Artículo de método

Medida de alto rendimiento de membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos

DOI:

10.3791/58351

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7 de enero de 2019

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1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí describimos un análisis basado en la fluorescencia de alto rendimiento que mide la membrana plasmática resellado eficiencia mediante análisis fluorométrico y proyección de imagen en células vivas. Este ensayo puede utilizarse para la detección de drogas o genes diana que regulan el cierre de membrana plasmática en células de mamíferos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En su entorno fisiológico, células de mamíferos a menudo son sometidas a tensiones mecánicas y bioquímicas que resultan en daño de la membrana plasmática. En respuesta a estos daños, maquinarias moleculares complejas rápidamente volver a cerrar herméticamente la membrana plasmática para recuperar su función de barrera y mantener la supervivencia celular. A pesar de 60 años de investigación en este campo, todavía no tenemos un conocimiento profundo de la célula resellado maquinaria. Con el objetivo de identificar los componentes celulares cierre de membrana del plasma de control o fármacos que pueden mejorar el servicio, hemos desarrollado un ensayo de alto rendimiento basado en la fluorescencia que mide la membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos cultivadas en microplacas. Como sistema modelo para el daño de la membrana plasmática, las células se exponen a la bacterianas formadoras de poro toxina listeriolysin O (LLO), que forma grandes 30-50 nm de diámetro proteínico poros en colesterol membranas. El uso de un lector de microplacas de varios modos de funcionamiento con control de temperatura permite mediciones spectrofluorometric rápido y sensible en combinación con brightfield y de imágenes de microscopía de fluorescencia de las células vivas. Análisis cinético de la intensidad de fluorescencia emitida por un fluorocromo membrana de unión a ácidos nucleicos impermeant reflejan el grado de membrana heridos y el cierre a nivel de la población de células, lo que permite el cálculo de la celda resellado eficiencia . Imágenes de microscopía de fluorescencia permite la enumeración de las células, que constitutivamente expresan una quimera fluorescente de la nuclear de la proteína histona 2B, en cada pocillo de la microplaca para tener en cuenta posibles variaciones en su número y permite la eventual identificación de poblaciones celulares distintas. Este ensayo de alto rendimiento es una poderosa herramienta pretende ampliar nuestra comprensión de los mecanismos de reparación de la membrana mediante proyección de genes host o exógeno agregado compuestos eso membrana del plasma de control resellado.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Células de mamífero están sujetos a estrés mecánico, osmótico y bioquímico, resultando en la pérdida de la integridad de la membrana plasmática. Sin cierre rápido y eficiente, las células dañadas sucumbirían rápidamente a la muerte programada o necrótica. Desde la década de 1960, esfuerzos por entender la membrana plasmática resellado proceso han sido motivados por las devastadoras consecuencias asociadas con sus disfunciones. De hecho, enfermedades como miembro-rodea Distrofia Muscular, diabetes, síndrome de Chediak-Higashi se han ligado a membrana del plasma deficiente reparación debido a mutaciones en el gene codificación dysferlin, producción de productos finales de glicación avanzada o defectos en el regulador de tráfico lisosomal gen CHS1, respectivamente1,2,3,4,5,6. Sin embargo, hasta la fecha, nuestra comprensión de la membrana de cierre es todavía limitado7. Estudios iniciales han demostrado que la membrana resellado se inicia por la afluencia de extracelular Ca2 + a través de la membrana plasmática dañada8,9,10. Desde entonces, varios no-excluyentes Ca2 +-dependiente de mecanismos han sido propuestos para sellar las células. La hipótesis de parche propone que cerca de la herida, vesículas intracelulares se fusionan unos con otros y la membrana de plasma dañada para actuar como un parche11,12,13,14. Un segundo modelo propone que exocitosis dependiente de calcio de lisosomas en la herida sitio lanza la esfingomielinasa ácida lysosomal de la enzima, que convierte la esfingomielina a ceramida en el prospecto externo de la membrana plasmática. Este repentino cambio en la composición de lípido produce endocitosis ceramida-conducido de la región dañada15,16,17. Por último, el tercer mecanismo propuesto consiste en un papel para la endosomal clasificación compleja necesaria para que el transporte (TRASVESTIS) para promover la formación de vesículas de exteriores que brote fuera de la membrana plasmática18. Sólo un conjunto limitado de proteínas fue identificado en estos modelos, y su maquinaria debe ser aclarado aún más.

Aquí describimos un análisis de alto rendimiento que medidas de la membrana plasmática resellado eficacia en células de mamífero adherentes sujeto a daño mediadas por recombinante listeriolysin O (LLO)19. LLO es una toxina formadora de poros (PFT) secretada por el patógeno intracelular facultativo Listeria monocytogenes20,21,22 y pertenece a MACPF/CDC (complejo de ataque a membrana, perforin, y Superfamilia cytolysin dependiente de colesterol). MACPF son mamífero poro-formando las proteínas implicadas en las defensas inmunitarias, que son las toxinas bacterianas principalmente producción por patógenos gram-positivos que dañan las células del huésped para promover sus estilos de vida patógenos23. CDC se sintetiza como monómeros solubles en agua o dímeros que se unen al colesterol presentan en la membrana plasmática y oligomerize en un prepore complejo de subunidades hasta 50. El complejo del prepore luego reorganiza para insertar β-filamentos a través de la bicapa lipídica, formando un poro barril β que se extiende por 30-50 nm de diámetro24,25,26,27.  Estos poros grandes permiten flujos de iones y componentes celulares pequeños dentro y fuera de la célula; sin embargo, algunos estudios han propuesto que los poros de tamaños más pequeños son también formado28,29,30. Entre la CDC, LLO muestra características únicas incluyendo la agregación irreversible de dependiente de pH y temperatura, que es propicia para el análisis de alto rendimiento31,32. LLO se puede Agregar al medio de cultivo de células a 4 ° c, una temperatura permisiva para su unión a las células, pero no a la formación de lo complejos del poro. Inicio de formación de poro se puede sincronizar luego por aumento de la temperatura a 37 ° c, permitiendo para la eficiente difusión de las moléculas de toxina en el plano de la membrana a oligómeros de forma y para la remodelación conformacionales implicados en la generación de poro. Por lo tanto, después el interruptor de temperatura, la cinética de daño celular depende de la cantidad de toxina a la membrana plasmática. Lo importante, LLO soluble (no limitado a la membrana plasmática) rápidamente e irreversiblemente agregados cuando la temperatura alcance 37 ° c, que alivia la necesidad de eliminar las moléculas de la toxina no unida y limita la extensión del daño de la membrana con el tiempo. Por último, porque LLO se une al colesterol y forma poros en las membranas ricas en colesterol, este ensayo es sensible a una amplia gama de células de mamíferos. Es importante tener en cuenta que LLO afecta a la célula huésped señalización principalmente a través de formación de poro, con algunas excepciones en que celda independiente del poro de señalización puede ocurrir33,34,35,36 ,37,38,39. Por lo tanto, no puede ser excluido que LLO señalización actividades pueden influir en el proceso de reparación de la membrana.

Este análisis evalúan directamente el grado de herir la célula mediante la medición de la incorporación de una célula impermeant fluorocromo (p. ej., yoduro de propidio) que entra en las células heridas pasivo y se convierte en altamente fluorescente cuando se asocia a ácidos nucleicos . Por lo tanto, se puede mantener el fluorocromo en el medio de cultivo celular durante todo el experimento, permitiendo análisis en tiempo real de células herir. La intensidad de la fluorescencia del tinte de unión a ácidos nucleicos aumentará con la concentración de la toxina y, para una determinada concentración de toxina, se incrementará con el tiempo hasta que se forman todos los poros y las células se reparan completamente o hasta que se alcanza la saturación. La afluencia de extracelular Ca2 + a través de los poros de la membrana es un evento de la condición sine qua non para volver a sellar. Por lo tanto, la eficacia de la mismo-resellado puede ser evidenciada indirectamente comparando células heridas en medio de cultivo con Ca2 + (condición permisiva de reparación) para herir en un Ca2 +-medio libre (condición restrictiva de reparación). Debido a la intensidad de la fluorescencia del tinte de unión a ácidos nucleicos es directamente proporcional a la concentración de células en cada pozo, es importante para las células de la semilla en la misma concentración en todos los pocillos. También es importante enumerar las células en cada pozo antes y después del ensayo para asegurar que la separación de la célula no ocurre, como flotando, agregadas células pueden ocultar lecturas de fluorescencia que pueden complicar la interpretación de los datos. Para enumerar las células, las células que expresan las histonas nucleares localizados 2B-GFP (GFP-H2B) fueron utilizadas en este ensayo. Control de temperatura, varios modos de funcionamiento, los lectores de microplacas combinan medidas rápidas, alto rendimiento (utilizando un formato de 96 o 384 pocillos de la placa) de las intensidades de fluorescencia con imagen de microscopía de células vivas a 37 ° C. Este último puede utilizarse para enumerar el número de células y observar la posible formación de poblaciones celulares distintas.

En definitiva, este ensayo proporciona a los usuarios la capacidad de ampliar su conocimiento de la complejidad de los mecanismos de reparación de la membrana mediante la detección de las moléculas del anfitrión o exógeno agregados compuestos que pueden controlar la membrana de reparación. El siguiente protocolo se describen los pasos experimentales para medir la eficiencia mismo-resellado de las células expuestas a LLO y evaluar los efectos de un determinado medicamento o tratamiento celular en eficiencia mismo-resellado.

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Protocolo

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1. preparación

  1. Galjanoplastia de la célula
    Nota: Humanas células epiteliales cervicales, HeLa y HeLa expresando histona 2B-GFP (GFP-H2B), fueron utilizadas en el presente Protocolo, pero este análisis pueden ser adaptado a otras células de mamífero19.
    1. Separar las células adherentes de un frasco de cultivo celular 75 cm2 , lavar las células con 2 mL de tripsina-EDTA 0.25%. Reemplazar la tripsina usada con 2 mL de tripsina-EDTA fresco 0.25%.
    2. Incube las células a 37 ° c durante 5 minutos hasta que las células redondeadas y separadas del frasco.
    3. Resuspender las células en 8 mL de medio de cultivo (DMEM con 10% suero bovino fetal inactivado con calor, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 de μg/mL).
    4. Determinar la concentración de células usando un hemocitómetro y 10 μl de suspensión celular.
    5. Diluir las células en el medio de crecimiento a una concentración de 2,5 x 105 células/mL.
    6. Vierta la suspensión en una cuenca de pipeta estéril y mezclar bien la suspensión con una pipeta serológica de 10 mL.
    7. Usando una micropipeta multicanal de 12 y 200 μL puntas, distribuir las células HeLa (2.5 x 104 células/100 μL/pocillo) en triplicado (o cuadruplicado) en una placa de cultivo de tejidos tratados poliestireno de fondo plano de 96 pozos, claro, negro.
      Nota: Un arreglo de placas se presenta como un ejemplo en la figura 1.
    8. Cultura de las células durante 24 h en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 ° c y 5% CO2.
  2. Preparación de solución madre
    1. Preparar 1 L de un stock de 10 x de buffer M (usado para preparar M1 y M2) mediante la adición de 95 g de solución de sal equilibrada Hanks, 0,476 g de MgCl2 (5 mM) y g 23,83 de HEPES (100 mM) en 900 mL de agua. Ajustar el pH a 7,4 y subir el volumen a 1 L. filtro esterilizar.
    2. Preparar 50 mL de un 50 x stock (1,25 M) de la glucosa mediante la adición de 11,26 g de D-(+)-glucosa a un total de 50 mL de agua. Filtro de esterilizar la solución.
    3. Preparar 50 mL de 100 x stock (120 mM) de calcio mediante la adición de 0,666 g de CaCl2 para un total de 50 mL de agua. Filtro de esterilizar la solución.
    4. Preparar 50 mL de una 10 x stock (50 mM) de glicol de etileno-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N', ácido etilendiaminotetraacético (EGTA) mediante la adición de 0,951 g de EGTA en 40 mL de agua. Aumentar el pH a 8 con NaOH disolver el EGTA, y luego subir el volumen a 50 mL. Filtro de esterilizar la solución.
    5. Para una sola placa de 96 pocillos, preparar 50 mL de medio 1 (M1, contiene Ca2 +), 50 mL de medio 2 (M2, Ca2 +-libre) y 15 mL de medio 2 complementado con EGTA, por consiguiente:
      1. Para M1, añadir 5 mL de 10 x Buffer M, 0,5 mL de 100 x CaCl2y 1 mL de glucosa x 50 a 43,5 mL de agua.
      2. Para M2, añadir 5 mL de 10 m de Buffer y 1 mL de glucosa x 50 a 44 mL de agua.
      3. Para M2/EGTA, añadir 1,5 mL de 10 x Buffer M y 1,5 mL de 10 x EGTA a 12 mL de agua.
        Nota: Todas las soluciones que contienen yoduro de propidio (PI) deben estar preparadas directamente antes de agregar a las células.
  3. Placa lector e imágenes citómetro ajustes
    Nota: Utilice un lector de placas de varios modos de funcionamiento equipado con dos unidades de detección: un spectrofluorometer y un citómetro de proyección de imagen. Limitar la exposición de fluorescencia para evitar fotoblanqueo los fluoróforos.
    1. Caliente previamente el lector de la placa a 37 ° C antes de realizar el ensayo.
    2. Establecer los parámetros para el análisis cinético en consecuencia del modo de configuración :
      1. Elige monocromador, FL (fluorescencia)y cinética para la configuración óptica, modos de leer y leer tipo, respectivamente.
      2. En la Configuración de longitud de onda, seleccione un 9 y 15 nm de excitación y emisión bandpass, respectivamente. Para los ensayos utilizando yoduro de propidio (PI), establecen las longitudes de onda de excitación y emisión a 535 nm 617, respectivamente.
      3. En Tipo de la placa, seleccione 96 pocillos para el formato de placa y una configuración de la placa correspondiente a una placa de pared negro inferior transparente.
      4. Área de lectura, destacar los pozos que serán analizados a lo largo de la cinética.
      5. PMT y óptica, preselección los destellos por leer a 6 y marque la casilla para leer desde la parte inferior.
      6. Bajo tiempo, introduzca 00:30:00 en el cuadro de Tiempo Total de ejecución de un ensayo cinético de 30 min e inserte 00:05:00 para el intervalo.
        Nota: Cada vez el punto y una longitud de onda, el tiempo de lectura de una placa completa de 96 pocillos es 30 s.
      7. Confirmar la configuración especificada en la Información de configuración a la derecha y seleccione Aceptar. Prensa leer para iniciar el kinetic ejecutar.
    3. Configurar los parámetros de proyección de imagen en consecuencia del modo de configuración:
      1. Elegir Minimax, la proyección de imageny punto final para la configuración óptica, modos de leer y leer tipo, respectivamente.
      2. En longitudes de onda, seleccione transmite luzy uno o ambos los cuadros de fluorescencia correspondiente a longitudes de onda de excitación y emisión de 456/541 nm (GFP) y 625/713 nm (PI).
      3. Usar las mismas opciones para el Tipo de placa y Área de lectura tal como se define en los pasos 1.3.2.3 y 1.3.2.4.
      4. Bien el área Configuración, seleccione el número de sitios dentro de un pozo a ser reflejada.
        Nota: 12 sitios corresponden a una imagen de todo bien.
      5. En la Configuración de la adquisición de imágenes, seleccionar los tiempos de exposición para transmitir luz, 541 (GFP) y 713 (PI). Para GFP, la imagen todo bien con un tiempo de exposición de 20 ms/imagen. Para transmitir luz (TL) y fluorescencia de PI, adquirir una imagen única del centro de cada pocillo con tiempos de exposición de 8 y 20 ms, respectivamente.
      6. Confirmar la configuración especificada en la información de configuración a la derecha y seleccione Aceptar. El tiempo de la adquisición de imágenes de toda la superficie de cada pozo (12 imágenes/pocillo) de una placa de 96 pocillos y para una longitud de onda es de ~ 15 minutos pulse leer para iniciar la proyección de imagen.
        Nota: El tiempo de la adquisición de un único imagen/pozo de una placa de 96 pocillos requiere ~2.5 min/placa para una longitud de onda. Los parámetros descritos anteriormente corresponden a los equipos específicos en nuestro laboratorio. Spectrofluorometric medidas: una lámpara de flash de xenón mostrando 1.0 nm incremento excitación longitudes de onda (250-850 nm) con un ajustable 9 o 15 nm paso de banda, un detector de tubo fotomultiplicador con > 6 log rango dinámico y una emisión de nm ajustable de 15 o 25 paso de banda. Citometría de imagen: una fuente de luz de iluminación de luz blanca, 460 nm y longitudes de onda de excitación nm 625 con una banda de nm 20, filtros de emisión centrados en 541 nm (108 nm de paso de banda) y 713 nm (123 nm de paso de banda), respectivamente, y un objetivo de X 4, junto a un 1.25 megapíxeles dispositivo acoplado de carga 12 bits.

2. ensayo

Nota: En el momento del ensayo, las células deben ser confluente de 70-90%. Durante los pasos de lavado, el medio debe retirarse y aplicado a la pared lateral del pozo (no directamente sobre las células). Mantener la temperatura de LLO a < 4 ° c para evitar su agregación hasta el paso 3.1.5.

  1. Preparar un stock de 30 μm PI en M1 y un stock de 30 μm PI m2 pre-calentado a 37 ° c.
  2. Lave suavemente las células en la placa 1 utilizando una micropipeta multicanal de 12 y 200 μL consejos, como sigue:
    1. Para las condiciones permisivas de reparación, eliminar el medio de cultivo y lavado que las células dos veces con 200 μL/pocillo M1 calentadas previamente a 37 ° c. Reemplazar el medio con 100 μL/pocillo de M1 caliente que contiene 30 μm PI.
    2. Para reparar condiciones restrictivas, eliminar el medio de crecimiento y lave las células una vez con 200 μL/pocillo caliente M2 que contiene 5 mM EGTA al quelato Ca2 +, seguido de un lavado con 200 μL/pocillo M2. Reemplazar el medio con 100 μL/pocillo caliente M2 que contiene 30 μm PI.
    3. Después de que el medio de crecimiento ha sido lavado y reemplazado con medio que contiene yoduro de propidio, directamente hacia paso 2.1.3.
  3. Placa de la imagen 1 bajo luz transmitida, GFP y PI como se detalla bajo 1.3.3 (pre-cinético). Este paso tarda 15-20 minutos.
  4. Durante el período de 15 min en el paso 2.1.3, preparar la placa 2 utilizando una micropipeta multicanal de 12 y 200 μL puntas como sigue:
    1. Coloque una microplaca de polipropileno fondo redondo de 96 pozos en el hielo. Configurar la placa utilizando un diseño experimental correspondiente a la placa 1 (figura 1).
    2. Para las condiciones de reparación permisiva, añadir 100 μL/pocillo de M1 helada que contiene 60 μm PI, seguido por la adición de 100 μL/pocillo de M1 helada que contiene 4 x LLO o no para el control.
    3. Para las condiciones restrictivas del reparación, añadir 100 μL/pocillo de helada M2 que contiene 60 μm PI, seguido por la adición de 100 μL/pocillo de helada M2 que contiene 4 x LLO o no para el control.
  5. Después de la proyección de imagen placa 1 (paso 2.1.3), inmediatamente Coloque en hielo, con papel de aluminio para separar la placa de contacto directo con hielo. Permiten que la placa 1 se enfríe durante 5 minutos.
  6. Usando una micropipeta multicanal de 12 y 200 μL puntas, transfiera 100 μl de cada pocillo en la placa 2 (paso 2.1.4) a los pocillos correspondientes de la placa 1. Para distribuir correctamente la toxina en los medios de comunicación de la placa 1, inserte las puntas por debajo del menisco y expulse suavemente el volumen sin la introducción de burbujas.
    Nota: No tomar con pipeta hacia arriba y hacia abajo, esto sin darse cuenta puede separar las células.
  7. Dejar la placa durante un 1 minuto adicional permitir que la toxina se unen a las células y transferir inmediatamente la placa 1 para el lector de placas para el ensayo cinético mediante el modo de spectrofluorometer (paso 1.3.2).
  8. Al final del ensayo cinético, inmediatamente imagen placa 1 (post-cinético) usando paso 1.3.3.

3. Análisis: Enumeración de células

  1. Determinar el número de celular basado en la fluorescencia nuclear utilizando el software de enumeración celular de microplacas.
    1. Dentro de ajustes, seleccione nuevo análisisy en la sección de categoría dentro de la Configuración de análisis de imagen seleccione Análisis de objeto discreto con 541 como la longitud de onda para encontrar objetos.
    2. Dentro de la opción de encontrar objetos, utilizando el dibujar en las imágenes buscando método, seleccionar núcleos bajo la pestaña de configuración y pulse aplicar.
    3. Pulse OK y leer para iniciar la célula contando algoritmo.
  2. Como alternativa, si no tal herramienta está disponible, utilizar un software de análisis de imagen como el ImageJ para enumerar las células.
    1. En ImageJ, abra el archivo de imagen como una pila.
    2. Convertir la pila para imágenes de escala de grises de 8 bits haciendo clic en la imagen en la barra de menú, se ciernen sobre el tipo y seleccione 8-bit.
    3. Restar el fondo: haga clic en imagen en la barra de menú, pase sobre ajustey seleccione Brillo y contraste. Ajustar el valor mínimo para eliminar el ruido de fondo y seleccione aplicar.
    4. Umbral para crear imágenes binarias: haga clic en imagen en la barra de menú, pase sobre ajustey seleccione umbral. Seleccione fondo oscuro, ajuste los valores de umbral mínimo y máximo y haga clic en aplicar.
    5. En el caso de superposición de núcleos, puede utilizarse una herramienta de Cuenca para núcleos de segmento. Haga clic en proceso en el menú, se ciernen sobre binario y seleccione cuenca.
      Nota: Esto separará automáticamente núcleos conectados.
    6. Analizar las imágenes enmascaradas mediante la aplicación de criterios especificados por el usuario (tamaño y circularidad) para refinar la identificación de núcleos y excluyen restos celulares.
      1. Haga clic en analizar en el menú y luego analizar las partículas. Establecer el tamaño deseado (pixel ^ 2) y circularidad (un valor de 1 es un círculo perfecto) que son suficientes para incluir células/núcleos individuales.
      2. En el cuadro de lista desplegable Mostrar, seleccione la opción u opciones que desea, compruebe resumay haga clic en Aceptar para obtener un recuento.

4. Análisis: Curvas cinéticas

  1. Transferencia de los datos cinéticos desde el software de lector de placa a un software de datos analíticos.
  2. Para cada condición experimental, un promedio de las intensidades de fluorescencia de las repeticiones en cada punto, junto con la correspondiente desviación estándar y error estándar de la media para cada condición experimental.
  3. Para cada condición experimental, trazar la correspondiente curva de cinética: intensidad de PI (eje y) frente al tiempo (eje x).
  4. Para calcular la eficiencia mismo-resellado de una condición de tratamiento dado, calcular el área bajo la curva (AUC) de los + LLO en M1 (AUC(M1)) y + LLO en M2 (AUC(M2)). Utilizar el enfoque propuesto a continuación evaluar la eficiencia (E) de cierre:
    figure-protocol-1
  5. Realizar una comparación entre el tratamiento control y prueba mediante la determinación del ratio de eficiencia (REff) indicados a continuación:
    figure-protocol-2
    REFF = 1, prueba de tratamiento no tiene ningún efecto en la reparación de
    REFF < 1, prueba tratamiento inhibe la reparación
    REFF > 1, prueba de tratamiento mejora la reparación
  6. Calcular el área bajo la curva mediante la siguiente ecuación:
    figure-protocol-3, donde k es el número total de visitas de seguimiento.

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Resultados

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Precisión de conteo celular: células HeLa se utilizan con frecuencia como una línea de células de mamífero modelo para explorar los mecanismos de reparación de la membrana. Al evaluar la reparación de la membrana a nivel de población de la célula, es importante a las células de la placa en la misma concentración en todos los pocillos para interpretación de datos adecuado. También es importante verificar en el momento de la prueba de que el número de células es equivalente a través de pozo...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este ensayo mide la eficiencia de cierre de membrana a nivel de población celular con capacidad de alto rendimiento. Puede ser utilizado para detectar componentes celulares o las bibliotecas de drogas que pueden afectar la reparación de la membrana. El ensayo descrito utiliza un formato de placa de 96 pocillos, pero puede ser adaptado para placas de 384 pocillos para un mayor rendimiento. Una ventaja de este ensayo es su capacidad para obtener medidas de fluorescencia de las células vivas adherente en tiempo real sin nec...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reconocemos el Dr. Jesse Kwiek (The Ohio State University) para que amablemente nos permite utilizar su plataforma de detección de varios modos de funcionamiento para algunos experimentos preliminares. En este artículo de investigación fue apoyado por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas de los institutos nacionales de salud con el número de concesión RO1AI107250 a Stephanie Seveau. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
SpectraMax i3x Lector de microplacas multimodoMolecular Devicesi3x
MiniMax 300 Citómetro de imagenMolecular Devices5024062
TO-PRO-3ThermoFisher ScientificT3605
Yoduro de propidioThermoFisher ScientificP3566
HeLaATCCCCL2
HeLa H2B-GFPMilliporeSCC117
Tripsina-EDTA 0.25%ThermoFisher Scientific 25200056
Corning de 96 pocillos placa tratada para cultivo de tejidos de poliestireno negro de fondo planoCorning3603
Sales equilibradas de HanksSigma-AldrichH4891
EGTAISC BioExpress0732-100G
HEPESFisher ScientificBP310-500
D-(+)-Glucosa, HybriMaxSigma-AldrichG5146-1KG

Referencias

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