimiento y crecen durante la noche.
    1. Poner el tubo de Balch (paso 3.3.4) en la cámara anaerobia junto con medio de cultivo. Añadir 100 μl de la cultura a 10 mL de fresco medio de crecimiento (1% inóculo) con amplificador (amp de 210 ug/mL) en un tubo estéril de Balch.
    2. Utilizando una técnica estéril, coloque con cuidado un tapón de caucho en el tubo de Balch. Retire de la cámara anaerobia, coloque en una incubadora/la coctelera y crecer durante la noche a + 37 ° c con agitación a 220 rpm.
  5. Entre el 9 y 10:00, Resuspender el cultivo para crecer anaeróbicamente durante todo el día (20% de inóculo).
    1. Incorporar la cultura de la incubadora (paso 3.4.1) y el medio de crecimiento (paso 1.1.9) la cámara anaerobia.
    2. Añadir 8 mL de medio de cultivo y la ampicilina (amp de 210 ug/mL) en un tubo estéril de Balch.
    3. Recoger 2 m de la cultura cultivada durante la noche y traslado en un tubo de microcentrífuga de 2 mL. Centrifugar a 10.000 x g durante 90 segundos, volcar el sobrenadante y resuspender en 2 mL de fresco medio de crecimiento. Añadir la cultura resuspendida al Balch tubo que contenga 8 mL de fresco medio del crecimiento y la ampicilina.
    4. Utilizando una técnica estéril, coloque con cuidado un tapón de caucho en el tubo de Balch. Retire de la cámara y coloque en una incubadora/la coctelera y crecer anaeróbicamente a 37 ° c con agitación a 220 rpm.
  6. Vigilar el crecimiento de la cultura utilizando un espectrofotómetro (paso 3.5.4) hasta llegar a un OD600 de 0,6 . Asegúrese de cultura vortex antes de cada lectura de OD.
    Nota: Este paso tiene 3-4 horas, y debe estar preparado el medio de exposición (paso 1.2) durante este tiempo, así como el análisis de la exposición (paso 4.1).
  7. Detener el crecimiento cuando el cultivo alcanza un OD600 de 0,6 (±0. 1) (crecimiento 3-4 horas de espera).
    1. Llevar el tubo en la cámara anaerobia (paso 3.6) y la cultura de transferencia en tubos de microcentrífuga de 2 mL x 2. Centrifugar a 10.000 x g durante 90 segundos, volcar el sobrenadante y resuspender en 2 x 2 mL de fresco medio de exposición.
    2. Repita el lavado paso 3.7.1. vez para eliminar cualquier rastro del medio de cultivo.
  8. Combinar ambos tubos de microcentrífuga de cultivo celular (paso 3.7) en un frasco estándar de PTFE de 7 mL para obtener Valores de Biosensor para ser utilizado en el Ensayo de exposición (paso 4).
    Nota: Asegúrese de mezclar el Biosensor Stock transfiriendo bien pero suavemente hacia adelante y hacia atrás antes de su uso. El método puede hacer una pausa aquí para hasta una hora.

4. exposición ensayo

  1. Diseño de un esquema de la placa.
    Nota: Asegúrese de tener todo pipeteo valores calculados y las poblaciones de preparado antes de comenzar el ensayo de la exposición. Cómo diseñar correctamente un experimento y lo controla para incluir se detalla en el texto. Además, el experimento no se iniciar si hay oxígeno en la cámara anaeróbica indicada en el monitor de anaerobio.
    1. Diseño el diseño de la placa según una plantilla bien 96. Para ejecutar experimentos en técnicas repeticiones de 3, esto permitirá que para 32 diferentes tratamientos, que está mejor representado por una cuadrícula de 4 x 8 para configurar viales (ver figura 1).

figure-protocol-1
Figura 1: un 96 placa bien (izquierda) y una cuadrícula de 4 x 8 correspondiente que contiene PTFE viales (derecha) para ser transferidos a la placa de. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nota: Cuando la prueba para el papel de una variable en la absorción de Hg con el biosensor inducible mercurio; dos tratamientos son necesarios para cada variable: el tratamiento (biosensor + Hg + variable + nitrato) y su tratamiento en blanco (biosensor + variable + nitrato). Cuando la función de una variable sobre la fisiología de la célula utilizando el biosensor constitutiva, dos tratamientos son necesarios para cada variable: el tratamiento (biosensor + Hg + variable + nitrato) y ( en blanco ) tratamiento biosensor + variable + Hg). Mercurio puede ser reemplazado con cadmio. Hg o Cd se convertirá en la variable al realizar una curva de calibración. La constitutiva y inducible biosensores no es necesario ejecutar al mismo tiempo (en el mismo diseño de la placa). Un ejemplo de plantilla para el diseño de placa y rejilla de 4 x 8 correspondiente al probar un rango de concentración de magnesio (variable) se proporciona en la tabla 1).

123456789101112
unHG inducida por nitrato, biosensor + Hg + 0 mM MgHG inducida biosensor + nitratos + 0 mM MgBiosensor constitutiva + Hg + nitrato + 0 mM MgBiosensor constitutiva + Hg + 0 mM Mg
bHG inducida biosensor + Hg + nitratos + 0,1 mM MgHG inducida biosensor + nitratos + 0,1 mM MgConstitutiva biosensor + Hg + nitrato + 0,1 mM MgBiosensor constitutiva + Hg + 0,1 mM Mg
cHG inducida por nitrato, biosensor + Hg + 1 mM MgHG inducida biosensor + nitratos + 1 mM MgBiosensor constitutiva + Hg + nitrato + 1 mM MgBiosensor constitutiva + Hg + 1 mM Mg
dHG inducida biosensor + Hg + nitratos + 10 mM MgHG inducida biosensor + nitratos + 10 mM MgBiosensor constitutiva + Hg + nitrato 10 mM MgBiosensor constitutiva + Hg + 10 mM Mg
e

Tabla 1: Una composición de ejemplo placa para usar el biosensor para probar la biodisponibilidad de Hg (5 nM) en un gradiente de magnesio (0-10 mM)

  1. Configurar la cuadrícula de 4 x 8 según el diseño de la placa de ensayo.
    1. Viales de lugar 7 mL PTFE estándar en la bandeja.
      Nota: PTFE viales deben ser ácido lavado calor esterilizado antes del uso. Los frascos deben ser resuelto únicamente mediante la manipulación de la parte exterior del frasco.
    2. Añadir a cada frasco, el volumen medio de exposición correspondiente a cada tratamiento.
      Nota: En una exposición con un volumen total de 2.000 μl (2 mL), el mayor medio de exposición es: μl de medio de exposición = 2.000 μl – tratamiento (en blanco) μl. (por ejemplo, la exposición media μl = 2.000 – 100 μl (biosensor) – 40 μl (nitrato) – 100 μl (Hg ) – 100 μl (variable (por ejemplo, MgSO4)) = μl de 1660). Asegúrese de que el volumen agregado de la variable prueba no exceda del 5% (100 μL) del volumen final.
    3. A cada frasco, añadir el correspondiente volumen de la solución de la variable química para ser probado de acuerdo con el diseño de la placa.
    4. En el paso 1.3, añadir nitrato a cada frasco para que la concentración final es de 200 μm (40-80 μL). Excluir este paso cortes de tratamiento de biosensor constitutivade.
    5. En el paso 2.1 o 2.2, agregar Hg (5 nM cuando una variable) o Cd (300 nM cuando una variable) a los viales de acuerdo con el diseño de la placa. Excluir este paso cortes de tratamiento de inducible biosensor de mercuriode.
      1. Cuando use Hg, hacer el balance de 4-8 μm y agite bien. Diluir la solución en medio de la exposición en un frasco PTFE de 7 mL en 100-250 nM para hacer un trabajo solución de Hg. De esta solución de trabajo agregar Hg a los viales necesarios. En este caso, una curva de calibración de Hg desde 0 hasta 12.5 nM.
        Nota: Cuando por efecto de una variable sobre biodisponibilidad Hg o Cd, asegúrese de que el [Hg] o [Cd] se mantiene constante a través de todos los tratamientos. Al agregar Hg o Cd, asegúrese de usar una pipeta pero nunca toque el medio de exposición en los frascos.
  2. Agite manualmente en un movimiento orbital.
    Nota: El experimento puede hacer una pausa ahora dependiendo el tiempo necesario para Hg o Cd para identificar en la solución. Si se deja por más de una hora, coloque los tapones de PTFE en los frascos PTFE para evitar la evaporación/contaminación.
  3. Pipetee suavemente Biosensor Stock para asegurar la homogeneidad. Añada 100 μl del Stock de Biosensor a cada frasco. Agite orbitally manualmente.
  4. Preparar al lector de placa caliente para leer con los siguientes criterios: temperatura en 37˚C, cinética para 10 horas con lectura cada 2,5-5 minutos con agitación orbital entre Lee y las mediciones de fluorescencia con un excitación de fluorescencia de 440 nm y un emisión de 500 nm.
  5. Pipetee 200 μL de cada frascos PTFE en la cuadrícula de 4 x 8 en los pocillos correspondientes de la placa de la pozo 96 (claro negro, 96-Well-superficie microplacas de fondo no vinculante). Pipeta y hacia atrás 5 veces antes de transferir cada 200 μl.
    Nota: En lugar de desechar la punta de la pipeta, deje la punta de la pipeta en el frasco PTFE para seguimiento de progreso de pipeteo.
  6. Coloque la placa de la pozo 96 en la bandeja del lector de la placa, luego coloque la tapa sobre la placa de la pozo 96 y empezar el ensayo.

5. cuantificación de los datos

  1. La fluorescencia de cada tratamiento en cada momento debe ser corregida para cada ruido bien individual y cubierta para el tratamiento blanco.
    1. La fluorescencia para cada punto del tiempo (t) de cada tratamiento (T) debe ser traducida para tener en cuenta la fluorescencia inicial (t0) de la primera vez punto de cada bien, entonces un promedio en los 3 tratamientos Replica (r1- r3 ). Este promedio de tratamiento entonces debe ser cubierto a medio tratamiento en blanco (TB) traducido de la misma manera (ecuación 1).

Fluorescencia (t) = promedio(Tr1(t) – Tr1()t0), Tr2(t) – Tr2 ()t0), Tr3(t) – Tr3()t0)), media(TB R1 (t) – TBr1()t0), TBr2(t)– TBr2( ) t0 ), TBr3(t) – TBr3()t0)) (1)

Nota: Esto debe hacerse como una función de hoja de cálculo. Adecuada propagación de error se debe calcular también para cada momento.

  1. Gráfico de la fluorescencia corregida de cada tratamiento en función del tiempo

figure-protocol-2
Figura 2: corrige datos de fluorescencia en función del tiempo. Fluorescencia se mide como unidades de fluorescencia relativa (RFU) emitidas por e. coli NEB5α que pUC57merR-Pp (cepa Inducible) en el tiempo con la incorporación de HgII (0-12.5 nM) bajo condiciones anaeróbicas. La fluorescencia fue que la media de 3 técnicas replica a 37 ° c. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nota: Hay ningún 0 nM Hg valor en el gráfico, y otros de las concentraciones de Hg han sido borradas 0 nM Hg como blanco de tratamiento. Por lo tanto, 0 nM Hg representa el eje x y cualquier fluorescencia positiva representa de Hg dada cualquier variable de la fluorescencia. Es opcional no en blanco de la fluorescencia de esta manera, pero las curvas fluorescentes dará engañosas curvas de fluorescencia, si la variable probada tiene fluorescencia del fondo (es decir, disuelve la materia orgánica se va emitir fluorescencia y si hay no en blanco que contiene sólo las células y la materia orgánica disuelta, aumento de la concentración de materia orgánica disuelta de tratamiento aumentará la señal fluorescente).

  1. Cuantificar el pico de fluorescencia. Un pico de fluorescencia cuantificable por lo general se producirá después de 2.5-4 horas, representando la energía expendida el consumo de nitratos de μm 200 todos como aceptor terminal de electrones. Este pico debe ser cuantificada y representa el valor de fluorescencia final de ese específico tratamiento.
    Nota: ningún pico de fluorescencia se observa en el caso (es decir, no biodisponibilidad de Hg), la fluorescencia del tratamiento en el momento del pico de fluorescencia del control (es decir, ninguna variable agregada o 5nM Hg) debe ser cuantificada. Alternativamente, si hay inducción de fluorescencia en el tratamiento, pero la fluorescencia no produce un pico bien definido, hay probabilidad de contaminación de un aceptador del electrón afinidad mayor por ejemplo O2 y deberían tomarse medidas para eliminar restos de oxígeno de todas las soluciones y el experimento debe realizarse otra vez.

Resultados

Una vez que se han cuantificado los picos de fluorescencia según paso 5.3, se puede graficar el resultado de los picos de fluorescencia según la concentración variable que ilustra cómo esta variable afecta la biodisponibilidad relativa de Hg o Cd. Por ejemplo, la curva de calibración de fluorescencia sobre [HgII] Figura 2 dará los inducibles datos presentados en la Figura 3A. Para HgII calibración, la curva de voluntad siempre contienen 3 componentes para la cepa Hg-inducible; una respuesta umbral de aproximadamente 1-2 nM HgII antes de la producción de señal de fluorescencia es linealmente proporcional a [HgII], la gama lineal donde 5 nM HgII será fiable siempre en el centro de ese rango y una meseta donde aumento [HgII] ya no aumentará la señal de fluorescencia. Ningún cambio en la producción de la señal de la tensión constitutiva muestra que toxicidad de [HgII] no afecta la producción de la señal. Para CdII en la figura 3B, siempre hay 2 componentes para la cepa inducible; una variedad lineal donde 200-300 nM CdII será fiable siempre en el centro de la gama lineal y una meseta. Una disminución en la señal de fluorescencia con el aumento de [CdII] demuestra que altas concentraciones de Cd son tóxicas para las células y pueden explicar una disminución en la producción de fluorescencia inducible después de la meseta a 1000 nM CdII. Por lo tanto, al probar la biodisponibilidad de Hg o Cd con respecto a una variable de entorno, le sugerimos que use 5 nM para el HgII y 300 nM para CdII.

En algunos casos, producción de la señal puede atribuirse correctamente a biodisponibilidad Hg o Cd, pero en otros casos, producción de la señal puede verse afectado por la variación en el estado fisiológico del hospedador biosensores celulares (por ejemplo, el metal de interés o condiciones ambientales probadas son tóxicas). En la Figura 4A, 5 biodisponibilidad de Hg nM fue probado sobre un gradiente de Zn (0-10 μm). En Hg-inducible y constitutivas cepas, hay una disminución similar en la señal con el aumento de las concentraciones de Zn. Por lo tanto, uno no puede discriminar si la señal resulta de baja biodisponibilidad o es el resultado de la toxicidad del Zn. En la Figura 4B y 4C, 5nM biodisponibilidad de Hg fue probado sobre un gradiente de MgII (0-10 mM) y MnII (0-10 μm). Aumento de MgII y MnII concentraciones disminuyeron la señal de fluorescencia de la cepa inducible. Por otro lado, la tensión constitutiva no mostraron una disminución de la fluorescencia con el aumento de Mg las concentracionesII II y Mn (MgII y MnII son beneficiosos para las células en la producción de la FbFp, como lo demuestra un aumento en la señal de fluorescencia). Esto demuestra que las células son viables y la disminución de la fluorescencia de la cepa Hg-inducible resulta de una disminución en la biodisponibilidad de Hg. Estos datos subraya lo importante que es para que todos los ensayos de biosensor para también proporcionar mediciones constitutivas de la condición física general del celular.

figure-results-1
Figura 3: rangos lineales del biosensor con mercurio y cadmio. Fluorescencia máxima medida de fluorescencia relativa unidades (RFU) ± 1 desviación estándar emitido por e. coli NEB5α que la pUC57merR-Pp (Hg-Inducible) y pUC19Balch-Pp (Constitutive) con la adición de A) hectogramoII (0-15 nM) y B) CdII (0-1.000 nM) bajo condiciones anaeróbicas. La fluorescencia fue que la media de 3 técnicas replica a 37 ° c. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: ejemplo de un resultado concluyente con Zinc y un resultado concluyente con magnesio y manganeso. Fluorescencia máxima medida de fluorescencia relativa unidades (RFU) ± 1 desviación estándar emitido por e. coli NEB5α que la pUC57merR-Pp (Hg-Inducible) y pUC19Balch-Pp (Constitutive) con la adición de A) ZnII (0-10 μm), B) MgII (0-10 mM), y C) MnII (0-10 μm) en condiciones anaeróbicas. [HgII] fue fijado a 5 nM para todos los tratamientos y de la fluorescencia fue el promedio de 3 repeticiones técnicas a 37 ° c. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Biosensores microbianos son herramientas útiles para identificar los mecanismos por los cuales los metales están interactuando con los microbios. Aquí, describimos un método que puede cuantificar anaeróbicamente HgII y CdII biodisponibilidad a una célula huésped bacterias Gram negativas (e. coli) y dan un resultado cuantificable dentro de unas horas. Una de las fortalezas principales de este protocolo es que permite control extenso de la especiación de metales en el medio de exposición evitando ligandos vinculante fuerte o componentes que pueden llevar a la precipitación del metal. Especiación de metales ha sido modelada y probado en este medio de exposición usando PHREEQC17, sin embargo puede implementarse otros software de especiación de metales. En caso de no añadidos ligandos, Hg especiación se espera que esté presente como 97% Hg(OH)2 y 3% Hg (NH3)22 +, mientras que la especiación de Cd será presentar como 59% glicerofosfato-β-Cd, 25% Cd2 +y 16% CdSO4. Utilizando un software de modelado termodinámico simple, el usuario puede diseñar medios de exposición y prueba de la biodisponibilidad del metal de interés. Además, la célula del huésped del biosensor (e. coli NEB5α) es viable en un amplio rango de pH (5-8, 5) y la concentración de NaCl (0-0.55 M)17.

Metilación del HG es un proceso anaerobio, y el protocolo descrito en este estudio no tiene un requisito para el oxígeno, permitiendo la descripción más exacta del metabolismo anaeróbico en la biodisponibilidad del metal. Esto es importante porque la presencia de oxígeno altera la expresión de gene perfiles48,49 y por lo tanto, potencial de transporte de vías; por lo tanto, este método presenta la ventaja sobre el actual actualmente alternativas aeróbicas. La construcción de biosensores presentada potencialmente puede utilizarse con otros hosts anaerobias que pueden ser más relevantes para la metilación de mercurio (por ejemplo, Geobacter, Desulfovibrio), pero quizás menos manejable que el e. coli. Una limitación actual del enfoque presentado aquí es que nuestro límite de detección todavía no ha alcanzado los niveles de pM, contrariamente a los sistemas aeróbicos4,19,37. Es importante tener en cuenta que para lograr estos bajos límites de detección varios pasos deben tomarse44: i) ligando es necesaria para asegurar que Hg permanece en solución y no por adsorción sobre la pared celular microbiana (Hg será enlazado irreversible a la célula tioles superficie impidiendo su biodisponibilidad25,27; véase la respuesta umbral de Hg en la Figura 3A), ii) modificaciones en la densidad celular, o iii) modificar la estructura genética para incluir proteínas de transporte de la mer-operon (es decir, merT y merP), el creciente flujo de Hg dentro de la célula50,51. Estas modificaciones sería beneficioso en la detección de bajas concentraciones de Hg, pero no necesariamente ideal al evaluar situaciones ambientales relevantes. Mientras que anteriores biosensores de cadmio existen primordialmente como una "prueba de principio", fueron diseñados en medios complejos que no permiten al investigador evaluar el papel de la especiación en biodisponibilidad41,42, 43 , 44.

El biosensor es una herramienta muy útil en la determinación de los mecanismos en que las especies metálicas son biodisponible. Porque el organismo del anfitrión no es un Hg-methylator, sólo se puede utilizar para desarrollar un modelo para cómo Hg puede entrar bacterias Gram-negativas y no un fundamento definitivo para cómo Hg-methylators adquieran Hg. Existen otros métodos para determinar la biodisponibilidad de Hg, como la metilación, como resultado de la absorción o el uso de un enfoque de balance de masa de15,10,20,45,46. Dicho esto, el método presentado aquí ofrece la ventaja de casi en tiempo real datos de biodisponibilidad en las células viables. No se recomienda utilizar este método para cuantificar niveles de Hg o Cd total en una matriz ambiental. A pesar del propuesta uso de biosensores para determinar concentraciones de metales en el medio ambiente36, muchos más métodos estándar están disponibles como ICP-MS, FAAS (para el análisis de Cd) o espectroscopia de absorción atómica de vapor frío (para Hg Análisis). El biosensor sin embargo puede ser utilizado para determinar si una determinada matriz ambiental tiene el potencial para mejorar o dificultar la biodisponibilidad; Esto se logra mediante la realización de adiciones estándar.

El pH de los medios de exposición puede ser alterado a dondequiera dentro de la gama de 5 y 8,5, siempre el MOPS ácido libre (buffer) se intercambia con un ácido libre alternativo de un tampón con el pKa apropiado (vea por favor lista de buffers adecuados (Ferreira et al. (2015) 47) y ajustado con KOH para el pH apropiado al hacer la media de exposición. Además, el método no se limita a Hg y Cd, pero podría extenderse a otros metales con otros reguladores de la transcripción.

El ensayo de exposición puede modificarse para explorar la influencia de otros aceptadores del electrón O2 como fumarato en biodisponibilidad Hg o Cd. Pequeñas modificaciones al método de utilizar el O2 y fumarato como aceptadores del electrón están disponibles bajo petición.

En Resumen, nos gustaría destacar los siguientes puntos: I) es esencial que las concentraciones de Cd o Hg existencias son conocidas en el paso 2, ya que éstos se utilizarán para calibrar el biosensor. II) en el día de la exposición, debe interrumpirse el crecimiento de células en un OD600 de 0,6 (± 0.1) y que cuidado resuspender los cultivos celulares, como el biosensor está calibrado para esta densidad celular. III) por último, es importante que el medio de la exposición se hace meticulosamente en el día de la exposición. Para garantizar el éxito del Protocolo, deben cultivarse culturas múltiples al mismo tiempo (para evitar la posibilidad de retraso en el crecimiento) y el medio de crecimiento debe rehacer semanal (para eludir la metaestabilidad de los medios y la posible contaminación). Debe señalarse también que réplicas biológicas (cultivos de células múltiples) expresarán variabilidad cuando se trata de producción de la señal. Aunque las respuestas fluorescentes pueden variar de cultura a cultura, las tendencias fluorescentes en respuesta a una variable dada deben seguir siendo el mismo a lo largo de numerosas réplicas biológicas.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer comentarios de dos revisores anónimos como bien miembros del laboratorio de Poulain para la discusión profunda sobre el desarrollo del biosensor anaerobio. Un premio de investigador temprano de la provincia de Ontario y una subvención de descubrimiento y un suplemento de acelerador de las ciencias naturales y Consejo de investigación de ingeniería de Canadá a AJP financian este estudio.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Frasco estándar de 7 ml, interior redondeadoDelta Scientific200-007-2034 recomendados
Bandeja de viales, aberturas de 21 mmDelta Scientific730-20014 para (rejilla de 4 x 8)
24 mm CierreDelta Scientific600-024-0132 recomendados
MUESCA DE ESQUINA DE TAPA BLK STR CS/50CorningCorning 3931
Microplaca de superficie no vinculante de fondo claroCorningCorning 3651
(guantera)El aire en la cámara anaeróbica debe ser (97 % N2 ± 2 % y 3 % H2 ± 2 %)
Catalizador de paladioConvierte O2 a H2O en la cámara anaeróbica. No es obligatorio, pero se recomienda.
Lector
450 (± 10) Filtro nM para el lector
500 (± 10) Filtro nM para el lector
Vial de cultivo anaeróbico (tubos de balch) + tapones de
EspectrofotómetroModificado para tubos de cultivo anaeróbico
MA-3000 (analizador de mercurio)
SondaCualquier sonda de pH funcionará
tubos de centrífuga de polipropileno estéril cónicos de 50 mL.
0,22 y micro; m Filtro de jeringa de polietersulfona + jeringa
Frascos de vidrio estériles/limpiosPara medios de
Botellas de plástico o PTFE estériles/limpiasPara soluciones alcalinas (NaOH/KOH)
Reactivos en polvo: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicilina sal sódica, Difco M9 Sales mínimas, glucosa, MgSO4, tiamina HCl, NaNO3, l-leucina, l-isoleucina valina, sal de sodio EDTA, FeSO4, beta-glicerofosfato de sodio, ácido libre de trapeadores, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2
Agua estéril Milli-Qesterilizada en autoclave o con filtro está bien.
lisogenia
Grado analítico H2SO4
de microplacasde microplacasde microplacasgoma de pH con crecimiento y estándaresCaldo de

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