Ex Vivo Proyección de imagen del calcio celular específicos de señalización en la sinapsis tripartita del diafragma del ratón

Resumen

Aquí presentamos un protocolo de calcio imagen señalización en poblaciones individuales de tipos de células en la Unión neuromuscular murino.

Resumen

La actividad eléctrica de las células en los tejidos puede ser monitoreada por técnicas electrofisiológicas, pero éstos se limitan generalmente para el análisis de células individuales. Ya que un aumento del calcio intracelular (Ca^{2 +}) en el citosol ocurre a menudo debido a la actividad eléctrica, o en respuesta a una multitud de otros estímulos, este proceso puede ser monitoreado por la proyección de imagen de células cargadas con fluorescente sensible al calcio colorantes.  Sin embargo, es difícil esta respuesta en un tipo de células individuales dentro del tejido de todo la imagen porque estos tintes son tomados por todos los tipos de células dentro del tejido. En cambio, los indicadores genético codificados calcio (GECIs) pueden expresarse mediante un tipo de célula individual y fluorescencia en respuesta a un aumento de intracelular Ca^{2 +}, lo que permite la proyección de imagen de Ca^{2 +} en poblaciones enteras de tipos de células individuales. Aquí aplicamos el uso de GECIs GCaMP3/6 a la Unión neuromuscular de ratón, células de Schwann de sinapsis entre las neuronas motoras, el músculo esquelético y terminal/perisynaptic tripartita. Demostramos la utilidad de esta técnica en preparaciones de tejido clásico ex vivo . El uso de un divisor óptico, realizar proyección de imagen de doble longitud de onda de Ca^{2 +} señales de dinámica y estática etiqueta de la placa neuromuscular (NMJ) en un enfoque que podría ser fácilmente adaptado para monitorear dos GECI específicos de la célula o voltaje genéticamente codificado indicadores (GEVI) simultáneamente. Finalmente, discutimos las rutinas que utilizan para capturar mapas espaciales de intensidad de fluorescencia. Juntos, pueden emplearse estas técnicas ópticas, transgénicos y analíticas para el estudio de la actividad biológica de las subpoblaciones de células distintas en el NMJ en una amplia variedad de contextos.

Introducción

El NMJ, como todas las sinapsis, se compone de tres elementos: una terminal presináptica deriva de una neurona, una célula postsynaptic neurona/efector, y un perisynaptic glial de la célula^1,2. Mientras que los aspectos básicos de la transmisión sináptica se demostraron por primera vez en esta sinapsis³, muchos aspectos de este proceso siguen siendo desconocidos, en parte debido a la expresión de las moléculas del mismo por los distintos elementos celulares de esta sinapsis. Por ejemplo, se expresan receptores para acetilcolina (ACh) tanto el nucleótido de purina adenina ATP que conjunt....

Protocolo

Cría de animales y los experimentos se realizaron según los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y la IACUC en la Universidad de Nevada.

1. preparación de los diafragmas y los nervios frénicos de ratones transgénicos

1. Comprar ratones transgénicos y cartillas del oligonucleótido a genotipo de estos ratones.
   Nota: Los iniciadores están listados en la página de "Información" para cada uno de estos ratones.
   1. Criar un ratón de 3 a 6 meses expresando una copia del apropiada transgénicos/knock-in Cre-controlador alelo y cero copias del alelo GCaMP3/6 condicional con un seg....

Resultados

Varios ejemplos de cambios de intensidad de fluorescencia, mediados por el aumento de intracelular Ca^{2 +} dentro de tipos definida de la célula de la NMJ, Mostrar la utilidad de este enfoque. Estos resultados se presentan como mapas de intensidad de fluorescencia espacial, que proporcionan la localización de las células respondieron a esta pregunta, así como la intensidad de sus respuestas, lo que permite la evaluación de cuántas células responden y cuánto cada célula responde a.......

Discusión

Aquí le ofrecemos algunos ejemplos de medición de Ca^{2 +} respuestas en células específicas en tejido neuromuscular intacto usando ratones expresan GECI. Para realizar exitosamente estos experimentos, es imperativo de no lesionar el nervio frénico durante la disección. Para imagen de Ca^{2 +} respuestas en las células de Schwann en baja o alta energía (es decir, 20 X o 60 X), es necesario utilizar BHC o μ-Conotoxina al movimiento del bloque. Para la proyección de imagen de baja potencia de Ca

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones Myf5-Cre	Jax	#007893	Impulsa la expresión de las células musculares ya en E136
Wnt1-Cre ratones	Jax	#003829	Impulsa la expresión en todos  Células de Schwann en E13 pero no en P209
Sox10-Cre ratones	Jax	#025807	Impulsa la expresión de células de Schwann a edades más avanzadas
Ratones GCaMP3 condicionales	Jax	#029043	Expresa GCaMP3 de manera específica para cada célula
Ratones GCaMP6f condicionales	Jax	#024105	Expresa GCaMP6f de forma
específica para cada célulaBHC (3-(N-butiletilatidoilo)-4-hidroxi-2H-cromado-2-ona)	Hit2Lead	#5102862	Bloquea la miosina del músculo esquelético pero no la neurotransmisión6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	Etiqueta los grupos de receptores de acetilcolina en NMJ
µ-conotoxina GIIIb	Peptides Int'l	#CONO20-01000	Bloques Nav1.4 canal de sodio dependiente de voltaje8
Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel .9KG	Permite la inmovilización del diafragma mediante clavijas minucienas
Pines minuciosos (0,1 mm de diámetro)	Fine Science Tools	26002-10	Inmoviliza el diafragma en gel dieléctrico de silicona
Microscopio vertical Eclipse FN1	Nikon	MBA74100	Permite la puesta en escena y la observación de muestras
Plataforma de microscopio fijo básica con traductor manual de microscopio XY	Autom8	MXMScr	Permite el movimiento de la muestra
Micromanipulador manual	Narishige	M-152	Sostiene electrodos de grabación y estimulación
Amplificador de microelectrodos	Molecular Devices	Axoclamp 900A	Permite el registro electrofisiológico intracelular
electrodos afilados Sistema de adquisición de datos de bajo ruido Microelectrodo	Molecular Devices	Digidata 1550	Permite la adquisición de datos electrofisiológicos
Sistema de análisis de datos de microelectrodos	Molecular Devices	PCLAMP 10 Standard	Realiza análisis de datos electrofisiológicos
Estimulador de onda cuadrada	Grass	S48	Estimula el nervio para excitar el músculo
Unidad de aislamiento de estímulos	Grass	PSIU6	Reduce  artefactos de estimulación
Filamentos de borosilicato, diámetro exterior de 1,0 mm, diámetro interno de 0,5 mm	Sutter	FG-GBF100-50-15	Empala y registra los potenciales musculares evocados por los nervios
Filamentos de borosilicato, diámetro exterior de 1,5 mm, diámetro interior de 1,17 mm	Sutter	BF150-117-15	Alargado y utilizado para electrodo de succión
Extractor de micropipetas	Sutter	P-97	Tira y prepara los electrodos de registro
Cámara cMOS retroiluminada de 1200x1200 píxeles	Photometrics	Prime 95b	Cámara sensible que permite imágenes de alta resolución y alta velocidad
Fuente de luz	Lumencor	Spectra X	Proporciona iluminación de LED para la observación de fluorescencia
Objetivos de inmersión en agua fluorescentes corregidos al infinito, W.D. 2mm	Nikon	CFI60	Proporciona largas distancias de trabajo para la visualización de muestras
Iluminador de fibra óptica con lámpara halógena	Sumita	LS-DWL-N	Proporciona iluminación para la observación de campo claro
W-View Gemini Image Splitter	Hamamatsu	A12801-01	Proyecta 1 par de imágenes de doble longitud de onda separadas por una cámara dicroica a una sola cámara
Filtros de paso de banda única  (512/25-25 y 630/92-25)	SemRock	FF01-512/25-25; FF01-630/92-25	Permite la adquisición de imágenes de doble banda
560 nm Divisor de haz dicroico de un solo borde	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	Espejo dicroico que separa los haces de luz para permitir la obtención de imágenes de doble longitud de onda
Sistema de adquisición de datos de imagen	Nikon	NIS Elements - MQS31000	Permite la adquisición de datos
de imagen Módulo de control de longitud de onda	Nikon	MQS41220	Módulo para imágenes de datos
Módulo de hardware divisor de emisiones	Módulo de MQS41410 de Nikon		para la adquisición de datos de imagen
Sistema de análisis de datos de imagen	NA	Volumetry 8D5, Fiji	Permite el análisis de la intensidad de fluorescencia y otros datos de imagen

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