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Artículo de método

Un modelo de ratón Hyperandrogenic para estudiar el síndrome de ovario poliquístico

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DOI:

10.3791/58379

⸱

2 de octubre de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Health, Beijing Military General Hospital, 3Southern Medical University, 4Department of Molecular and Cellular Physiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Gynecology and Obstetrics, Johns Hopkins University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Describimos el desarrollo de un modelo de ratón de SOP-como magro con dihidrotestosterona pelotilla para el estudio de la fisiopatología del SOP y la descendencia de estas presas como SOP.

Resumen

Hyperandrogenemia juega un papel fundamental en la función reproductiva y metabólica en las hembras y es el sello distintivo del síndrome de ovario poliquístico. Desarrollo de un modelo de ratón de SOP-como magro que imita a las mujeres con SOP es clínicamente significativo. En este protocolo, se describe dicho modelo. Mediante la inserción de una longitud de 4 mm de pastilla de polvo de cristal DHT (dihidrotestosterona) (longitud total de la pelotilla es 8 m m), y reemplazarlo cada mes, que son capaces de producir un modelo de ratón de SOP-like con doblez de 2 los niveles DHT suero mayor que los ratones no implantados con DHT (no-DHT). Se observó disfunción reproductiva y metabólica sin cambiar el peso corporal y composición corporal. Mientras que exhibe un alto grado de infertilidad, un pequeño subconjunto de estos ratones hembra SOP-como puede quedar embarazado y sus hijos muestran retraso de la pubertad y aumento de la testosterona como adultos. Este modelo de ratón magro como PCOS es una herramienta útil para el estudio de la fisiopatología del SOP y la descendencia de estas presas como PCOS.

Introducción

Hiperandrogenismo es el síndrome de ovario poliquístico (SOP) según los criterios del NIH y del exceso de andrógenos y SOP (AE-SOP) la sociedad. Las mujeres con SOP tienen dificultad para quedar embarazadas y han aumentado el riesgo de embarazo complicaciones1. Incluso si consiguen embarazadas, su descendencia femenina tiene una de2,de los resultados adversos para la salud3. Se han desarrollado modelos animales usando varias estrategias4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 y exhibe muchas características del SOP (anovulación, y tolerancia deteriorada de la glucosa y la insulina) con mayor peso corporal y obesidad había asociada con el tamaño del adipocito agrandado y aumentó el peso del adipocito. Hay dos estrategias principales para producir modelos de animales que se utilizan para el estudio de PCOS. Uno es el tratamiento con altos niveles de andrógenos directamente (inyección de andrógenos exógenos, inserción) o indirectamente (por ejemplo, bloqueando la conversión de andrógenos a estrógenos con inhibidor de la aromatasa) después nacimiento13. Otro es por hyperexposure fetal de andrógenos durante la gestación14,15 estudiar la descendencia. Por ejemplo, la hembra crías de mono rhesus16,17, ovejas18y roedores expuestos a niveles masculinos de andrógenos durante el período intrauterino desarrollan SOP-como rasgos más adelante en la vida. Estos modelos habían mejorado significativamente nuestra comprensión de los efectos de andrógenos elevados y programación fetal y uterinos efectos ambientales. Sin embargo, estos modelos tienen sus propias limitaciones: 1) los animales desarrollan obesidad y por lo tanto es difícil separar los efectos del hyperandrogenemia reproductiva inducida por la obesidad y la disfunción metabólica; 2) antes del embarazo, las mujeres con SOP ya exhiben altos niveles de andrógenos, así ovocitos han sido expuestos a andrógenos en exceso antes de la fecundación; 3) las dosis farmacológicas de la testosterona (T) o dihidrotestosterona (DHT) usado después del nacimiento o durante la gestación pueden no reflejar el ambiente de andrógeno de PCOS. Se han medido los niveles de testosterona y DHT en suero y en líquido folicular ovárico y testosterona y los niveles DHT son 1.5 a 3.9 veces mayor en mujeres con SOP5,19,20,21 ,22,23 en comparación con las mujeres. Hemos creado un ratón adulto modelo23,24,25 que se desarrolla la disfunción reproductiva y metabólica dentro de dos semanas de la iniciación de la exposición crónica de DHT de la inserción de un pellet con 4 mm de longitud de polvo de cristal DHT (longitud total de la pelotilla es 8 m m). Este modelo produce suero DHT niveles sobre 2 superior (denominado 2xDHT) que el de los ratones de control sin tratamiento de DHT. Los ratones 2xDHT no presentan alteraciones del estradiol del suero basal, testosterona, LH y no no desarrollar obesidad y muestran similar peso ovárico, los niveles séricos de colesterol, ácidos grasos libres, leptina, TNFα y IL-623,24, 25 relativas a controles hasta 3,5 meses después de DHT inserción23,24,25. Además, por el apareamiento de las hembras que ya han desarrollado características del SOP, podemos estudiar el impacto de un ambiente materno hyperandrogenic en la salud metabólica y reproductiva de la descendencia15.

Este nuevo paradigma (pertinente a los criterios NIH y sociedad AE-SOP) modelos de la enfermedad mediante la producción de niveles relativamente similares de andrógenos a las mujeres con SOP 2 - 3-fold mayor testosterona o niveles de DHT en comparación con las mujeres. Sin embargo, este modelo se mantiene por DHT exógena continua y no de hiperandrogenismo endógeno programada, una vez que se retira el DHT. El objetivo general de este artículo es concentrarse en 1) Cómo hacer que el perdigón DHT; 2) Cómo generar un SOP lean como modelo de ratón; 3) estrategias para evaluar la descendencia femenina de estas represas. Otras medidas y la evaluación de fenotipos no se abordan en este manuscrito, pero pueden encontrarse en5,15,23,24,25,26.

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Protocolo

Aquí, presentamos protocolos detallados para la inserción y preparación de pellets DHT y para la prueba metabólica y reproductiva. Los ratones utilizados en este estudio fueron un fondo mixto (C57/B6, CD1, 129Sv) y se mantuvieron con alimento y agua ad libitum en un ciclo de luz/oscuridad de 14/10 h a 24 ° C en las instalaciones de edificio de Broadway de investigación animal en la Facultad de Universidad de Johns Hopkins de Medicina. Todos los procedimientos fueron aprobados por la Comisión de uso y de Johns Hopkins Universidad Animal Care.

1. crear el modelo de ratón de síndrome-como

  1. Preparación de pellets DHT
    1. Tubo de silastic de autoclave para esterilizar. Cortar los tubos de silastic a una longitud de 15 mm con una cuchilla de afeitar;
    2. Sellar un lado inyectando silicona adhesiva médica en el tubo con una aguja blunted 20 G conectada a una jeringa de 3 mL. Émbolo debe ser retirado de la jeringa y luego adhesivo insertada en el depósito. El émbolo se reinserta y adhesivo hacia abajo hasta que comience a salir de la aguja. La aguja blunted se hace cortando el lado de la extremidad aguda de la aguja de 20 G con cualquier tijera fuerte. La longitud de silicio en el tubo debe ser más de 2 mm para permitir el recorte de la producción;
    3. Seque durante la noche; Si hay burbujas de aire en el lado cerrado. Los sin burbujas de aire se utilizan para las pelotillas de DHT. Otros pueden utilizarse para las pelotillas de control no-DHT.
    4. Usar guantes, mascarilla, gafas y bata de laboratorio antes de hacer pellets de DHT en una campana para evitar la exposición de la DHT a la piel.
    5. Verter polvo DHT en un recipiente plástico peso barco y presione el lado abierto del adhesivo capsulada tubos (producidos en A1.1) en el polvo de la DHT.
    6. Polvo DHT puede se apisona con un clip de papel grande que se endereza.  Continúe hasta que la DHT alcanza una altura de 4 m m (o la longitud deseada). Compruebe la longitud de la DHT con una regla y selle el lado abierto con silicio, seco durante la noche.
    7. Corte cada lado sellado para hacer que la longitud de silicona 2 mm de largo. La longitud total de la pelotilla será 8 mm.
    8. Sellar ambos lados del tubo de vacío de silastic como pelotilla del control (no-DHT).
    9. Mantenga pastillas en un tubo cónico de 50 mL, envuelto con papel de aluminio (para evitar la exposición a la luz) a temperatura ambiente hasta su uso. Los pellets DHT mantienen eficacia plena durante al menos 3 meses de almacenamiento.
  2. Reemplazo e inserción de DHT
    1. Hasta 20 DHT pellets o gránulos de control se introducen por separado en un tubo cónico de 50 mL con solución salina al de 0.9% estéril 30 mL por 24 h a 37 °C para conseguir el equilibrio justo antes de la inserción.
    2. Antes de la cirugía, las superficies y los guantes son desinfectados con clidox y las superficies de trabajo están cubiertas con papel absorbente con plástico (cojín quirúrgico).  Todos los instrumentos que entran en contacto con animales son descontaminados antes de entrar en el Animalario en autoclave.  Instrumentos permitirá seco y fresco antes de su uso.
    3. se utilizan ratones hembra 2 meses de edad (4-5 ratones/jaula). Ratones se inyectaron por vía intraperitoneal con xilacina (3,5 mg/kg bw) y ketamina (78,8 mg/kg bw) usando una jeringa de insulina. Cálculos para la mezcla y dosificación de la anestesia es en la tabla 1.
    4. Después de anestesia adecuada se logra, según lo medido por la pérdida del reflejo del dedo del pie y lenta la respiración, el ratón será preparado para la cirugía.
    5. Desinfectar la piel de la zona con betadine con una gasa estéril y de limpiar con etanol al 70%.  Otra vez se pintarán la zona con betadine.
    6. Un orificio de alrededor de 5 mm de longitud con las tijeras debajo de la piel cerca del cuello. Usando un trochar de 10 G, haga un pequeño túnel (15 mm) en dirección rostral. La pastilla se inserta dorsalmente con el trochar.
    7. La apertura luego se sella con pegamento quirúrgico. Manual aproximado la herida los bordes con pinzas y movimientos de cepillado suave para aplicar una capa delgada de adhesivo líquido a los bordes de la herida aproximados. Capas delgadas de 3 la acumulación de pegamento para asegurar que el adhesivo se distribuye uniformemente sobre la herida. El adhesivo debe extenderse 1 cm a cada lado de los bordes de la herida yuxtapuestos. Suturas o clips quirúrgicos pueden utilizarse también para cerrar el agujero. Vuelva a poner ratones en la jaula, alojada individualmente, con una almohadilla de calor para la recuperación. Reemplazar pellet cada 4 semanas para mantener un nivel constante de exposición del andrógeno. Se eliminará la pastilla original y nuevo pellet se insertará como se describe en A1.15 en posición similar.
    8. Prueba de ciclicidad estral después de 3 días de la inserción de la DHT. Etapa del ciclo estral es evaluado mediante citología vaginal.  Las células vaginales son recogidas por 16 días consecutivos utilizando una pipeta p10 para chorros de solución salina estéril (aproximadamente 10 μl) en la cavidad vaginal y luego retirar la solución salina con la misma punta de pipeta estéril.  Las células vaginales mudadas de la pared vaginal mezclan con solución salina y se recogen.
    9. Solución salina con las células sobre un portaobjetos rotulado se separó. Cada diapositiva puede contener seis muestras. Diapositivas están etiquetadas a la nota que muestra se coloca en cada uno de los seis lugares.
    10. Después de la solución salina haya secado por completo de la diapositiva, poner el portaobjetos en un recipiente con etanol al 100% para fijar las células. Diapositivas se fijarán durante al menos 5 minutos, pero pueden permanecer en fijador indefinidamente hasta su uso posterior.
    11. Poner diapositivas en soluciones de tinción para 1 minuto de tampón B y C. Wash portaobjetos con agua corriente y seca a temperatura ambiente.
    12. Examinar la morfología celular en un microscopio de luz objetiva de 10 X.  Morfología de la célula para distinguir el proestro (P), (E) de estro, metestro (M) y diestro (D) se describe en referencias27,28,29.
    13. Cuenta los días en cada etapa y dividirán por el número total de días para calcular porcentaje tiempo en cada etapa.
    14. Prueba de tolerancia a la glucosa a los 21 días después de la inserción de DHT por ayuno los ratones durante la noche (16 h) y la inyección intraperitoneal de 2 g/kg de peso corporal de dextrosa 20%. Por ejemplo, si un peso corporal de ratón es 25 g, este ratón se inyectará con 250 μl de dextrosa 20% con una jeringa de insulina de 50 cc (0,5 mL). Glucómetro y las tiras reactivas evalúa los niveles de glucosa mediante el muestreo de sangre de vena de la cola en el 0, 15, 30, 60, 90, 120 min. Esto se describe en detalle en otra parte30.
  3. Colección de la sangre
    1. Recoja la sangre en varios días después de la inserción de la DHT (que límite de volumen de la colección 100 μL para esteroides y 30ul para análisis de LH/FSH) entre el 9 y 10:00 por vena submaxilar sangrado con la lanceta. Esto se describe en11.
    2. Centrifugar la sangre a 6.000 x g a 4 ˚C por 10 min y recoger la capa de suero en otro tubo de 1.5 mL que puede ser almacenado a-80 °C hasta análisis.

2. evaluación reproductiva perfiles de descendencia femenina de crónico DHT insertan presas

  1. Apareamiento
    1. Desplazar el ratón hembra a probarse en la jaula con un macho fértil probada (que previamente ha tenido cachorros con un ratón hembra) a los 15 días después de la inserción de pellets.
    2. Documento de peso corporal de la presa cada semana para determinar si el ratón está embarazado. Presa aumenta de peso de más de 3 g en una semana indica embarazo.
    3. Recoger la sangre de las presas la segunda semana después de que observamos mayor peso de las presas más de 3 g de la semana anterior.
  2. Determinado por la abertura vaginal y el primer estro de la pubertad
    1. Compruebe la abertura vaginal mediante inspección visual cada día después de que los cachorros son destetados a 21 días después del parto (PND), medir la distancia anogenital y registrar la edad de apertura vaginal.
    2. Una vez que se abre la vagina, recoger las células vaginales todos los días, como se describe en 1.2.8–1.2.11 para comprobar ciclicidad estral.
    3. Observar la morfología de la célula como 1.2.12 descrito, y el primer estro se define como la fecha que todas las células son cornified las células epiteliales.
  3. Cuerpo peso y oído punch
    1. Sumergir la extremidad de la lanceta en la pasta de tatuaje y marque cada cachorro con tatuaje en el dedo del pie como se describe en la referencia12 7 PND y pesar ratones cada 7 días hasta los 70 días de edad.
    2. Ratones de golpe de oído a numerarlos utilizando el sistema en la figura 1 entre 12 a 16 PND. Para distinguir el sexo, examinar el lado ventral del cuerpo, las hembras tienen pezones visibles.
    3. Recoja la sangre en el 21, 26, 70 PND después del nacimiento como se describió anteriormente en 1.3.1
  4. Análisis hormonales
    1. Los niveles de DHT en suero de sangre se miden por ambos análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) y por tándem cromatografía líquida masa espectrometría (LC-MS)23,24,31,32. T se mide por LC-MS, o un rata/ratón ELISA que ha sido validado por la base de ensayo de ligando de Universidad de Virginia en el centro de investigación en reproducción23,24.

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Resultados

Niveles de DHT y prueba de tolerancia a la glucosa

Niveles de DHT se midieron de suero recolectado por tanto ELISA y por LC-MS según protocolo 1.24, 1.25 y 2.9, 3.0. Los valores absolutos DHT son diferentes entre espectrometría de masas y ELISA, sin embargo, el repliegue relativo (aproximadamente 2 veces) de vs DHT DHT no es similar de ambos ensayos y a través de experimentos de15,

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Discusión

Hiperandrogenismo es una característica clave de PCOS. Los niveles séricos DHT (dos veces más en ratones DHT que en ratones no-DHT) utilizados en este protocolo son inferiores a los reportados por otros investigadores en estudios previos y están calibrados para imitar proporcionalmente las mujeres con SOP5,19, 20,21. A diferencia de otros modelos, este modelo DHT 2 veces no altera el peso corp...

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Divulgaciones

Nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (subvenciones R00-HD068130 a S.W.) y el centro de investigación de Diabetes de Baltimore: pilotos y viabilidad subsidio (S.W.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Polvo cristalino de 5α-DHTSigma-AldrichA8380-1G
Dow Corning Tubo SilasticFisher Scientific11-189-15D0,04 pulgadas/1 mm de diámetro interior x0,085 pulgadas/2,15 mm de diámetro exterior
Adhesivo médico de siliconaFactor II, InC.A-100
Gafas, batas de laboratorio, guantes y mascarillas.
10 y micro; Puntas de pipeta L sin filtroPortaobjetos de11113700
frotisFisher Scientific12-550-003
Diff Quik para tinción de célulasFisher Scientific
LancetaFisher Scientific NC9416572
Jeringa de 3 mLBecton, Dickinson and Company (BD),30985
aguja adjunta: 20 GBD305176
Regla: cualquier longitud superior a 10 cm con escala milimétrica.
XilacinaVet one AnnSeA LA, MWI, BoiseNDC13985-704-10100 mg/mL
Clorhidrato de ketaminaHospira, IncNDC 0409-2051-05100 mg/mL
Grapa quirúrgicaAutoClip® Sistema, Fine Science Tool12020-00
Jeringa de insulinaBD3294611/2 CC, dosis baja Jeringa de insulina U-100
TrocarInnovative Research of AmericaMP-182
MicroscopioCarl Zeiss Primo Star415500-0010-001Alemania
Puñetazo de orejaFisher Scientific13-812-201
Testosterona rata/ratón ELISA kitIBLB79174
DHT kit ELISAAlpha Diagnostic International1940
ultra glucómetro de un toqueLife Scan, Inc.
Tiras reactivas ultra de un toque LifeScan, Inc.
Tubo EppendorfFisher Scientific05-402-18
Hoja de afeitarFisher Scientific12-640
Clidox
Fisher Scientific 50587953Fabricante: Andwin Scientific 56616018
Betadine Solución Antiséptica Walgreens
3M Vetbond (cianoacrilato de n-butilo)3M Science. Aplicado a la vida
Scientific de EE. UU. para NC9979740 Fisher Scientific Almohadilla quirúrgica Fisher Scientific NC0089321

Referencias

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