Ex Vivo Proyección de imagen del calcio celular específicos de señalización en la sinapsis tripartita del diafragma del ratón

Resumen

Aquí presentamos un protocolo de calcio imagen señalización en poblaciones individuales de tipos de células en la Unión neuromuscular murino.

Resumen

La actividad eléctrica de las células en los tejidos puede ser monitoreada por técnicas electrofisiológicas, pero éstos se limitan generalmente para el análisis de células individuales. Ya que un aumento del calcio intracelular (Ca^{2 +}) en el citosol ocurre a menudo debido a la actividad eléctrica, o en respuesta a una multitud de otros estímulos, este proceso puede ser monitoreado por la proyección de imagen de células cargadas con fluorescente sensible al calcio colorantes.  Sin embargo, es difícil esta respuesta en un tipo de células individuales dentro del tejido de todo la imagen porque estos tintes son tomados por todos los tipos de células dentro del tejido. En cambio, los indicadores genético codificados calcio (GECIs) pueden expresarse mediante un tipo de célula individual y fluorescencia en respuesta a un aumento de intracelular Ca^{2 +}, lo que permite la proyección de imagen de Ca^{2 +} en poblaciones enteras de tipos de células individuales. Aquí aplicamos el uso de GECIs GCaMP3/6 a la Unión neuromuscular de ratón, células de Schwann de sinapsis entre las neuronas motoras, el músculo esquelético y terminal/perisynaptic tripartita. Demostramos la utilidad de esta técnica en preparaciones de tejido clásico ex vivo . El uso de un divisor óptico, realizar proyección de imagen de doble longitud de onda de Ca^{2 +} señales de dinámica y estática etiqueta de la placa neuromuscular (NMJ) en un enfoque que podría ser fácilmente adaptado para monitorear dos GECI específicos de la célula o voltaje genéticamente codificado indicadores (GEVI) simultáneamente. Finalmente, discutimos las rutinas que utilizan para capturar mapas espaciales de intensidad de fluorescencia. Juntos, pueden emplearse estas técnicas ópticas, transgénicos y analíticas para el estudio de la actividad biológica de las subpoblaciones de células distintas en el NMJ en una amplia variedad de contextos.

Introducción

El NMJ, como todas las sinapsis, se compone de tres elementos: una terminal presináptica deriva de una neurona, una célula postsynaptic neurona/efector, y un perisynaptic glial de la célula^1,2. Mientras que los aspectos básicos de la transmisión sináptica se demostraron por primera vez en esta sinapsis³, muchos aspectos de este proceso siguen siendo desconocidos, en parte debido a la expresión de las moléculas del mismo por los distintos elementos celulares de esta sinapsis. Por ejemplo, se expresan receptores para acetilcolina (ACh) tanto el nucleótido de purina adenina ATP que conjuntamente son liberados por las neuronas motoras en lo vertebrado NMJ, músculo, células de Schwann y las neuronas motoras, así que complica la interpretación de cualquier efecto funcional ejercida por estas sustancias (p. ej., liberación de transmisor o respuesta, generación de fuerza muscular)⁴. Por otra parte, aunque los componentes tripartitos de la NMJ son simples en comparación con, por ejemplo, las neuronas en el sistema nervioso central que a menudo exhiben múltiples entradas sinápticas, si las neuronas motoras, las células musculares o las células de Schwann varían en respuesta a estímulos en en su intrínseca heterogeneidad (p. ej., derivación embrionaria, subtipo de fibra, morfología) es confuso. Para abordar cada uno de estos temas, sería ventajoso seguir simultáneamente la respuesta de muchas células dentro de un elemento sináptica, como pista, a la vez, una respuesta en cualquiera de los otros elementos. Estrategias convencionales utilizando colorantes químicos para medir calcio señalización no pueden alcanzar estos dos objetivos, porque aplicar baño de tinte es tomado por varios tipos de la célula después de la aplicación al tejido, y tinte intracelular cargado puede utilizarse para visualizar individuales o pequeñas cohortes de las células. Aquí, utilizando ratones transgénicos que expresaban GECIs diseñado para medir calcio celular específico señalización, junto con la proyección de imagen específica y herramientas de software⁵, que demostrar la primera de estas dos metas generales y discutir cómo la adición de nuevos herramientas de transgénicos ayudaría a alcanzar al segundo. Esta técnica será útil para cualquier persona interesada en el seguimiento de la dinámica del calcio u otro celular señalización observable de eventos a través de sensores ópticos codificada por el gen en varias poblaciones de la célula al mismo tiempo.

Protocolo

Cría de animales y los experimentos se realizaron según los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y la IACUC en la Universidad de Nevada.

1. preparación de los diafragmas y los nervios frénicos de ratones transgénicos

1. Comprar ratones transgénicos y cartillas del oligonucleótido a genotipo de estos ratones.
   Nota: Los iniciadores están listados en la página de "Información" para cada uno de estos ratones.
   1. Criar un ratón de 3 a 6 meses expresando una copia del apropiada transgénicos/knock-in Cre-controlador alelo y cero copias del alelo GCaMP3/6 condicional con un segundo ratón de la misma edad, expresando uno o dos ejemplares de la condicional GCaMP3 / 6 alelo y cero copias del alelo Cre-driver.
   2. Genotipo del PUP y marca los Cre y condicional GCaMP3/6 alelos — éstos en lo sucesivo se llamará ratones transgénicos doble (e.g., Myf5-Cre, GCaMP3 condicional)⁶.
      Nota: Esta forma, todos los datos se derivan de los ratones que expresaban una copia de la Cre y condicional GCaMP3/6 alelos. Esto es particularmente importante cuando se añade en otros ratones mutantes (p. ej., agujeros ciegos) para estos cruces.
2. Cuando los ratones transgénicos doble son de la edad apropiada (p. ej., día postnatal 0 o 5 [P0 o P5] o adultos), eutanasia los ratones decapitando con tijeras (para los ratones más jóvenes que P10) o colocarlos en una cámara de inhalación isoflurane, cuando son ya no responde a pellizcar la cola con un par de pinzas, están listos para sacrificio.
3. El animal de sacrificio por decapitación con un par de tijeras.
4. Sección transversal en el animal entero justo debajo del hígado y un poco más el corazón y los pulmones con tijeras de iridectomía.
5. Diseccionar, el hígado, el corazón y los pulmones, teniendo cuidado de mantener una longitud del nervio frénico que es suficientemente largo para ser dibujado en un electrodo de succión (es decir, 1-2 cm).
   Nota: El nervio frénico izquierdo puede ser identificado como un pedazo blanco de tejido que entra en la porción medial del diafragma izquierdo. No debe cortarse al retirar los pulmones. El nervio frénico derecho funciona dentro de una pieza de fascia que también contiene la vena cava superior y es más delgado y más blanco que la vena cava. Juntos, ambos penetran el diafragma intermedio derecho.
6. Además quitar la caja torácica y la columna vertebral, excepto la cresta delgada alrededor de la membrana.
7. Poner la muestra del nervio frénico y el diafragma en un tubo de microcentrífuga con solución de Krebs-Ringer con 594-αBTX de 1 μg/mL durante 10 minutos en la oscuridad.
   Nota: Esta concentración de 594-αBTX etiquetas de receptores de ACh (AChRs) sin bloquear su función (observación personal).

2. estimulación y registro de los potenciales de acción muscular

1. Con pernos minutien, inmovilizar el diafragma por fijación sobre un plato de 6 cm revestida con gel dieléctrico de silicona llena con 8 mL de solución de Krebs-Ringer oxigenada y colóquela sobre la platina del microscopio. Perfusión del diafragma con más solución de Krebs-Ringer (8 mL/min) durante 30 minutos.
   Nota: Esto enjuaga el 594-αBTX independiente, así como equilibra el tejido después de la disección.
2. Hacer un electrodo de succión según los métodos establecidos⁷.
   1. Con 4 aumentos, utilizando un micromanipulador, mueva el electrodo de succión sobre el nervio frénico izquierdo y aplicar succión jalando el cilindro de una jeringa de 5 mL conectada a la tubería que se une al electrodo de succión.
      Nota: Cuando dibuja con éxito en el electrodo de succión, el nervio frénico es tenso. Encender el estimulador y estimular el frénico nervio poniendo el manual interruptor 1 x.
   2. Asegúrese de que el diafragma se contrae en respuesta a la estimulación de 1 Hz examinando visualmente con luz trasmitida. Si no es así, ajuste la tensión girando la perilla de tensión progresivamente para lograr un impulso supramaximal, que puede ser verificado por un examen visual de la contracción muscular. Si todavía no es visible, soplar el nervio con la jeringa y tratar de dibujarlo nuevo aplicando succión.
3. Cierre la perfusión y añadir el inhibidor BHC miosina de músculo-específica del⁶ o el canal voltaje-bloqueado del sodio antagonista μ-Conotoxina⁸ a una concentración final de 100 μm.
   1. 100 μm BHC, pipetear 4 μL del stock de 200 mM en DMSO y prediluir en 1 mL de solución de Krebs-Ringer.
   2. Extraer 1 mL de solución de Krebs-Ringer el plato.
   3. Añadir la CSF prediluida, al plato.
      Nota: Esta dilución ayuda a prevenir la inducción por DMSO sin diluir de una respuesta fluorescente no transitoria en células de expresión GCaMP3.
   4. Espere 30 minutos y girar en la perfusión de solución de Krebs-Ringer fresca para otros 20-30 minutos.
4. Prepare el electrodo de la grabación.
   1. Usando guantes, coloque un vidrio el de borosilicato con un diámetro exterior (OD) de 1 mm y un diámetro interno (ID) de 0,4 mm en un tirador de la micropipeta y apriete los diales para fijar en su posición. Cierre la puerta tirador.
   2. Utilizando un extractor de P-97, programa el siguiente ajuste: calor en 900, tire 120, velocidad en 75, tiempo en 250, presión a 500 y no hay lazos adicionales.
      Nota: Resistance (R) se mide mediante los controles del software del amplificador: el software de adquisición de datos confirma resistencia resolviendo la formula V = ir El controlador de software pasa una corriente conocida (I) (típicamente 1 nA) a través de los electrodos y mide el cambio en el voltaje (V), lo que nos permite resolver para R.
   3. Para membranas embrionarias, asegúrese de que la resistencia es cerca de 60 MΩ y diafragmas mayores, 10-20 MΩ. Coloque el electrodo de la grabación con 3 M de KCl.
5. Con 10 aumentos, baje el electrodo muscular, utilizando un micromanipulador segundo en el lado opuesto de la etapa como un electrodo de estimulación.
6. Utilizando el software de adquisición de datos electrofisiológicos, espere hasta que el potencial de membrana reposo cambia de 0 a -65 mV o más abajo.
7. Estimular a 1 Hz y verificar la presencia de un potencial de acción muscular comprobando un gran potencial que exhibe un modesto overshoot (potencial que se eleva por encima de 0 mV cuando empieza en -65 mV o más abajo). No confundir el artefacto de estimulación con un potencial de acción.
   Nota: Potenciales son significativamente más largos en duración (~ 5 ms) de artefactos de estimulación.

3. la proyección de imagen de la fluorescencia de la muestra

1. Con 20 aumentos, localizar la banda de la placa de extremo en el centro del músculo buscando NMJs 594-αBTX – etiquetados bajo excitación luz verde/amarillo (550 nanómetro). Cambiar a la excitación de luz azul (470 nm) imagen Ca^{2 +} respuestas en músculo, motoneuronas o las células de Schwann.
2. Si lo desea, configurar el divisor de imagen con Filtros pasabanda y un filtro dicroico de single-edge para la proyección de imagen de doble longitud de onda.
3. Para calcular la fluorescencia máxima (Fmax) exhibida por el tejido GCaMP3/6-expresando, añadir 12 μl 3 M de cloruro de potasio (KCl) a las preparaciones de diafragma⁶.
   1. Realizar experimentos con la barra de brillo en la barra de búsqueda mesa al 110% del nivel en el que el tejido GCaMP3/6-expresión muestra saturación a 20 aumentos, sin binning en respuesta a KCl.
4. Grabar a 20 fotogramas por segundo y no te pierdas ningún evento rápido.
5. Estimular con s 1-45 de 20 a 40 Hz de estimulación nerviosa mediante la entrega de un tren de impulsos utilizando el electrodo de succión o agregar a agonistas farmacológicos por el uso del baño o por perfusión y recoger la dinámica fluorescente Ca^{2 +} respuestas en subtipo de una célula junto con la señal de estática 594-αBTX NMJ.
   Nota: Si específicas de tejido rojos o far-red GECI o GEVI ratones se convierten en disponibles para su uso en el NMJ, puede utilizados para recoger dos señales dinámicas que refleja dos elementos celulares diferenciados en el NMJ.
6. Cuando los experimentos electrofisiológicos o proyección de imagen se acaban porque se han logrado los resultados deseados, inundar de agua a través de las líneas de perfusión y aspirar agua 2 x - 3 x por el electrodo de succión para asegurar que no acumular sales.

4. exportación y análisis de los datos de un mapa de intensidad de fluorescencia de desviación estándar (SD_iu16)

1. Grabar secuencias de imágenes grabadas como pilas de 16-bit TIFF y cargarlos en el sistema deseado imágenes del análisis de datos para el análisis.
2. En el menú de archivo del software d 8, seleccione imagen pila de interés y haga clic para cargar.
   1. Una vez que se carga el video, escanear a través del tiempo para identificar una sección que no tiene ninguna actividad fluorescente celular.
      Nota: Esta región se utilizará para crear una muestra de fondo.
   2. Presionada la tecla Mayús y haga clic en para dibujar una región de la caja de interés (ROI) en la zona identificada como el área de muestra de fondo.
   3. Después de crear el cuadro, presione la barra espaciadora para generar un diagrama de cambio de actividad de fondo.
   4. Haga clic derecho en el rastro y seleccione la opción clasificados para presentar la opción al ROI de la descarga como texto para hacer el rastro como un archivo de texto de coordenadas xy.
3. Volviendo al video de interés, scan de nuevo para identificar la región de tiempo donde se produce la actividad de interés.
   1. Utilizando el botón central del ratón, seleccionar esta región de tiempo en el cuadro de tiempo amarillo.
   2. Haga clic derecho sobre el video y selecciona Stack OPS y después Stat mapa 5.
      Nota: Esto generará un mapa de desviación estándar (SD mapa) en la ventana izquierda.
   3. Haga clic en el mapa de SD y luego oprima el ] tecla 19 x para aplicar el mapa de calor de color apropiado.
   4. Haga el mapa SD y seleccione STM cargar y guardar, que presentará la opción Guardar stm como tiff para guardar el mapa de SD.
   5. Entonces, pulse el [ clave 19 x para volver al mapa de color de escala de grises.
   6. Presione C y luego D para traer herramientas de mapeo de la densidad. Usando el botón izquierdo del ratón y el botón central de ratón, ajustar el umbral para incluir toda la actividad fluorescente que se muestra en el mapa de SD.
   7. Pulse C para cerrar las herramientas de densidad manteniendo la configuración de umbral.
   8. Haga el mapa SD y seleccione STM partículas y luego Encontrar PTCLS.
      Nota: Esto permitirá identificar las células individuales que expresan actividad fluorescente.
   9. Haga el mapa SD una vez más y seleccione Crear partículas ROIs.
      Nota: Esto superponen las celdas seleccionadas en el video original de interés.
   10. Manteniendo Shiftcon el botón derecho en cualquiera de la partícula ahora identificada ROIs en el video original.
   11. Seleccione marcador ROI y medida Int en ROI.
       Nota: Esto generará actividad fluorescente individual de parcelas para cada ROI identificado en el vídeo de interés. Estos se pueden guardar pulsando uno de estos y selección de surtidos, seguidos del ROI de la descarga como texto.
4. Toda lógica subyacente a estas operaciones, consulte el código de fuente archivos⁹.

Resultados

Varios ejemplos de cambios de intensidad de fluorescencia, mediados por el aumento de intracelular Ca^{2 +} dentro de tipos definida de la célula de la NMJ, Mostrar la utilidad de este enfoque. Estos resultados se presentan como mapas de intensidad de fluorescencia espacial, que proporcionan la localización de las células respondieron a esta pregunta, así como la intensidad de sus respuestas, lo que permite la evaluación de cuántas células responden y cuánto cada célula responde a...

Discusión

Aquí le ofrecemos algunos ejemplos de medición de Ca^{2 +} respuestas en células específicas en tejido neuromuscular intacto usando ratones expresan GECI. Para realizar exitosamente estos experimentos, es imperativo de no lesionar el nervio frénico durante la disección. Para imagen de Ca^{2 +} respuestas en las células de Schwann en baja o alta energía (es decir, 20 X o 60 X), es necesario utilizar BHC o μ-Conotoxina al movimiento del bloque. Para la proyección de imagen de baja potencia de Ca

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones Myf5-Cre	Jax	#007893	Impulsa la expresión de las células musculares ya en E136
Wnt1-Cre ratones	Jax	#003829	Impulsa la expresión en todos  Células de Schwann en E13 pero no en P209
Sox10-Cre ratones	Jax	#025807	Impulsa la expresión de células de Schwann a edades más avanzadas
Ratones GCaMP3 condicionales	Jax	#029043	Expresa GCaMP3 de manera específica para cada célula
Ratones GCaMP6f condicionales	Jax	#024105	Expresa GCaMP6f de forma
específica para cada célulaBHC (3-(N-butiletilatidoilo)-4-hidroxi-2H-cromado-2-ona)	Hit2Lead	#5102862	Bloquea la miosina del músculo esquelético pero no la neurotransmisión6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	Etiqueta los grupos de receptores de acetilcolina en NMJ
µ-conotoxina GIIIb	Peptides Int'l	#CONO20-01000	Bloques Nav1.4 canal de sodio dependiente de voltaje8
Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel .9KG	Permite la inmovilización del diafragma mediante clavijas minucienas
Pines minuciosos (0,1 mm de diámetro)	Fine Science Tools	26002-10	Inmoviliza el diafragma en gel dieléctrico de silicona
Microscopio vertical Eclipse FN1	Nikon	MBA74100	Permite la puesta en escena y la observación de muestras
Plataforma de microscopio fijo básica con traductor manual de microscopio XY	Autom8	MXMScr	Permite el movimiento de la muestra
Micromanipulador manual	Narishige	M-152	Sostiene electrodos de grabación y estimulación
Amplificador de microelectrodos	Molecular Devices	Axoclamp 900A	Permite el registro electrofisiológico intracelular
electrodos afilados Sistema de adquisición de datos de bajo ruido Microelectrodo	Molecular Devices	Digidata 1550	Permite la adquisición de datos electrofisiológicos
Sistema de análisis de datos de microelectrodos	Molecular Devices	PCLAMP 10 Standard	Realiza análisis de datos electrofisiológicos
Estimulador de onda cuadrada	Grass	S48	Estimula el nervio para excitar el músculo
Unidad de aislamiento de estímulos	Grass	PSIU6	Reduce  artefactos de estimulación
Filamentos de borosilicato, diámetro exterior de 1,0 mm, diámetro interno de 0,5 mm	Sutter	FG-GBF100-50-15	Empala y registra los potenciales musculares evocados por los nervios
Filamentos de borosilicato, diámetro exterior de 1,5 mm, diámetro interior de 1,17 mm	Sutter	BF150-117-15	Alargado y utilizado para electrodo de succión
Extractor de micropipetas	Sutter	P-97	Tira y prepara los electrodos de registro
Cámara cMOS retroiluminada de 1200x1200 píxeles	Photometrics	Prime 95b	Cámara sensible que permite imágenes de alta resolución y alta velocidad
Fuente de luz	Lumencor	Spectra X	Proporciona iluminación de LED para la observación de fluorescencia
Objetivos de inmersión en agua fluorescentes corregidos al infinito, W.D. 2mm	Nikon	CFI60	Proporciona largas distancias de trabajo para la visualización de muestras
Iluminador de fibra óptica con lámpara halógena	Sumita	LS-DWL-N	Proporciona iluminación para la observación de campo claro
W-View Gemini Image Splitter	Hamamatsu	A12801-01	Proyecta 1 par de imágenes de doble longitud de onda separadas por una cámara dicroica a una sola cámara
Filtros de paso de banda única  (512/25-25 y 630/92-25)	SemRock	FF01-512/25-25; FF01-630/92-25	Permite la adquisición de imágenes de doble banda
560 nm Divisor de haz dicroico de un solo borde	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	Espejo dicroico que separa los haces de luz para permitir la obtención de imágenes de doble longitud de onda
Sistema de adquisición de datos de imagen	Nikon	NIS Elements - MQS31000	Permite la adquisición de datos
de imagen Módulo de control de longitud de onda	Nikon	MQS41220	Módulo para imágenes de datos
Módulo de hardware divisor de emisiones	Módulo de MQS41410 de Nikon		para la adquisición de datos de imagen
Sistema de análisis de datos de imagen	NA	Volumetry 8D5, Fiji	Permite el análisis de la intensidad de fluorescencia y otros datos de imagen

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