Medida de alto rendimiento de membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos

Resumen

Aquí describimos un análisis basado en la fluorescencia de alto rendimiento que mide la membrana plasmática resellado eficiencia mediante análisis fluorométrico y proyección de imagen en células vivas. Este ensayo puede utilizarse para la detección de drogas o genes diana que regulan el cierre de membrana plasmática en células de mamíferos.

Resumen

En su entorno fisiológico, células de mamíferos a menudo son sometidas a tensiones mecánicas y bioquímicas que resultan en daño de la membrana plasmática. En respuesta a estos daños, maquinarias moleculares complejas rápidamente volver a cerrar herméticamente la membrana plasmática para recuperar su función de barrera y mantener la supervivencia celular. A pesar de 60 años de investigación en este campo, todavía no tenemos un conocimiento profundo de la célula resellado maquinaria. Con el objetivo de identificar los componentes celulares cierre de membrana del plasma de control o fármacos que pueden mejorar el servicio, hemos desarrollado un ensayo de alto rendimiento basado en la fluorescencia que mide la membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos cultivadas en microplacas. Como sistema modelo para el daño de la membrana plasmática, las células se exponen a la bacterianas formadoras de poro toxina listeriolysin O (LLO), que forma grandes 30-50 nm de diámetro proteínico poros en colesterol membranas. El uso de un lector de microplacas de varios modos de funcionamiento con control de temperatura permite mediciones spectrofluorometric rápido y sensible en combinación con brightfield y de imágenes de microscopía de fluorescencia de las células vivas. Análisis cinético de la intensidad de fluorescencia emitida por un fluorocromo membrana de unión a ácidos nucleicos impermeant reflejan el grado de membrana heridos y el cierre a nivel de la población de células, lo que permite el cálculo de la celda resellado eficiencia . Imágenes de microscopía de fluorescencia permite la enumeración de las células, que constitutivamente expresan una quimera fluorescente de la nuclear de la proteína histona 2B, en cada pocillo de la microplaca para tener en cuenta posibles variaciones en su número y permite la eventual identificación de poblaciones celulares distintas. Este ensayo de alto rendimiento es una poderosa herramienta pretende ampliar nuestra comprensión de los mecanismos de reparación de la membrana mediante proyección de genes host o exógeno agregado compuestos eso membrana del plasma de control resellado.

Introducción

Células de mamífero están sujetos a estrés mecánico, osmótico y bioquímico, resultando en la pérdida de la integridad de la membrana plasmática. Sin cierre rápido y eficiente, las células dañadas sucumbirían rápidamente a la muerte programada o necrótica. Desde la década de 1960, esfuerzos por entender la membrana plasmática resellado proceso han sido motivados por las devastadoras consecuencias asociadas con sus disfunciones. De hecho, enfermedades como miembro-rodea Distrofia Muscular, diabetes, síndrome de Chediak-Higashi se han ligado a membrana del plasma deficiente reparación debido a mutaciones en el gene codificación dysferlin, producción de productos finales ....

Protocolo

1. preparación

1. Galjanoplastia de la célula
   Nota: Humanas células epiteliales cervicales, HeLa y HeLa expresando histona 2B-GFP (GFP-H2B), fueron utilizadas en el presente Protocolo, pero este análisis pueden ser adaptado a otras células de mamífero¹⁹.
   1. Separar las células adherentes de un frasco de cultivo celular 75 cm² , lavar las células con 2 mL de tripsina-EDTA 0.25%. Reemplazar la tripsina usada con 2 mL de tripsina-EDTA fresco 0.25%.
   2. Incube las células a 37 ° c durante 5 minutos hasta que las células redondeadas y separadas del frasco.
   3. Resuspender las células en 8 mL de medio de cultiv....

Resultados

Precisión de conteo celular: células HeLa se utilizan con frecuencia como una línea de células de mamífero modelo para explorar los mecanismos de reparación de la membrana. Al evaluar la reparación de la membrana a nivel de población de la célula, es importante a las células de la placa en la misma concentración en todos los pocillos para interpretación de datos adecuado. También es importante verificar en el momento de la prueba de que el número de células es equivalente a través de pozo.......

Discusión

Este ensayo mide la eficiencia de cierre de membrana a nivel de población celular con capacidad de alto rendimiento. Puede ser utilizado para detectar componentes celulares o las bibliotecas de drogas que pueden afectar la reparación de la membrana. El ensayo descrito utiliza un formato de placa de 96 pocillos, pero puede ser adaptado para placas de 384 pocillos para un mayor rendimiento. Una ventaja de este ensayo es su capacidad para obtener medidas de fluorescencia de las células vivas adherente en tiempo real sin nec.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
SpectraMax i3x Lector de microplacas multimodo	Molecular Devices	i3x
MiniMax 300 Citómetro de imagen	Molecular Devices	5024062
TO-PRO-3	ThermoFisher Scientific	T3605
Yoduro de propidio	ThermoFisher Scientific	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
Tripsina-EDTA 0.25%	ThermoFisher Scientific 25200056
Corning de 96 pocillos placa tratada para cultivo de tejidos de poliestireno negro de fondo plano	Corning	3603
Sales equilibradas de Hanks	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-Glucosa, HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG