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Artículo de método

Depuración catalítica de planta oxígeno reactivo especie In Vivo de nanopartículas de óxido de cerio aniónicos

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DOI:

10.3791/58373

⸱

26 de agosto de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Botany and Plant Sciences, University of California, 2Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la síntesis y caracterización de nanopartículas de óxido de cerio (nanoceria) de ROS (especies reactivas del oxígeno) barrido en vivo, nanoceria proyección de imagen en los tejidos vegetales por microscopía confocal e in vivo seguimiento de nanoceria ROS barrido por microscopia confocal.

Resumen

Acumulación de oxígeno reactivo (ROS) las especies es un rasgo distintivo de la respuesta de estrés abiótico las plantas. ROS desempeñan un papel dual en las plantas actuando como señales de moléculas en niveles bajos y dañar moléculas en niveles altos. Acumulación de ROS en plantas puede dañar metabolitos, enzimas, lípidos y ADN, provocando una reducción del crecimiento de las plantas y el rendimiento. La capacidad de compactar catalítico ROS en vivo de nanopartículas de óxido de cerio (nanoceria) proporciona una herramienta única para entender y tolerancia al estrés abiótico planta bioingeniero. Aquí, presentamos un protocolo para sintetizar y caracterizar poly (acrílico) ácido nanoceria revestido (PNC), interfaz de las nanopartículas con plantas vía infiltración de lámina de la hoja y controlar su distribución y ROS rebuscar en vivo usando confocal microscopia. Actuales herramientas moleculares para manipular la acumulación de ROS en las plantas se limitan a especies modelo y requieren métodos de transformación laboriosa. Este protocolo en vivo barrido ROS tiene el potencial para aplicarse a las plantas de tipo silvestre con hojas anchas y estructura de las hojas como Arabidopsis thaliana.

Introducción

Nanopartículas de óxido de cerio (nanoceria) son ampliamente utilizadas en los organismos vivos, desde la investigación básica a la bioingeniería, debido a sus especies distintas catalítico reactivas del oxígeno (ROS) barrido capacidad1,2,3. Nanoceria tienen ROS barrido capacidades debido a un gran número de vacantes de oxígeno superficial que se alternan entre dos oxidación Estados (Ce3 + y Ce4 +) 4,5,6. Los Ce3 + colgando los bonos efectivamente barrido ROS mientras que las cepas de enrejado en la nanoescala promueven la regeneración de estos sitios de defecto mediante redox reacciones7de ciclismo. Nanoceria también se han utilizado recientemente para estudiar e Ingeniería de la planta función8,9. Plantas bajo estrés abiótico experimentan acumulación de ROS, que causa daño oxidativo a lípidos, proteínas y ADN10. En plantas de a. thaliana , nanoceria depuración catalítica de ROS en vivo conduce a la fotosíntesis de la planta mejorada bajo la alta luz, calor y frío estrés8. Nanoceria aplicando al suelo también aumenta sesión de biomasa y rendimiento de grano de trigo (Triticum aestivum)11; las plantas de canola (Brassica napus) tratadas con nanoceria tienen mayor biomasa de la planta bajo estrés salino12.

Nanoceria ofrecemos bioingenieros y biólogos de la planta una herramienta basada en nanotecnología para entender las respuestas de estrés abiótico y mejorar la tolerancia al estrés abiótico planta. En vivo ROS barridas capacidades de Nanoceria independientes de especies de plantas, y la entrega fácil en los tejidos de la planta tiene el potencial para permitir amplia aplicación fuera de organismos modelo. A diferencia de otros métodos basados en la genética, nanoceria no requieren generar líneas de plantas con la sobreexpresión de enzimas antioxidantes para ROS mayor compactación capacidad13. Infiltración de lámina de la hoja de nanoceria a las plantas es un enfoque práctico para la investigación de laboratorio.

El objetivo general de este protocolo es describir 1) la síntesis y caracterización de poly cargados negativamente (acrílico) ácido nanoceria (PNC), 2) la entrega y seguimiento de la PNC a través de células de la hoja y 3) el monitoreo de depuración PNC permitió ROS en vivo. En este protocolo, poly cargados negativamente (acrílico) ácido nanoceria (PNC) son sintetizados y caracterizados por su espectro de absorción, diámetro hidrodinámico y potencial zeta. Se describe un método de infiltración de lámina de hoja simple para entregar PNC en planta de tejidos de la hoja. En vivo imagen de distribución de nanopartículas en las células del mesófilo, un colorante fluorescente (DiI) fue utilizado para la etiqueta de PNC (DiI-PNC) y observar las nanopartículas mediante microscopía de fluorescencia confocal. Por último, explicamos cómo monitorear en vivo PNC ROS barrido a través de microscopía confocal.

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Protocolo

1. cultivo de plantas de a. thaliana

  1. Siembre las semillas de a. thaliana en ollas desechables de 5 cm x 5 cm llenados con mezcla de suelo estándar. Puesto 32 de estas macetas en una bandeja de plástico llenada de agua (~ 0,5 cm de profundidad) y la transferencia de la bandeja de plástico con las plantas en una cámara de crecimiento de la planta.
    1. Configurar el crecimiento cámara como sigue: 200 μmol/ms radiación fotosintéticamente activa (PAR) 24 ± 1 ° C día y 21 ± 1 ° C noche, 60% de humedad y régimen de luz de día/noche de 14/10 h, respectivamente.
  2. Fina de cada maceta para dejar solamente una planta individual después de una semana de germinación. Tenga en cuenta para mantener las plantas de semillero con tamaño similar en cada maceta.
  3. Agua las macetas por verter agua directamente en la bandeja de plástico una vez cada dos días. Crecer las plantas durante cuatro semanas. Plantas de a. thaliana están listas para su uso posterior.

2. síntesis y caracterización de PNC

  1. Pesa 1,08 g de nitrato de cerio (III) y disolver en 2,5 mL de agua de grado de biología molecular en un tubo cónico de 50 mL.
  2. Pesan 4.5 g de ácido poli (acrílico) y disolver en 5 mL de agua de grado de biología molecular en un tubo cónico de 50 mL.
  3. Mezclar estas dos soluciones de fondo a 2.000 rpm durante 15 minutos usando un mezclador de tipo vórtex digital.
  4. Transferir 15 mL de solución de hidróxido de amonio (7,2 M) a un vaso de precipitados de vidrio de 50 mL.
  5. Agitación a 500 rpm, añadir la mezcla del paso 2.3 gota a gota a la solución de hidróxido de amonio y agitar a 500 rpm a temperatura ambiente durante 24 horas en una campana de humos.
  6. Cubrir el vaso con un trozo de papel para evitar la pérdida sustancial de solución durante la reacción durante la noche.
  7. Después de 24 h, transferir la solución resultante a un tubo cónico de 50 mL y centrifugar a 3.900 x g durante 1 h eliminar cualquier posible escombros y grandes aglomeraciones.
  8. Transferir este 22,5 mL de la solución sobrenadante a tres filtros de 15 mL 10 kDa y llenar el resto del filtro con agua grado molecular para hacer una dilución total de 45 mL.
  9. Purificar la solución sobrenadante de polímeros libres y otros reactivos con una centrífuga de sobremesa añadiendo el sobrenadante a un filtro de 15 mL 10 kDa y centrifugue a 3.900 x g durante 15 minutos repetición la operación con al menos seis veces.
  10. Medir la absorbancia del eluyente en cada ciclo con un espectrofotómetro UV-VIS de 220-700 nm para no polímeros libres y otros reactivos están presentes en la solución final de la PNC.
  11. Tomar la solución recogida de PNC en la jeringa de 5 mL y filtrar contra un 20 filtro de jeringa de tamaño de poro nm. Recoger la solución filtrada de la PNC en un tubo cónico de 50 mL.
  12. Tomar una solución final diluida de la PNC en una cubeta plástica y medir su absorbancia con el espectrofotómetro de UV-VIS de 220-700 nm. Pico de absorbancia de PNC es 271 nm.
  13. Calcular su concentración mediante el uso de la ley de Beer-Lambert: A = εCL. A es la absorbancia del valor máximo para una muestra determinada, ɛ es el coeficiente de absorción molar del PNC (cm-1 M-1), L es la longitud de trayectoria óptica (anchura de la cubeta, de 1 cm de este método) y C es la concentración molar de nanopartículas medidas.
  14. Medir el diámetro hidrodinámico y el potencial zeta de la PNC sintetizada utilizando un tamaño y zeta potencial analizador de partículas (figura 1).
  15. Almacenar la solución final del PNC en el refrigerador (4 ° C) hasta su uso posterior.
    Nota: Por favor consulte Wu et al. 8 para más detalles de protocolo sobre caracterización de la PNC.

3. etiquetado PNC con colorante fluorescente DiI

  1. Mezclar 0,4 mL de 5 mM (58 mg/L) PNC con 3,6 mL de biología molecular agua de grado en un frasco de vidrio de 20 mL y remover a 500 rpm.
  2. Añadir 24 μl 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato colorante solución (DiI, 2,5 mg/mL diluido en DMSO) en 176 μl de DMSO (dimetil sulfóxido) a la solución de tinte de DiI.
  3. Agrega el tinte DiI gota a gota a la solución de la PNC, revolviendo a 1.000 rpm durante 1 min a temperatura ambiente.
  4. Transferir esta mezcla resultante en un filtro de 15 mL 10 kDa y llene el tubo a la tapa con agua de grado de biología molecular para hacer la dilución total 15 mL.
  5. Purificar el DiI etiquetado solución PNC (DiI-PNC) de DMSO y cualquier posible tinte libre de DiI mediante una centrifugación de sobremesa con el filtro de kDa 15 mL 10 a 3.900 x g durante 5 minutos.
    1. Repita paso 3.5 por lo menos cinco veces.
  6. Filtrar las soluciones de DiI-PNC finales a través de un 20 filtro de jeringa de tamaño de poro nm.
  7. Medir la absorbancia del final DiI-PNC por espectrofotometría UV-VIS y calcular su concentración conforme a la ley de Beer-Lambert (figura 2). Ver paso 2.13 para más detalles.
  8. Almacenar en un refrigerador a 4 ° C para su uso posterior.

4. infiltración de planta hojas con PNC

  1. Añadir 0,1 mL de infiltración lo tampón (100 mM TES, 100 mM MgCl2, pH 7,5, ajustado por el ácido clorhídrico) en 0,9 mL de solución PNC o DiI-PNC de 0,5 mM y de vortex. Utilizar una solución de 10 mM de tampón con infiltración TES como control negativo.
  2. Transferir 0,2 mL de la solución de infiltración PNC o DiI-PNC a una jeringa sin aguja estéril de 1 mL. Puntee para eliminar las posibles burbujas de aire.
  3. Recuperar la planta de la cámara de crecimiento justo antes de la infiltración con nanopartículas para evitar el cierre de estomas posible bajo condiciones de luz ambiente.
  4. Antes de la infiltración, medir el contenido de clorofila de las hojas de a. thaliana con tamaño similar, usando un medidor de clorofila. Medir cada hoja con tres repeticiones (cada repetición que consiste en al menos tres mediciones)14. Elegir que hojas de a. thaliana con similar contenido de clorofila para el experimento de infiltración.
  5. Infíltrate en las hojas lentamente con la solución recientemente preparada de PNC o DiI-PNC presionando suavemente la punta de la jeringuilla sin aguja contra la parte inferior de la lámina de la hoja (cara abaxial) y presione el émbolo (figura 3A).
  6. Suavemente Limpie el exceso de solución que queda en la superficie de la lámina foliar (figura 3B) utilizando un limpiador delicado de la tarea (figura 3C) y etiqueta de la planta. Nueva tarea delicada uso toallitas para cada grupo de hojas.
  7. Mantenga la infiltrada a. thaliana plantas en el Banco para la adaptación de la hoja e incubación con PNC o DiI-PNC durante 3 horas.
    Nota: Las plantas infiltrada a. thaliana son entonces listas para su uso posterior (figura 3D).

5. preparación de las muestras de hojas para Microscopía Confocal

  1. Rollo una cantidad del tamaño de guisante de la observación del gel a sobre un radio de 1 cm (figura 4A) y luego extenderlo hacia fuera hasta que quede 1 mm delgada en un portaobjetos de vidrio (figura 4B).
  2. Utilizar un perforador del corcho (diámetro 0,3 cm) para cortar una sección circular en el centro del gel de observación sobre el portaobjetos de cristal (figura 4C).
  3. Llenan el corte bien enteramente perfluorodecalina (PFD) para la resolución de imágenes más profunda y mejor confocal en tejidos de la hoja.
  4. Utilizar un perforador del corcho (diámetro 0,2 cm) recopilar discos de hoja de la DiI-PNC adaptada se infiltraron en las plantas de a. thaliana (figura 4D).
  5. Montaje del disco de hoja en el PFD llenado afrontar el infiltrado (abaxial) lado de la hoja.
  6. Poner un cubreobjetos cuadrado encima del disco de hoja y presione suavemente sobre el cubreobjetos portaobjetos uniformemente para sellar con el pozo del gel de la observación y no mantener burbujas de aire atrapado (figura 4E).

6. proyección de imagen de DiI-PNC en tejidos de la hoja mediante Microscopía Confocal

  1. Utilice un objetivo de 40 X en un microscopio confocal invertido del laser.
  2. Caída de dos a tres gotas de ddH2O en la parte superior de la lente del objetivo 40 X.
  3. Colocar el preparado DiI-PNC infiltrado hoja muestra portaobjetos en la parte superior el invertido 40 X lente objetiva.
    1. Asegúrese de que el lado del cubreobjetos pero no el vidrio Deslice contacto directamente con el ddH2O en la lente.
  4. Encontrar una región de interés en la muestra bajo el microscopio con luz láser o campo claro.
  5. Inicie el software del microscopio y encienda el láser de argón (fijado en el 20%).
  6. Coloque el agujero de alfiler para recoger un corte óptico menos de 2 μm y un promedio de línea de 4.
  7. Imagen de la muestra con la configuración del microscopio confocal: excitación de láser de 514 nm (30%); Espesor de sección Z-Stack: 2 μm; PMT1: 550-615 nm (para imágenes de DiI-PNC); PMT2: 700-800 nm (para proyección de imagen de cloroplasto).
  8. Tome imágenes confocales representativas de las muestras de hojas de diferentes personas, un mínimo de tres réplicas biológicas.

7. proyección de imagen PNC en vivo ROS borrado mediante Microscopía Confocal

  1. Preparar 25 μm 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA, un tinte para indicar un ROS general) y 10 μm dihydroethidium (DHE, un tinte para indicar el anión superóxido) tintes en TES infiltración de tampón (pH 7,5) en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, por separado.
  2. Utilizar un perforador del corcho (diámetro 0,2 cm) para recoger hojas discos de la PNC adaptado se infiltraron en las plantas de a. thaliana .
    1. Use la punta afilada de las pinzas para hacer tres o cuatro agujeros en los discos de hoja para acelerar el proceso de carga de tinte.
  3. Transferencia de la hoja discos a tubos de microcentrífuga con H2DCFDA y DHE por separado e incubar durante 30 min bajo la oscuridad.
  4. Después de la incubación, enjuague la hoja discos con ddH2O tres veces y montaje que en el cristal se deslice con la observación del gel (ver protocolo de sección 5).
  5. Colocar el portaobjetos en el microscopio confocal y enfocar manualmente a una región de células del mesófilo de la hoja. Ver protocolo de sección 6 para más detalles.
  6. Exponga los discos de hoja a los UV-A (405 nm) láser de 3 minutos generar ROS y registrar el cambio de intensidad de señal ROS en series de tiempo ("xyt") por disco de hoja.
  7. Imagen del disco de hoja con la configuración del microscopio confocal: 40 X agua objetivo; 496 excitación láser de nm; PMT1: 500-600 nm (de DHE y DCFDA tinte detección); PMT2: 700-800 nm (para detección de cloroplastos). Utilice una planta infiltrada con sólo infiltración tampón como control negativo.

8. PNC depuración de H2O2in vitro

  1. Realizar la actividad mimética de la CAT (catalasa) de la sintetizada PNC en vitro siguiendo los métodos anteriores publicaciones3,8,15
  2. Añadir 45.4 μL de infiltración x TES 1 buffer (10 mM TES, 10 mM MgCl2, pH 7.5, ajustado por el HCl), PNC (60 nM, 3 μL) y H2O2 (2 μm, 1 μl) en un pozo (placa bien fondo redondo blanco 96) y suavemente mezclar mediante pipeteo.
  3. Añadir 10-acetilo-3,7-dihydroxyphenoxazine (trabajo concentración 100 μm, 0,5 μl) y peroxidasa de rábano (HRP; trabajo concentración 0,2 U/mL, 0.1 μl) en el pozo, suavemente mezclar mediante pipeteo e incube durante 30 min 10-acetilo-3,7-dihydroxyphenoxazine reacciona con H2O2 y se convierte en resorufin en presencia de HRP.
    1. Envolver el plato con papel de aluminio para evitar la luz durante la incubación.
    2. Preparar un control negativo utilizando agua o buffer de reacción para reemplazar H2O2.
    3. Excepción de la solución madre, preparar todas las soluciones a temperatura ambiente.
  4. Después de la incubación, con un lector de placas, monitorear la absorbancia a 560 nm a utilizar resorufin para indicar el nivel de H2O2. Régimen de tiempo en 0, 2, 5, 10, 20 y 30 minutos.

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Resultados

Caracterización y síntesis de la PNC .
PNC fueron sintetizados, purificada y caracterizada siguiendo el método descrito en la sección de protocolo 2. Figura 1 A muestra la coloración de las soluciones de nitrato de cerio, PAA, la mezcla de nitrato de cerio y PAA y PNC. Un cambio de color de blanco a amarillo claro es visto después de PNC se sintetiza. Después de la purificación con un filtro de 10...

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Discusión

En este protocolo, describimos PNC síntesis, caracterización, colorante fluorescente etiquetado y proyección de imagen confocal de las nanopartículas en las células mesophyll vegetales para exhibir su en vivo ROS actividad libre-radical. PNC se sintetizan a partir de una mezcla de solución PAA en hidróxido de amonio y nitrato de cerio. PNC se caracterizan por spectrophotomery de absorción y la concentración determinada mediante ley de la cerveza-Lamberts. Medidas de potencial zeta confirman la superficie negativ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Universidad de California, Riverside y USDA Instituto Nacional de alimentos y agricultura, proyecto de Portilla 1009710 J.P.G. Este material está basado en trabajo apoyado por la National Science Foundation bajo la subvención no. 1817363 a J.P.G.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cerio (III) nitrato hexahidratadoSigma-Aldrich238538-100G
Agua de grado de biología molecular, CorningVWR45001-044 
Tubos de centrífuga cónicos Falcon 50 mLVWR14-959-49A
) 1.800 MwSigma-Aldrich323667-100G
Fisherbrand Mezclador de vórtice digitalFisher Scientific02-215-370
Fisherbrand Mezclador de vórtice digital Accesorio, retenedor de insertoFisher Scientific02-215-391
Mezclador de vórtice digital Fisherbrand Accesorios: Juego de insertos de espumaFisher Scientific02-215-395
Solución de hidróxido de amonioSigma-Aldrich05002-1L
PYREX Griffin Beakers, Graduado, CorningVWR13912-149 
RCT básicoIKA3810001
Eppendorf Microcentrífuga 5424VWR80094-126
Amicon Ultra-15 Unidades de filtro centrífugoMillipore-SigmaUFC901024
Allegra X-30 Series Centrífuga de sobremesaBeckman CoulterB06314
UV-2600 SptecrofotómetroShimadzuUV-2600 120V
Whatman Anotop 10 filtro de jeringaSigma-AldrichWHA68091102
BD Jeringas Desechables con Puntas Luer-LokFisher Scientific14-829-45
Zetasizer Nano SMalvern PanalyticalZen 1600
1,1′-Dioctadecil-3,3,3′,3′-perclorato de tetrametilindocarbocianinaSigma-Aldrich42364-100MG
Dimetilsulfóxido, ACSVWRBDH1115-1LP
Sunshine Mix #1 LC1Green Island Distributors, Inc5212601.CFL080P
Adaptis 1000ConvironA1000
TES, >99% (valoraciónSigma-AldrichT1375-100G
Cloruro de magnesioSigma-AldrichM8266-1KG
Jeringa Air-Tite All-Plastic Norm-JectFisher Scientific14-817-25
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Limpiaparabrisas para tareas delicadasFisher Scientific06-666A
Gel de observaciónCarolina Carolina132700
Corning Portaobjetos de microscopio, esmerilados por un lado, un extremoSigma-AldrichCLS294875X25-72EA
Barrenador de corcho Juegos con asasFisher ScientificS50166A
PerfluorodecalinaSigma-AldrichP9900-25G
Micro Cubreobjetos, Cuadrado, Nº 1VWR48366-045
Microscopio confocal de barrido láser Leica TCS SP5Leica MicrosystemsTCS SP5
2′,7′-Diacetato de diclorofluorescinaSigma-AldrichD6883-250MG
DihidroetidioSigma-AldrichD7008-10MG
Fisherbrand Premium Microcentrífuga Tubos: 1,5 mLFisher Scientific05-408-129
Cubetas Eppendorf UvetteSigma-AldrichZ605050-80EA
Medidor de clorofila Konica MinoltaSPAD-502
Poly (ácido acrílico

Referencias

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