En este estudio, presentamos un protocolo para realizar dos fotones intravital proyección de imagen y de la célula análisis de interacción en la mucosa traqueal murina después de la infección con virus de la gripe. Este Protocolo será relevante para los investigadores que estudian la dinámica celular inmune durante las infecciones respiratorias.
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Artículo de método
Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El análisis de célula o célula-patógeno interacción en vivo es una herramienta importante para entender la dinámica de la respuesta inmune a la infección. Dos fotones microscopía intravital (2P-IVM) permite la observación de las interacciones de la célula en tejidos profundos en animales vivos, reduciendo al mínimo el fotoblanqueo generado durante la adquisición de la imagen. Hasta la fecha, se han descrito distintos modelos de 2P-IVM de órganos linfoides y no linfoides. Sin embargo, la proyección de imagen de órganos respiratorios sigue siendo un reto debido al movimiento asociado con el ciclo de la respiración del animal.
Aquí, describimos un protocolo para visualizar en vivo la célula inmune interacciones en la tráquea de ratones infectados con el virus de la influenza usando 2P-IVM. Para ello, hemos desarrollado una plataforma de proyección de imagen personalizada, que incluía la exposición quirúrgica y la intubación de la tráquea, seguida por la adquisición de imágenes dinámicas de neutrófilos y células dendríticas (DC) en el epitelio de la mucosa. Además, detallan los pasos necesitados para llevar a cabo la gripe intranasal infección y flujo análisis cytometric de células inmunes en la tráquea. Finalmente, se analizaron del neutrófilo y motilidad de DC así como sus interacciones en el transcurso de una película. Este protocolo permite la generación de imágenes de 4D estable y brillante es necesario para la evaluación de las interacciones célula-célula en la tráquea.
Introducción
Dos fotones microscopía intravital (2P-IVM) es una técnica eficaz para proyección de imagen en tiempo real de las interacciones célula a célula que se producen en su entorno natural1. Una de las principales ventajas de este método es que permite el estudio de procesos celulares en una mayor profundidad de la muestra (500 μm a 1 mm) en comparación con otras técnicas por imágenes tradicionales2. Al mismo tiempo, el uso de dos fotones de baja energía generada por el láser de dos fotones reduce el foto-daño de tejido por lo general asociado con el proceso de adquisición de imagen2. Durante la última d....
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Protocolo
Todos los procedimientos animales ratones que realizaron los animales protocolos y directrices de la Oficina veterinaria Federal de Suiza fueron aprobados por las autoridades veterinarias locales.
1. gripe infección de ratones de CD11c-YFP
- Seguridad de la biotecnología
Nota: La cepa de ratón adaptado de gripe H1N1 de A/Puerto Rico/8/34 (PR8) fue cultivada en huevos fertilizados, purificada y valora como se describió anteriormente21. Todos los pasos que implican animales infectados o muestras biológicas se llevó a cabo bajo una bioseguridad gabinete según nivel de bioseguridad (BSL) 2 con....
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Resultados
En este trabajo describen un protocolo detallado para el estudio en vivo la motilidad y las interacciones entre neutrófilos y DC durante la infección por influenza en tráquea murino (Figura 3A). Para ello, se aislaron neutrófilos PPC+ (92% pureza; Figura 3B) de ECFP CK6 ratones y eventualmente trasladaron en un ratón de CD11c-YFP infectado con influenza. Después de eso, realizamos 2P-IVM de la tráquea en día 3.......
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Discusión
Este trabajo presenta un protocolo detallado para la generación de imágenes de 4D que muestra la migración de neutrófilos eventualmente transferidos y sus interacciones con DC durante una infección de gripe en la tráquea de ratón. El modelo descrito P 2-IVM será relevante para el estudio de dinámica celular inmune durante una infección en las vías respiratorias.
Recientemente, varios modelos basados en la visualización de la dinámica de la célula en las vías respiratorias han sido desarrollado.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las donaciones de la Fundación Nacional Suiza (SNF) (176124 145038 y 148183), europeo Marie Curie reintegración subvención de la Comisión (612742) y SystemsX.ch para una beca a D.U.P. (2013/124).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Gigasept instru AF | Schü LKE & Ratones | solución al 4% | |
| Laboratorios Jackson | 008829 | ratones fueron criados internamente | |
| CK6-ECFP | Laboratories | 004218 | ratones fueron criados internamente |
| 1x Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco modificada sin chorro de calcio y cloruro de magnesio | Sigma | D8537-500ML | |
| 10x Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco modificada sin Cloruro de Calcio y Cloruro de Magnesio | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L Almacenar | a 4° C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma 7680632310024 | Tienda en RT, tienda en 4 & deg; C cuando está en solución de mezcla ket/xilo | |
| Rompun 2% (xilacina) | Bayer | 6293841.00.00 | Tienda en RT, tienda a 4 & grados; C cuando está en solución de mezcla ket/xilo |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak 305501 | ||
| 30 G, 0,3 mL BD Jeringas de insulina microfinas | BD 324826 | ||
| Falcon 40 µ m Filtro de células | Corning | 352340 | |
| Jeringas de 2 mL | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3x 18 agujas de 18 G | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20 G (catéter) | Braun | 4251652.01 | |
| Clúster de cultivo celular de 6 pocillos | Costar | 3516 | |
| RPMI medio 1640 + HEPES (1x) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Tienda en 4° C |
| Liberase TL Grado de Investigación | Roche | 5401020001 | Tienda a -20 ° C / Mezcla de colagenasa (I y II) |
| ADNasa I Amresco | (VWR) | 0649-50KU | Almacenar a -20 ° C |
| CellTrace Tinción violeta | ThermoFisher Scientific | C34557 | Almacenar a -20 ° C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Suero Fetal Bovino | Gibco | 10270-106 | Tienda en -20 ° C |
| PE-10 Micro Tubo Médico | 2Instrumentos Biológicos SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Cinta Plástica Quirúrgica | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Tienda Lomb | en RT | |
| Plastilina | Ohropax | ||
| Cubreobjetos de vidrio de alta tolerancia 15 mm Redondo | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Sistema de anestesia animal portátil | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (banco de anestesia gaseosa y calefacción) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | Universidad de Berna | ||
| TrimScope II Microscopio de dos fotones | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Láseres Ti:Sa | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 objetivo de inmersión en agua | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube& La caja Cámara de incubación y controlador de temperatura | Life Imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Software de imagen | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Software estadístico |
Referencias
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Fein, M. R., Egeblad, M.....
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