Artículo de método

Análisis de ciclo celular en la línea germinal de C. elegans con la EdU de análogo de la timidina

DOI:

10.3791/58339

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22 de octubre de 2018

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1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se describe un método basado en la proyección de imagen que puede utilizarse para identificar la fase S y analizar la dinámica del ciclo celular en el germline hermafrodita C. elegans mediante la timidina EdU analógico. Este método no requiere transgenes y es compatible con la tinción inmunofluorescente.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Análisis de ciclo celular en eucariotas con frecuencia utiliza la morfología del cromosoma, expresión y localización de productos génicos necesarios para diferentes fases del ciclo celular, o la incorporación de análogos de nucleósidos. Durante fase de S, polimerasas de la DNA incorporan a análogos de timidina como EdU o BrdU DNA cromosómica, las células para el análisis de la marca. Para C. elegans, el nucleósido análogo EdU se alimenta a los gusanos durante cultura regular y es compatible con técnicas de inmunofluorescencia. Germinales de C. elegans es un sistema potente para los estudios de señalización de vías, las células madre, meiosis y ciclo celular porque es transparente, genéticamente facile y profase meiótica y la diferenciación celular/gametogénesis ocurre en un forma de montaje-como lineal. Estas características hacen de EdU una gran herramienta para el estudio de aspectos dinámicos de células mitotically ciclismo y desarrollo de la línea germinal. Este protocolo describe cómo preparar EdU bacterias con éxito, darles de comer a tipo salvaje hermafroditas de C. elegans , diseccionar la gónada hermafrodita, de la mancha para la incorporación de EdU en el ADN, tinción con los anticuerpos al detectar varios ciclo celular y marcadores del desarrollo, la gónada de la imagen y analizar los resultados. El protocolo describe las variaciones en el método y el análisis para la medición de fase S índice, fase M índice, G2 duración, duración del ciclo celular, tasa de entrada meiótica y tasa de progresión de la profase meiótica. Este método se puede adaptar para estudiar el ciclo celular o la historia de células en otros tejidos, etapas, fondos genéticos y condiciones fisiológicas.

Introducción

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En el desarrollo animal, cientos, miles, millones, miles de millones o incluso billones de divisiones celulares se requieren para formar el organismo adulto. El ciclo celular, el conjunto de eventos celulares por G1 (gap), S (síntesis), G2 (gap), y M (mitosis) definir la serie de eventos que son ejecutaron cada división celular. El ciclo celular es dinámica y mejor apreciado en tiempo real, que puede ser técnicamente difícil. Las técnicas presentadas en este protocolo permiten hacer las mediciones de las fases y tiempos del ciclo celular de imágenes fijas.

Etiquetado con análogos de nucleósidos como 5-ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU) o 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) es el estándar de oro para identificar la fase S en los estudios de la dinámica del ciclo celular en el adulto de Caenorhabditis elegans (C. elegans) hermafroditas del germline1,2,3,4,5. EdU y BrdU pueden utilizarse en casi cualquier fondo genético, como no dependen de ningún concepto genética. Visualización de BrdU requiere tratamiento químico áspero para exponer el antígeno para el anticuerpo anti-BrdU de tinción, que a menudo es incompatible con la evaluación de otros marcadores celulares visualizadas mediante tinción con anticuerpos adicionales conjuntamente. Por el contrario, visualizar EdU se produce por la química del tecleo condiciones suaves y por lo tanto es compatible con el anticuerpo Co manchas6,7.

La especificidad de la etiqueta es clara, puesto que los núcleos sólo incorporan los análogos de timidina (5-ethynyl-2'-desoxiuridina) ADN durante la fase S. Visualización lleva a cabo en tejido fijo. La etiqueta de EdU es invisible por sí mismo hasta un colorante que contiene azida o fluoróforo covalente reacciona con el alquino en EdU de química cobre-catalizada del tecleo8. Etiquetado EdU puede proporcionar información inmediata en la que los núcleos son en fase S, mediante un breve impulso de etiquetado. EdU también puede proporcionar información dinámica, mediante pulso-persiga o etiquetas de continuo; por ejemplo, en un experimento de Pulso-persiga, la etiqueta se diluye en cada división celular o reproducidos como nondividing progreso de células a través del desarrollo.

El germline hermafrodita C. elegans es un sistema potente para los estudios de señalización de vías, las células madre, meiosis y ciclo celular. El germline adulto es una línea de ensamblaje polarizada con células madre en el extremo distal, seguido por la entrada y la progresión a través de la profase meiótica, coordinado con las etapas de la gametogénesis más proximal (figura 1). En el extremo proximal, ovocitos maduran, son ovularon y fertilizan y comienzan la embriogénesis en el útero9,10,11. La región larga de ~ 20 células de diámetro cerca de la célula de la punta distal, que incluye el vástago del germline mitotically ciclismo, células progenitoras y células en fase S meióticas pero no las células en profase meiótica, se llama el progenitor zona2,4 , 9 , 12. las membranas celulares proporcionan separación incompleta entre los núcleos en el germline distal, pero las células de la zona de progenitoras se someten a ciclismo en gran parte independientemente de la célula mitótica. La duración mediana ciclo celular mitótico de las células de zona de progenitor del germline en jóvenes adultos hermafroditas es ~6.5 h; Fase G1 es breve o ausente, y quietud no se observa1,2,13. Diferenciación de la célula de vástago del germline se produce a través de la diferenciación esencialmente directa y carece así de tránsito amplificando las divisiones4. Durante la diferenciación en la fase de paquiteno, aproximadamente 4 de cada 5 núcleos no forma ovocitos pero en cambio sufren apoptosis, actuando como enfermera células donando su contenido citoplasmático al ovocito en desarrollo12,14 , 15.

Además de etiquetado células en fase S con análogos de nucleósidos, uno puede identificar las células en mitosis y meiosis utilizando anticuerpos. Núcleo en la mitosis es inmunorreactivas para anti-phospho-histona H3 (Ser10) anticuerpo (llamado pH3)7,16. Los núcleos en la meiosis son immunoreactive a los anticuerpos anti-lo-3 (una proteína del eje del cromosoma meiótico)17. Núcleos en la zona del progenitor pueden identificarse por la ausencia de él-3, la presencia de nucleoplasmática REC-818o la presencia de WAPL-119. WAPL-1 intensidad es más alta en la gónada somática, alta en la zona de la progenitora y baja durante temprano meiótica prophases19. Varias mediciones de ciclo celular son posibles con algunas variaciones en el protocolo: I) identificar los núcleos en fase S y medir el índice de la fase S; II) identificar los núcleos en fase M y medir el índice de fase M; III) determinar si los núcleos estaban en S-fase mitótica o meiótica; IV) medir la duración de G2; V) medir la duración de las fases G2 + M + G1; VI) medir la velocidad de entrada meiótica; VII) estiman la tasa de progresión meiótica.

Uno puede hacer múltiples mediciones de ciclo celular de sólo algunos tipos de experimentos de laboratorio húmedo. El protocolo a continuación describe un etiquetado de pulso de 30 min por la alimentación de C. elegans adultos hermafroditas con EdU etiquetado como bacterias y células en fase M Co etiquetadas mediante tinción con el progenitor y el anticuerpo anti-pH3 las células de la zona mediante tinción con anticuerpos anti-WAPL-1. Sólo cambios en la duración de EdU de la alimentación (paso 2.5), tipo de anticuerpos emplean (paso 5), y análisis (8,3 de paso) son necesarios para las mediciones adicionales.

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Protocolo

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1. preparación de bacterias EdU-labeled

  1. Cultivar una cultura de arrancador de MG1693. Escherichia coli MG1693 (e. coli) lleva una mutación en thyA.
    1. Racha a e. coli MG1693 de un stock de glicerol congelado en un agar de caldo (LB) de lisogenia 120 mm plato de Petri. Cultivo a 37 ° C durante la noche.
    2. Inocular de dos individuales e. coli colonias MG1693 en dos tubos de 4 mL del cultivo líquido lb a 37 ° C para h ~ 16 de duplicar.
      Nota: MG1693 crece bien en LB sin suplementar con timina o timidina.
  2. Crecen MG1693 de e. coli en medios mínimos suplementados con EdU.
    1. Autoclave de un erlenmeyer de 500 mL.
    2. Utilizar técnica estéril para agregar 5 mL de glucosa 20%, 50 μL de 10 mg/mL de tiamina, 120 μL de timidina 5 mM, 100 μL de 1 M MgSO4, 200 μL de 10 mM EdU, 100 mL de buffer M9 y 4 mL de la cultura de MG1693 durante la noche recién crecido.
      Nota: La concentración final de EdU es 20 μM en esta cultura1,7. Esta concentración conduce a la detención de daños y el ciclo celular de ADN si se aplica directamente a células de mamífero en cultivo20. Sin embargo, sólo una fracción de este EdU se incorpora en la e. coli y así disponible para C. elegans. Hay ninguna evidencia de la detención del ciclo celular y ningún cambio en el tamaño de la zona de la progenitora o índice de fase M después del tratamiento de EdU de jóvenes adultos hermafroditas.
    3. La cultura durante la noche, pero no más de 24 h a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
  3. EdU-etiquetados e. coli se concentran y se aplica a platos de Petri agar M9.
    1. Pre-enfriar una centrifugadora de mesa a 4 ° C.
    2. Utilizar técnica estéril para transferir la cultura 2-4 tubos cónicos de 50 mL estéril.
    3. Centrifugue las culturas a 3.000 x g a 4 ° C durante 30 minutos para que sedimenten la EdU-etiquetados e. coli.
      Nota: Deseche el sobrenadante que contiene EdU según las pautas locales e institucionales.
    4. Vuelva a suspender los pellets con 4 mL de M9 fresco. Utilice una punta de la pipeta estéril 1 mL o una pipeta serológica de 5 mL estéril. Resuspender el pellet puede tardar varios minutos.
    5. Utilizar la misma pipeta para aplicar y difundir ~ 8 gotas de resuspendidos EdU-etiquetado de e. coli MG1693 al centro de temperatura 60 mm M9 agar Petri. Un lote da ~ 16 platos.
    6. Deje que los platos secar por varias horas o durante la noche a temperatura ambiente y luego sellar cada plato con una tira de película de laboratorio. Platos se pueden almacenar a 15 ° C durante 2 semanas y a 4 ° C durante 2 meses. Use el mismo lote de platos de EdU para cada conjunto de experimentos.

2. alimentación de EdU para C. elegans

  1. Sincronizar población huevo tiempo endecha, alcalinos hipoclorito tratamiento seguido por incubación en medio de S con el colesterol, o escogiendo la etapa adecuada21. Crecen los animales al escenario deseado (aquí, 24 h post-L4) en medio de crecimiento de nematodos con OP50 de e. coli a 20 º C.
    Nota: Preparar 50 y 100 animales por experimento, como algunos no pueden diseccionar bien, y otros se perderán en el proceso de lavado y la transferencia.
  2. Deje que los platos de EdU a 20 ° C (o la temperatura deseada para el experimento).
  3. Lavar los animales de los platos NGM con M9 o tampón fosfato salino (PBS) en un tubo de 1,5 mL. Permitir a los animales resolver brevemente por gravedad o una breve vuelta en una microcentrífuga.
  4. Quite el sobrenadante y lavar los animales 1 a 2 veces con ~ 1 mL de M9 o PBS. Eliminar el sobrenadante.
  5. Utilizar un pipeta Pasteur de vidrio para transferir los animales de una pequeña gota de M9 o PBS en el centro del césped de EdU. Espere unos minutos a que el líquido absorbido, luego incubar a 20 ° C durante 30 min (para medición directa de la fase S) o más (para medir la historia de la fase S), según sea necesario.
    Nota: Señal de EdU es detectable en los núcleos germinales después de tan sólo 15 min de EdU alimentación1.
  6. Lave los gusanos el plato de EdU con 2 mL de M9 o PBS en un vaso plato de disección.

3. disección y fijación de la línea germinal de C. elegans

Nota: Este protocolo para la disección, fijación y tinción de anticuerpos del germline hermafrodita C. elegans es casi idéntica a la publicada por Gervaise y Arur (2016)22, excepto que los tubos de vidrio de 1 mL pueden ser centrifugados para acelerar lavado de pasos y un vidrio tendida pipeta Pasteur se puede utilizar para quitar el líquido de los tubos de vidrio de 1 mL más con eficacia.

  1. Lavar y disecar germlines de C. elegans .
    1. Permite los animales colocar en la parte inferior de la placa de disección, Remolino para recoger los animales en el centro y utilice una pipeta Pasteur largo para quitar PBS. Lavar 1 – 2 veces con 2 mL de PBS.
    2. Añadir 2 mL de PBS y 4 μL de levamisole 100 mM para inmovilizar a los animales. Agite el plato otra vez para recoger los animales en el centro del plato.
      Nota: La inmovilización puede tardar entre unos segundos y unos minutos. Inmovilización completa no es necesario para la disección exitosa. Algunas personas tienen más éxito cuando incompleto de disección inmovilizados los animales.
    3. Disecar los animales con un par de agujas de 25 5/8" por el corte en la cabeza (aproximadamente entre los dos bulbos faríngeas) o la cola. Tenga cuidado de no para cortar el lazo de la línea germinal. Intestino y línea germinal deben "saltar" de la cavidad del cuerpo debido a la presión interna, pero permanecer Unidos. Este protocolo es similar al previamente publicado Gervaise y Arur (2016)22.
      Nota: Mantenga el tiempo de la disección a ~ 5 min, ciertamente no más de 15 minutos tiempo de disección puede resultar en la pérdida de señal tinción de anticuerpo (Sudhir Nayak, comunicación personal) y hambre en PBS puede afectar la fisiología de los animales. Aprender a diseccionar de forma rápida y precisa puede tomar algo de práctica.
    4. Si es necesario, para recoger los animales disecados en el centro del remolino y utilizar una pipeta Pasteur largo para quitar tanta PBS como sea posible.
  2. Fijan y deshidratan los tejidos
    1. Añadir 2 mL de 3% paraformaldehido (PFA) en solución de PBS. Cubrir el plato con laboratorio película y almacenar en un banco o en un cajón durante 10 minutos.
      Nota: Descongelar solución de PFA a 37 ° C baño de agua y luego enfriar a temperatura ambiente antes de germlines de disección.
      PRECAUCIÓN: Solución PFA es moderadamente tóxico y un probable carcinógeno y teratógeno. Emisión de soluciones paraformaldehido los vapores son inflamables. Guantes nitrilo. Diluir PFA del 16% al 3% en una campana de humos químicos. Cuando se trabaja fuera de la campana, mantenga todos los recipientes cubiertos.
    2. Transferir las gónadas cuidadosamente a un tubo de centrífuga limpio 5 mL vidrio.
    3. Añadir 3 mL de PBSTw (PBS con un 0.1% Tween-20) al plato que contenía las gónadas para ayudar a recuperar las gónadas restantes y diluir la solución de la PFA.
    4. Giro en una centrífuga clínica a 870 x g ~ 1 min joven o animales más pequeños requieren tiempos más largos de spin que animales mayores o más grandes.
    5. Con una pipeta de vidrio larga, transferir el sobrenadante a vaso material no deseado para descartar eventual en botella de material no deseada en la campana química.
    6. Añadir 2 mL de metanol alto grado previamente enfriada a-20 ° C. Cubrir el tubo de centrífuga con película de laboratorio.
      Nota: Uso de metanol fresco alto grado "gold label" es esencial para la adecuada morfología con ciertos anticuerpos.
      PRECAUCIÓN: El metanol es un líquido altamente inflamable y el vapor, que es tóxico si se ingiere, inhala o permitido entrar en contacto con la piel. Use guantes y equipo de protección personal. Use un congelador adecuado para pequeñas cantidades de productos inflamables.
    7. Tienda en congelador de-20 ° C por 1 h, incluso durante la noche o incluso varios meses.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí.

4. rehidratar Germlines

  1. Llene el tubo de centrífuga de vidrio en parte superior con PBSTw para diluir el metanol y rehidratar las gónadas. Girar hacia abajo en una centrífuga clínica a 870 x g ~ 1 min.
  2. Utilizando un pipeta Pasteur de vidrio largo, transferir el sobrenadante a vaso de material no deseado para descartar eventual en botella de material no deseada en la campana química.
  3. Lave las gónadas 3 veces con ~ 5 mL de PBSTw, girando hacia abajo en una centrífuga clínica a 870 x g ~ 1 min cada vez. Eliminar el sobrenadante.
  4. Enjuagar un tubo de vidrio borosilicato de pequeño 1 mL y un vaso largo pipeta Pasteur con PBSTw.
  5. Añadir ~ 700 μL de PBSTw y utiliza el vidrio larga pipeta Pasteur transferir las gónadas en el tubo pequeño. Utilice unas gotas adicionales de PBSTw para asegurar que se transfieren todas las gónadas.
  6. Girar hacia abajo en una centrífuga clínica x 870 g ~ 1 min, utilizando un vaso largo tendida pipeta Pasteur, quitar tanto líquido como sea posible sin molestar a las gónadas. Deje no más de 50 μL.
    Nota: Si la detección de anticuerpos no es necesaria, vaya al paso 6.

5. detección de antígenos con anticuerpos

  1. Diluir los anticuerpos primarios en suero de 30% en PBS. En el presente ejemplo, anticuerpo anti-WAPL-1 es 1:2,000 diluido y anticuerpo anti-pH3 es diluido 1: 500. Centrifugar el suero recién descongelado durante 10 minutos en una microcentrífuga a 20.000 x g a 4 ° C para eliminar las partículas. Usar el sobrenadante, que puede ser almacenado a 4 ° C por varios días. Usar el suero adecuado el organismo anfitrión de anticuerpos secundarios (de suero de cabra se utiliza aquí). Un paso de bloqueo opcional puede agregarse antes de la adición de anticuerpos primarios.
  2. Se aplican 100 μL de anticuerpo primario diluido a cada tubo pequeño de vidrio. Incubar a temperatura ambiente durante 4 horas.
    Nota: Tiempos de incubación varían por el anticuerpo. Para algunos anticuerpos, 2 h a temperatura ambiente es suficiente. Incubaciones más largo (por ej., durante la noche) son posibles, pero puede aumentar el fondo.
  3. Llenar los tubos para top con PBSTw y gira hacia abajo en una centrífuga clínica x 870 g ~ 1 min.
  4. Lave las gónadas 3 veces utilizando ~ 1 mL de PBSTw. Incubar durante ~ 5 min por lavado para permitir exceso de anticuerpo primario difundir en lavado. Usando un dibujado-hacia fuera larga pipeta Pasteur de vidrio, quitar tanto líquido como sea posible sin molestar a las gónadas. Deje no más de 50 μL.
  5. Diluir los anticuerpos secundarios en suero de cabra 30% en PBS. En el presente ejemplo, cabra-anti-conejo-594 y cabra-anti-mouse-647 cada uno son diluidos al 1: 400.
    Nota: Seleccionar anticuerpos secundarios cuidadosamente para asegurarse de que los tintes son distintos de la tintura en el kit de EdU. En el presente ejemplo, el kit de EdU contiene tinte de excitación de 488 nm.
  6. Se aplican 100 μL del anticuerpo secundario diluido a cada tubo pequeño de vidrio. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente 2 h.
    Nota: Tiempos de incubación varían por el anticuerpo. Para algunos anticuerpos secundarios, 1 h a temperatura ambiente es suficiente. Incubaciones más largo (por ej., durante la noche) son posibles, pero puede aumentar el fondo.
  7. Lave las gónadas 3 veces utilizando ~ 1 mL de PBSTw. Incubar durante ~ 5 min por lavado para permitir exceso de anticuerpo secundario difuso en lavado. Usando un dibujado-hacia fuera larga pipeta Pasteur de vidrio, quitar tanto líquido como sea posible sin molestar a las gónadas. Deje no más de 50 μL.
    Nota: Las gónadas pueden almacenarse en 100 μL de PBS después de este paso, si es necesario, aunque esto puede reducir la señal. Quitar el PBS antes de proceder.

6. realizar la reacción de EdU Click para detectar EdU

Nota: Realizar el EdU click reacción ante el anticuerpo tinción pasos (realizar paso 6 antes de Step 5) es posible, dependiendo de los anticuerpos se usan7. Sin embargo, los reactivos de clic pueden interferir con ciertos antígenos (e.g., REC 8 es sensible a la fijación y permeabilización). La orden presentada aquí produce anticuerpos brillante coloración con la REC-8, WAPL-1, él 3, pH3, bandera y CYE-1 anticuerpos utilizados, entre otros.

  1. Preparar el clic EdU coctel8 fresco añadiendo lo siguiente a un tubo limpio de 1.5 mL. El orden de las adiciones es importante. Proteger de la luz y mantener todos los reactivos en el hielo. Esta receta rinde lo suficiente para una muestra (100 μL); multiplicar la receta según sea necesario.
    1. Añadir 2 mL de agua ultrapura en el búfer de aditivo. Esto hace inmediatamente antes de utilizar 10 x aditivo tampón, que debe ser diluido a 1 x.
    2. Añadir 8,5 μL de tampón de x 10 a 76,5 μL de agua ultrapura. Mezclar bien.
    3. Añadir 4 μL del 100 mM CuSO4 (puede ser etiquetado como componente E). Mezclar bien.
    4. Añadir 0,25 μL de colorante nm 488 azida. Se debe descongelar a temperatura ambiente, como su disolvente, el dimetil sulfóxido, es sólida a 4 ° C. Mezcla bien y proteger de la luz.
    5. Mix 9 μL de agua ultrapura con 1 μL del buffer añadido en la tapa del tubo. Pipeta de la tapa para añadir al cóctel restantes y mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo.
  2. Realizar la reacción de clic de EdU.
    1. Añadir ~ 100 μL de click EdU coctel a las gónadas en el tubo pequeño. Cubra con película de laboratorio e incube durante 30-60 min a temperatura ambiente.
    2. Lavar una vez con 100 μL de tampón de reacción enjuague.
    3. Lave las gónadas 4 veces con ~ 1 mL de PBSTw. Incubar por ~ 15 min por lavado a permitir exceso EdU cóctel que los componentes se difunden en lavado. Usando un dibujado-hacia fuera larga pipeta Pasteur de vidrio, quitar tanto líquido como sea posible sin molestar a las gónadas. Deje no más de 50 μL.

7. ADN de la mancha y preparar diapositivas

  1. Añada 1 gota (~ 25 μL) antifade de medio de montaje con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, utilizado para visualizar el ADN) a las gónadas. Espere unos minutos para poder colocar y mezclar con las gónadas.
    Nota: Alternativamente, una dilución de 1:1,000 de DAPI (de un stock de 0,1 mg/mL) en PBS puede aplicarse por 5 min, seguido de 20 μL de 1, 4-Diazabiciclo [2.2.2] octano (DABCO) en 90% de glicerol, o medio de montaje antifade otro.
  2. Preparar un gran cojín de agarosa 2,5% en un portaobjetos de microscopio de vidrio estándar.
  3. Uso un nuevo limpio libre de polvo cristal larga pipeta Pasteur transferir las gónadas a la almohadilla de agarosa. Mantenga todos los líquidos y las gónadas en el estrecha inferior de la pipeta para minimizar la pérdida de las gónadas.
    Nota: Las gónadas pegan al tubo pequeño de vidrio o de cristal larga pipeta Pasteur puede ser "rescatado" enjuague con PBSTw, recogiendo el líquido en un plato de disección y recogiendo los animales en el portaobjetos con una pestaña.
  4. Uso una pestaña o un lazo del pelo fino pegado a un palillo de dientes para distribuir las gónadas sobre la base de agarosa y eliminar las partículas de polvo.
  5. Se aplica un cubreobjetos de vidrio rectangular. Baja lentamente de un lado para evitar burbujas de aire. Utilice un pañuelo de papel para eliminar el exceso de solución evitando el cubreobjetos se mueva libremente.
    Nota: Elija cubre-objetos que coinciden con el microscopio que se utilizará. #1 y #1.5 cubreobjetos funcionan bien.
  6. Deje que los portaobjetos y secar ligeramente durante la noche a temperatura ambiente o 4 ° C. Esto ayuda a aplanar un poco las gónadas. Portaobjetos deben almacenarse a 4 ° C.
  7. Opcional: Sellar los bordes de la diapositiva con esmalte de uñas u otro sellador de diapositiva. Sellado de las esquinas primero, luego los lados, impide que el cubreobjetos desplazamiento.

8. Análisis y proyección de imagen confocal

  1. Imagen la gónada distal con un microscopio de fluorescencia confocal spinning disco equipado con una fuente de luz de alta energía, objetivos plan-apocromática y una cámara de microscopio de alta eficiencia. Captura las imágenes con 1 μm o mayor espaciamiento entre pilas de z. Tomar nota del tiempo de energía, la sensibilidad y la exposición de láser para todos los canales.
    1. Utilice el siguiente: 405 nm láser línea excitación con un filtro de emisión de 485 nm (W60) para DAPI, 488 nm láser línea excitación con un filtro de emisión 527 nm (W55) para EdU, 561 excitación de línea láser de nm con un filtro de emisión de 615 nm (W70) WAPL-1 y a 640 nm láser línea excita ción con un filtro de emisión de 705 nm (W90) de pH3.
      Nota: Intensidad de la señal y la intensidad de fondo varían. Asimismo, los tiempos de exposición requeridos variará, posiblemente hasta 10 veces.
  2. Utilice el plug-in de contador celular23 en Fiji24,25 para contar manualmente cada núcleo. Etiqueta cada núcleo individual según la presencia y la ausencia de pH3, EdU y WAPL-1. Utilice las clases de núcleos que se describen en la tabla 1 y figura 2, como éstos facilitará todos los cálculos que se detallan a continuación.
    Nota: Los investigadores calificados pueden contar exactamente todos los núcleos en una imagen 3D sin contar doble o falta cualquier núcleos. Alternativamente, uno puede contar cada núcleo en cada plano de z, y el script de marcas a células R3 se puede usar para eliminar núcleos multiplica-contado.
  3. Calcular el número de células y las frecuencias de las cuentas anteriores dependiendo del tipo de medida del ciclo celular necesitada. Los tipos de núcleos se definen en la tabla 1 y figura 2. Los cálculos se resumen en la tabla 2.
    1. (Variación I) Para identificar los núcleos en fase S, alimentar los animales EdU durante 30 minutos. Cualquier núcleo Mostrar etiqueta de EdU es núcleos de S-phase. Para calcular, tomar los núcleos suma A y C, ver tabla 1 y figura 2.
      Nota: En un minuto 30 EdU pulso en salvaje-tipo adultos hermafroditas, EdU todos etiquetados núcleos son co etiquetados con progenitor zona marcadores1.
    2. Para medir la zona de la progenitora, de la mancha con un marcador de zona de progenitor como REC-8 o WAPL-1 anticuerpo. La zona de progenitoras se define aquí como todos nucleoplasmática REC-818 núcleos de immunoreactive del germline WAPL-1. Para calcular, en definitiva todos los núcleos immunoreactive WAPL-1 (A + B + C + D, ver tabla 1 y figura 2).
      Nota: 1 WAPL etiquetas también el DTC y los núcleos somáticos gónada que no deben ser contados. Núcleos somáticos son fáciles de identificar por la señal de WAPL-1 extremadamente intensa, posición ligeramente fuera de la línea germinal y una morfología de "huevo frito" de los núcleos.
    3. Para medir el índice de la fase S, realizar un experimento de EdU de 30 min y co etiqueta con anticuerpo REC-8 o WAPL-1. El índice de fase S se define como la proporción de la zona del progenitor que se encuentra en fase de S. Para calcular, contar todos los núcleos de fase S y luego dividir por el número total de núcleos de la zona de progenitor (A + C / A + B + C + D, ver tabla 1 y figura 2).
    4. (Variante II) Para identificar los núcleos en fase M, tinción con anticuerpos de pH3. Cualquier pH3 immunoreactive núcleos son núcleos de fase M. Esto funciona independientemente de la duración de la UAE de la alimentación. Para calcular, tomar la suma de la A y núcleos B, ver tabla 1 y figura 2.
      Nota: 1 WAPL etiquetas también el DTC y los núcleos somáticos gónada que no deben ser contados. Núcleos somáticos son fáciles de identificar por la señal de WAPL-1 extremadamente intensa, posición ligeramente fuera de la línea germinal y una morfología de "huevo frito" de los núcleos.
    5. Para medir el índice de la fase M, co etiqueta pH3 y REC-8 o anticuerpos WAPL-1. El índice de la fase M se define como la proporción de la zona del progenitor que se encuentra en fase M. Para calcular, contar todos los núcleos de fase M y luego dividir por el número total de núcleos de la zona de progenitor (A + B / A + B + C + D, ver tabla 1 y figura 2).
    6. (Variación III) Los núcleos en fase S mitotic y meiotic ambos etiqueta con EdU. A decir de las dos poblaciones separadas, determinar si la fase de S fue seguida por mitosis o por meiosis. Para determinar si los núcleos en fase S meiótica o mitótica, alimentar a EdU por 4 h y co etiqueta para pH3 (un marcador de fase M) y él-3 (una proteína del eje del cromosoma meiótico) por anticuerpos. Grabar los núcleos que EdU y pH3 (tipo A, ver cuadro 1 y figura 2) como mitótica fase S mientras que los núcleos que EdU y él-3 (tipo E, ver tabla 1 y figura 2) como S-fase meiótica.
    7. (Variación IV) Calcular la duración de la fase G2.
      Nota: Fase G2 separa fase S fase M. Aunque se ha reportado ningún marcador que etiqueta G2 en el germline de C. elegans , uno puede calcular la duración de la fase G2 al combinar datos de varios experimentos que la fase M (en el momento de la disección) y fase de S (a partir de varios h antes de la etiqueta disección). Una célula que muestra los marcadores de la fase S y fase M había terminado fase G2 durante el curso del experimento. Una célula que muestra sólo el marcador de la fase M y no el marcador de la fase S no estaba en fase S durante el experimento.
      1. Para calcular la duración de la fase G2, pienso EdU para h 2 y co etiqueta con anticuerpo de pH3. Examinar sólo los núcleos que etiqueta con pH3 (estos están en fase de M en el momento de la disección) de la presencia de EdU (eran en fase S en la etiqueta de EdU 2 h antes de la disección). Calcular la fracción de núcleos de fase M que completaron la fase G2 (A / A + B, ver tabla 1 y figura 2).
      2. Repite este experimento con una etiqueta de EdU 3 h y otra vez con una etiqueta de EdU 4 h (y, opcionalmente, una etiqueta de EdU 5 h). Representar el porcentaje de núcleos positivos pH3 que son positivos en el eje y de EdU y la duración de la etiqueta de EdU en el eje x, como se muestra en la Figura 3A.
      3. Calcular la mediana de la duración de la fase G2 conectando los puntos de la gráfica y determinar donde la línea cruza el 50%, como se muestra en la Figura 3A.
      4. Calcular la duración máxima de la fase G2 conectando los puntos de la gráfica y determinar donde la línea cruza el 99%, como se muestra en la Figura 3A.
    8. (Variación de V) Calcular la duraion de G2 + M + G1.
      Nota: En la línea germinal de C. elegans , fase G1 es inusualmente corto. Aunque no se ha reportado ningún marcador para etiquetar G1 en el germline de C. elegans , uno puede estimar la duración de la suma de la fase G1, G2 y M y luego comparar este tiempo con el tiempo de la fase G2 descrito anteriormente. Se estima que la duración máxima de G2 + M + G1 desde el porcentaje de todos los núcleos zona progenitoras (WAPL-1 immunoreactive) que siendo negativo de EdU (fase S no experimentaron) después EdU etiquetado durante varias horas.
      1. Para calcular la duración de G2 + M + G1, pienso EdU para h 2 y co etiqueta con anticuerpo REC-8 o WAPL-1. Determinar la fracción de la zona de progenitoras que experimentó la fase S durante este tiempo (A + C / A + B + C + D, ver tabla 1 y figura 2).
      2. Repite este experimento con una etiqueta de EdU 3 h y otra vez con una etiqueta de EdU 4 h (y, opcionalmente, una etiqueta de EdU 5 h). Representar el porcentaje de REC-8 o 1 WAPL núcleos positivos que son positivos en el eje y EdU y la duración de la etiqueta de EdU en el eje x, como se muestra en la figura 3B.
      3. Calcular la máxima duración de G2 + M + G1 conectando los puntos en el gráfico y encontrar donde la línea cruza el 99%, como se muestra en la figura 3B.
        Nota: Es posible realizar los experimentos para determinar la duración de G2 y G2 + M + G1 como un conjunto único de 2, 3, 4 y 5 h EdU experimentos Co etiquetado con anticuerpos de conejo anti-WAPL-1 y anti-mouse-pH3.
    9. (Variación de VI) Para identificar los núcleos que en la zona de la progenitora, pero han entrado meiosis, alimentar los animales EdU durante 10 h y co etiqueta con anticuerpos REC-8 o WAPL-1. Cualquier núcleos Mostrar etiqueta de EdU estaban en fase S durante esos 10 h. Cualquier núcleo que no se muestran tinción REC-8 o 1 WAPL nucleoplasmática fueron en la meiosis. Simplemente contar los núcleos con etiquetado de EdU que no muestran el etiquetado con el marcador de zona de progenitoras (E, ver tabla 1).
      Nota: Por el contrario, si las gónadas están manchadas para el marcador de la profase meiótica HIM-3 con anticuerpos anti-él-3, cuenta el número de núcleos con EdU de etiquetado son también positivas para él-3.
    10. Para calcular la tasa de entrada meiótica, realizar el experimento anterior con una marca de 5 h, 10 h y 15 h de EdU. Representar el número de núcleos que en la meiosis en el eje y y la duración de la etiqueta de EdU en el eje x, como se muestra en la figura 3. Luego utilizar una regresión lineal simple para calcular la pendiente (meiosis núcleos entrados por h) desde y = mx + b.
      Nota: Es fundamental utilizar una regresión lineal para calcular la tasa de entrada meiótica. Sería incorrecto simplemente divida el número de núcleos que entró en la meiosis por la duración de la etiqueta de EdU, ya que la intersección no es cero.
    11. (Variación VII) Medir la velocidad de progresión meiótica.
      Nota: Puesto que EdU se incorpora covalentemente en el ADN, puede utilizarse para realizar un seguimiento de una población de células a través de la diferenciación. Las células que experimentaron la fase S en la zona de progenitor conservan la etiqueta de EdU ya que entra en meiosis, progreso a través de la meiosis y se someten a ovogénesis. Un experimento de Pulso-persiga con EdU puede utilizarse para medir la velocidad de progresión meiótica.
      1. Alimentación etiquetada EdU las bacterias a los animales durante 4 horas (el "pulso"). Transferir los animales a las bacterias sin etiqueta de OP50 durante 48 h ("chase"), a continuación diseccionar y co la etiqueta con un marcador de zona de progenitor como REC-8 o WAPL-1 (o un marcador de la profase meiótica como él-3) si se desea.
      2. Cuando la proyección de imagen, busque la posición del núcleo más próximo marcado con EdU. La tasa de progresión meiótica es la distancia (en diámetros de celular desde el final de la zona de progenitor) viajó por el EdU más proximal marcado núcleo durante la persecución de 48 h.

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Resultados

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Puesto que la síntesis de ADN es necesaria para incorporar a EdU, se puede concluir que núcleos marcados con EdU experimentaron la fase S durante la ventana Etiquetado EdU. Uno puede interpretar los núcleos etiqueta en una alimentación de 30 min con EdU etiquetado bacterias como núcleos en fase S en el momento de la disección. Núcleos que etiqueta en un EdU continua ya experimento de alimentación indicados en la última parte de la ventana del tiempo EdU o pueden han etiquetado como tempra...

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Discusión

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Preparación de bacterias etiquetadas de EdU (paso 1) es fundamental para este protocolo y el primer punto para solucionar problemas. Etiqueta tipo salvaje jóvenes adultos hermafroditas muy confiablemente en un 4 h EdU-pulso, haciendo de este un control útil para cada lote nuevo de bacterias EdU-labeled. Además, bacterias EdU-con la etiqueta intactas que entran en el intestino (en animales más viejos o ciertos mutantes defectuosos de faringe grinder) etiqueta con química del tecleo y aparecen como brillante orificio oblon...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos al centro común de e. coli MG1693; Wormbase; el centro de genética de Caenorhabditis financiado por los institutos de salud oficina de investigación infraestructura programas nacionales (P40OD010440) para las cepas; Zach Pincus Consejo estadístico; Aiping Feng de reactivos; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar y John Brenner para capacitación, asesoramiento, apoyo y discusión útil; y los laboratorios Kornfeld y Schedl por comentarios sobre este manuscrito. Este trabajo fue financiado en parte por los institutos nacionales de salud [AG02656106A1 R01 a KK, GM100756 R01 a TS] y una beca predoctoral de la Fundación Nacional de Ciencias [DGE-1143954 y DGE-1745038 a ZK]. Los institutos nacionales de salud ni la National Science Foundation tenía cualquier papel en el diseño del estudio, colección, análisis e interpretación de datos, ni por escrito el manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
E. coli MG1693Coli Genetic Stock Center6411crece bien en LB
em>E. coli estándar no suplementado OP50Caenorhabditis Genetics CenterOP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de imágenesThermo Fisher ScientificC10337
5-ethinil-2′-desoxiuridinaSigma900584-50MGo use EdU provisto en el kit
GlucosaSigmaD9434-500GD-(+)-Dextrosa
Tiamina (Vitamina B1)SigmaT4625-5GGrado Reactivo
TimidinaSigma T1895-1GBioReactivo
Sulfato de magnesio heptahidratadoSigmaM1880-1KGMgSO4,
Fosfato de Sodio de Grado Reactivo, dibásico, anhidroFisherBP332-500GNa2HPO4
Fosfato de potasio, monobásicoSigmaP5379-500GKH2PO4
Cloruro de amonioSigmaA4514-500GNH4Cl, reactivo más
agar bacteriológicoUS BiológicoC13071058 Cloruro
de calcio dihidratadoSigmaC3881-500GCaldo CaCl
LB (Miller)SigmaL3522-1KGUsado a 25 g / L
LevamisolSigmaL9756-5G0.241 g / 10 ml
Solución salina tamponada con fosfatoCalbiochem Omnipur6506PBS casero funciona igual
de bien Tween-20SigmaP1379-500ML
16% Paraformaldehído, ampollas de grado EMCiencias de la microscopía electrónica 15710ampollas de 10 ml
100% metanolThermo Fisher ScientificA454-1Les fundamental para una morfología adecuada con ciertos anticuerpos
Suero de cabraGibco16210-072Lote 1671330
conejo-anti-WAPL-1Novus biologicals49300002lote G3048-179A02, utilizado a 1:2000
clon de ratón anti-pH3 3H10Millipore05-806Lote#2680533, utilizado a 1:500
cabra anti-conejo IgG conjugada Alexa Fluor 594InvitrogenA11012Lote 1256147, utilizado en 1:400
cabra-anti-ratón IgG conjugado Alexa Fluor 647InvitrogenA21236Lote 1511347, utilizado en 1:400
Medio de montaje antidecoloración Vectashield que contiene 4',6-Diamidino-2-Fenilindol Dihidrocloruro (DAPI)Vector LaboratoriesH-1200En su lugar, se puede usar un medio de montaje sin DAPI, siguiendo un esmalte de uñas de incubación DAPI por separado
Wet n WildDTC450Bcualquier esmalte de uñas transparente debería funcionar
S-mediumvariosver wormbook.org para el protocolo
Tampón M9variosver wormbook.org para el protocolo
Agar M9variosmisma receta que el tampón M9, pero agregue agar al 1.7%
Medio de crecimiento de nematodosvariosver wormbook.org para el vidrio
reloj de disecciónde protocolo Carolina Biological42300
Película de laboratorio ParafilmPechiney Embalaje de plásticoPM-996 Película delaboratorio de 4 pulgadas de ancho
Placas60 mm
de
Tubos de centrífuga de 1 mlMidSci Avant2926
Puntas
Pipetas serológicas Matraz
Erlenmyer de 500 ml
Papel
25G Agujas de 5/8"BD PrecisionGlide 
tubo de centrífuga de vidrio de 5 mlPyrex 
Tubos de vidrio de borosilicato 1 ml
portaobjetos de
n.º 1 cubreobjetos 22 x 40 mmn.º 1,5 pueden funcionar, también
37 & deg; C Incubadora
Centrífuga de mesa Centrífuga
clínicaIEC428con rotor de 6 cucharas oscilantes
Mini centrífuga
20 ° Incubadora
4 ° C refrigerador-20
° C congelador
Observer Z1 microscopioZeiss
Plan Apo 63X 1.4 lente objetivo de inmersión en aceiteZeiss
Ultraview Vox sistema confocal de disco giratorioPerkinElmer El sistema confocal de disco giratorio de Nikon también funciona muy bien, como se describe aquí: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 
<El metanol con etiqueta de oro la de de Petri de vidrio largo de diámetrode aluminio305122vidrioShakerC

Referencias

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