Aquí, presentamos un protocolo para la síntesis y caracterización de nanopartículas de óxido de cerio (nanoceria) de ROS (especies reactivas del oxígeno) barrido en vivo, nanoceria proyección de imagen en los tejidos vegetales por microscopía confocal e in vivo seguimiento de nanoceria ROS barrido por microscopia confocal.
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Artículo de método
Depuración catalítica de planta oxígeno reactivo especie In Vivo de nanopartículas de óxido de cerio aniónicos
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Acumulación de oxígeno reactivo (ROS) las especies es un rasgo distintivo de la respuesta de estrés abiótico las plantas. ROS desempeñan un papel dual en las plantas actuando como señales de moléculas en niveles bajos y dañar moléculas en niveles altos. Acumulación de ROS en plantas puede dañar metabolitos, enzimas, lípidos y ADN, provocando una reducción del crecimiento de las plantas y el rendimiento. La capacidad de compactar catalítico ROS en vivo de nanopartículas de óxido de cerio (nanoceria) proporciona una herramienta única para entender y tolerancia al estrés abiótico planta bioingeniero. Aquí, presentamos un protocolo para sintetizar y caracterizar poly (acrílico) ácido nanoceria revestido (PNC), interfaz de las nanopartículas con plantas vía infiltración de lámina de la hoja y controlar su distribución y ROS rebuscar en vivo usando confocal microscopia. Actuales herramientas moleculares para manipular la acumulación de ROS en las plantas se limitan a especies modelo y requieren métodos de transformación laboriosa. Este protocolo en vivo barrido ROS tiene el potencial para aplicarse a las plantas de tipo silvestre con hojas anchas y estructura de las hojas como Arabidopsis thaliana.
Introducción
Nanopartículas de óxido de cerio (nanoceria) son ampliamente utilizadas en los organismos vivos, desde la investigación básica a la bioingeniería, debido a sus especies distintas catalítico reactivas del oxígeno (ROS) barrido capacidad1,2,3. Nanoceria tienen ROS barrido capacidades debido a un gran número de vacantes de oxígeno superficial que se alternan entre dos oxidación Estados (Ce3 + y Ce4 +) 4,5,6. Los Ce3 + colgando los bonos efectivamente bar....
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Protocolo
1. cultivo de plantas de a. thaliana
- Siembre las semillas de a. thaliana en ollas desechables de 5 cm x 5 cm llenados con mezcla de suelo estándar. Puesto 32 de estas macetas en una bandeja de plástico llenada de agua (~ 0,5 cm de profundidad) y la transferencia de la bandeja de plástico con las plantas en una cámara de crecimiento de la planta.
- Configurar el crecimiento cámara como sigue: 200 μmol/ms radiación fotosintéticamente activa (PAR) 24 ± 1 ° C día y 21 ± 1 ° C noche, 60% de humedad y régimen de luz de día/noche de 14/10 h, respectivamente.
- Fina de cada maceta para dejar solamente una planta individua....
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Resultados
Caracterización y síntesis de la PNC .
PNC fueron sintetizados, purificada y caracterizada siguiendo el método descrito en la sección de protocolo 2. Figura 1 A muestra la coloración de las soluciones de nitrato de cerio, PAA, la mezcla de nitrato de cerio y PAA y PNC. Un cambio de color de blanco a amarillo claro es visto después de PNC se sintetiza. Después de la purificación con un filtro de 10.......
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Discusión
En este protocolo, describimos PNC síntesis, caracterización, colorante fluorescente etiquetado y proyección de imagen confocal de las nanopartículas en las células mesophyll vegetales para exhibir su en vivo ROS actividad libre-radical. PNC se sintetizan a partir de una mezcla de solución PAA en hidróxido de amonio y nitrato de cerio. PNC se caracterizan por spectrophotomery de absorción y la concentración determinada mediante ley de la cerveza-Lamberts. Medidas de potencial zeta confirman la superficie negativ.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Universidad de California, Riverside y USDA Instituto Nacional de alimentos y agricultura, proyecto de Portilla 1009710 J.P.G. Este material está basado en trabajo apoyado por la National Science Foundation bajo la subvención no. 1817363 a J.P.G.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cerio (III) nitrato hexahidratado | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Agua de grado de biología molecular, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Tubos de centrífuga cónicos Falcon 50 mL | VWR | 14-959-49A | |
| ) 1.800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Mezclador de vórtice digital | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Mezclador de vórtice digital Accesorio, retenedor de inserto | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Mezclador de vórtice digital Fisherbrand Accesorios: Juego de insertos de espuma | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Solución de hidróxido de amonio | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduado, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT básico | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrífuga 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Unidades de filtro centrífugo | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Centrífuga de sobremesa | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrofotómetro | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 filtro de jeringa | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Jeringas Desechables con Puntas Luer-Lok | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecil-3,3,3′,3′-perclorato de tetrametilindocarbocianina | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimetilsulfóxido, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (valoración | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Cloruro de magnesio | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Jeringa Air-Tite All-Plastic Norm-Ject | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Limpiaparabrisas para tareas delicadas | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Gel de observación | Carolina Carolina | 132700 | |
| Corning Portaobjetos de microscopio, esmerilados por un lado, un extremo | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Barrenador de corcho Juegos con asas | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalina | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cubreobjetos, Cuadrado, Nº 1 | VWR | 48366-045 | |
| Microscopio confocal de barrido láser Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Diacetato de diclorofluorescina | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihidroetidio | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrífuga Tubos: 1,5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Cubetas Eppendorf Uvette | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Medidor de clorofila | Konica Minolta | SPAD-502 |
Referencias
- Xu, C., Qu, X. Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).
- Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine. Antioxidants. 5 (2), 15(2016).
- Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S.
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Reimpresiones y permisos
