Análisis de ciclo celular en la línea germinal de C. elegans con la EdU de análogo de la timidina

Resumen

Se describe un método basado en la proyección de imagen que puede utilizarse para identificar la fase S y analizar la dinámica del ciclo celular en el germline hermafrodita C. elegans mediante la timidina EdU analógico. Este método no requiere transgenes y es compatible con la tinción inmunofluorescente.

Resumen

Análisis de ciclo celular en eucariotas con frecuencia utiliza la morfología del cromosoma, expresión y localización de productos génicos necesarios para diferentes fases del ciclo celular, o la incorporación de análogos de nucleósidos. Durante fase de S, polimerasas de la DNA incorporan a análogos de timidina como EdU o BrdU DNA cromosómica, las células para el análisis de la marca. Para C. elegans, el nucleósido análogo EdU se alimenta a los gusanos durante cultura regular y es compatible con técnicas de inmunofluorescencia. Germinales de C. elegans es un sistema potente para los estudios de señalización de vías, las células madre, meiosis y ciclo celular porque es transparente, genéticamente facile y profase meiótica y la diferenciación celular/gametogénesis ocurre en un forma de montaje-como lineal. Estas características hacen de EdU una gran herramienta para el estudio de aspectos dinámicos de células mitotically ciclismo y desarrollo de la línea germinal. Este protocolo describe cómo preparar EdU bacterias con éxito, darles de comer a tipo salvaje hermafroditas de C. elegans , diseccionar la gónada hermafrodita, de la mancha para la incorporación de EdU en el ADN, tinción con los anticuerpos al detectar varios ciclo celular y marcadores del desarrollo, la gónada de la imagen y analizar los resultados. El protocolo describe las variaciones en el método y el análisis para la medición de fase S índice, fase M índice, G2 duración, duración del ciclo celular, tasa de entrada meiótica y tasa de progresión de la profase meiótica. Este método se puede adaptar para estudiar el ciclo celular o la historia de células en otros tejidos, etapas, fondos genéticos y condiciones fisiológicas.

Introducción

En el desarrollo animal, cientos, miles, millones, miles de millones o incluso billones de divisiones celulares se requieren para formar el organismo adulto. El ciclo celular, el conjunto de eventos celulares por G1 (gap), S (síntesis), G2 (gap), y M (mitosis) definir la serie de eventos que son ejecutaron cada división celular. El ciclo celular es dinámica y mejor apreciado en tiempo real, que puede ser técnicamente difícil. Las técnicas presentadas en este protocolo permiten hacer las mediciones de las fases y tiempos del ciclo celular de imágenes fijas.

Etiquetado con análogos de nucleósidos como 5-ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU) o 5-brom....

Protocolo

1. preparación de bacterias EdU-labeled

1. Cultivar una cultura de arrancador de MG1693. Escherichia coli MG1693 (e. coli) lleva una mutación en thyA.
   1. Racha a e. coli MG1693 de un stock de glicerol congelado en un agar de caldo (LB) de lisogenia 120 mm plato de Petri. Cultivo a 37 ° C durante la noche.
   2. Inocular de dos individuales e. coli colonias MG1693 en dos tubos de 4 mL del cultivo líquido lb a 37 ° C para h ~ 16 de duplicar.
      Nota: MG1693 crece bien en LB sin suplementar con timina o timidina.
2. Crecen MG1693 de e. coli en medios mínimos sup....

Resultados

Puesto que la síntesis de ADN es necesaria para incorporar a EdU, se puede concluir que núcleos marcados con EdU experimentaron la fase S durante la ventana Etiquetado EdU. Uno puede interpretar los núcleos etiqueta en una alimentación de 30 min con EdU etiquetado bacterias como núcleos en fase S en el momento de la disección. Núcleos que etiqueta en un EdU continua ya experimento de alimentación indicados en la última parte de la ventana del tiempo EdU o pueden han etiquetado como tempra.......

Discusión

Preparación de bacterias etiquetadas de EdU (paso 1) es fundamental para este protocolo y el primer punto para solucionar problemas. Etiqueta tipo salvaje jóvenes adultos hermafroditas muy confiablemente en un 4 h EdU-pulso, haciendo de este un control útil para cada lote nuevo de bacterias EdU-labeled. Además, bacterias EdU-con la etiqueta intactas que entran en el intestino (en animales más viejos o ciertos mutantes defectuosos de faringe grinder) etiqueta con química del tecleo y aparecen como brillante orificio oblon.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
E. coli MG1693	Coli Genetic Stock Center	6411	crece bien en LB
em>E. coli estándar no suplementado OP50	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de imágenes	Thermo Fisher Scientific	C10337
5-ethinil-2′-desoxiuridina	Sigma	900584-50MG	o use EdU provisto en el kit
Glucosa	Sigma	D9434-500G	D-(+)-Dextrosa
Tiamina (Vitamina B1)	Sigma	T4625-5G	Grado Reactivo
Timidina		Sigma T1895-1G	BioReactivo
Sulfato de magnesio heptahidratado	Sigma	M1880-1KG	MgSO4,
Fosfato de Sodio de Grado Reactivo, dibásico, anhidro	Fisher	BP332-500G	Na2HPO4
Fosfato de potasio, monobásico	Sigma	P5379-500G	KH2PO4
Cloruro de amonio	Sigma	A4514-500G	NH4Cl, reactivo más
agar bacteriológico	US Biológico	C13071058 Cloruro
de calcio dihidratado	Sigma	C3881-500G	Caldo CaCl
LB (Miller)	Sigma	L3522-1KG	Usado a 25 g / L
Levamisol	Sigma	L9756-5G	0.241 g / 10 ml
Solución salina tamponada con fosfato	Calbiochem Omnipur	6506	PBS casero funciona igual
de bien Tween-20	Sigma	P1379-500ML
16% Paraformaldehído, ampollas de grado EM	Ciencias de la microscopía electrónica 15710		ampollas de 10 ml
100% metanol	Thermo Fisher Scientific	A454-1L	es fundamental para una morfología adecuada con ciertos anticuerpos
Suero de cabra	Gibco	16210-072	Lote 1671330
conejo-anti-WAPL-1	Novus biologicals	49300002	lote G3048-179A02, utilizado a 1:2000
clon de ratón anti-pH3 3H10	Millipore	05-806	Lote#2680533, utilizado a 1:500
cabra anti-conejo IgG conjugada Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11012	Lote 1256147, utilizado en 1:400
cabra-anti-ratón IgG conjugado Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Lote 1511347, utilizado en 1:400
Medio de montaje antidecoloración Vectashield que contiene 4',6-Diamidino-2-Fenilindol Dihidrocloruro (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	En su lugar, se puede usar un medio de montaje sin DAPI, siguiendo un esmalte de uñas de incubación DAPI por separado
	Wet n Wild	DTC450B	cualquier esmalte de uñas transparente debería funcionar
S-medium	varios		ver wormbook.org para el protocolo
Tampón M9	varios		ver wormbook.org para el protocolo
Agar M9	varios		misma receta que el tampón M9, pero agregue agar al 1.7%
Medio de crecimiento de nematodos	varios		ver wormbook.org para el vidrio
reloj de disección	de protocolo Carolina Biological	42300
Película de laboratorio Parafilm	Pechiney Embalaje de plástico	PM-996 Película de	laboratorio de 4 pulgadas de ancho
Placas			60 mm
de
Tubos de centrífuga de 1 ml	MidSci Avant	2926
Puntas
Pipetas serológicas Matraz
			Erlenmyer de 500 ml
Papel
25G Agujas de 5/8"	BD PrecisionGlide
tubo de centrífuga de vidrio de 5 ml	Pyrex
Tubos de vidrio de borosilicato 1 ml
portaobjetos de
n.º 1 cubreobjetos 22 x 40 mm			n.º 1,5 pueden funcionar, también
37 & deg; C Incubadora
Centrífuga de mesa Centrífuga
clínica	IEC	428	con rotor de 6 cucharas oscilantes
Mini centrífuga
20 ° Incubadora
4 ° C refrigerador-20
° C congelador
Observer Z1 microscopio	Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 lente objetivo de inmersión en aceite	Zeiss
Ultraview Vox sistema confocal de disco giratorio	PerkinElmer		El sistema confocal de disco giratorio de Nikon también funciona muy bien, como se describe aquí: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy

<El metanol con etiqueta de oro la de de Petri de vidrio largo de diámetrode aluminio305122vidrioShakerC