Inversa, disección y DiceCT revelan lo contrario oculta datos en la evolución de la cara de Primate

La musculatura mimética o musculatura de expresión facial, es músculo esquelético y se encuentra en Mammalia¹. Mientras más mamífero músculo esquelético se une a puntos de referencia óseos discretos, musculatura mimética es única en sus accesorios sobre todo en la piel de la cara, cuero cabelludo y el aspecto ventral del cuello^{1,2,3, 4}. Contracción de la musculatura mimética deforma la "máscara facial" en expresiones o facial muestra de intención social y emocional, cambia el tamaño y la forma de los esfínteres de los ojos, cavidad nasal y cavidad oral utilizado en la alimentación, respiración y vocalizaciones, y es parte del mecanismo de comunicación visual en general de aproximación entre la mayoría Mamíferos^2,3,4,5. A través de Mammalia, las pantallas faciales generadas por los músculos miméticos ayudar a regular y mantener límites territoriales, lazos sociales y el grupo social contaba sus congéneres en las intenciones emocionales y de comportamiento del remitente^{2, 5}.

Entre los mamíferos, los primates se caracterizan en parte como con un alto nivel de comportamiento social a través del ciclo de vida con todas las especies viven en un grupo social^2,5. Mientras algunos taxones, como la nocturnas galagos y Loris, pueden vivir en grupos formados sólo de madre y cría, otros taxa, como el diurnos macacos y babuinos, puede vivir en grupos de más de 100 personas⁶. No importa el tamaño del grupo social, primates suelen ser estereotipados comportamientos sociales asociados a la fila y territorialidad y estos comportamientos suelen incluyan un componente de pantalla facial. Pantallas faciales son parte del proceso de mantenimiento de vínculos entre miembros de grupos sociales, las jerarquías de dominación, reproducción y la comunicación que es parte de la vida cotidiana, especialmente en especies diurnas^2,5,7 . Aunque ha sido claro desde hace tiempo la musculatura facial se utiliza para crear estas pantallas faciales, sólo recientemente se ha hecho evidente que la fisiología y la forma de la musculatura facial se asocian con las demandas funcionales de variables sociales^{2, 8}. Estudios previos en las gamas diversas filogenéticamente y de conducta de los primates han demostrado que especies diurnas viven en grande, complejos grupos sociales tienden a tener un alto número de discretas pantallas faciales que se centran en el movimiento de los labios, cejas y párpados con un número elevado de músculos faciales agrupadas alrededor de los labios y la región orbital⁹. Por el contrario, ha habido pocos estudios en especies nocturnas que viven en pequeños grupos, pero estas especies tienen un número elevado de músculos faciales discretos con los accesorios alrededor del oído externo y los labios, que pueden estar asociadas con los movimientos de los labios y oído (que se han documentado en algunas especies nocturnas en encuentros agonísticos con sus congéneres y localizar sonidos)^2,9,10,11. Además, los seres humanos tienen un relativamente alto porcentaje de fibras de miosina lentas en musculatura mimética que los macacos rhesus o los chimpancés, que pueden estar relacionado con el "retraso" en la contracción de la musculatura mimética humana alrededor de los labios usa durante la producción de sonidos del lenguaje o capacidad general de resistencia de la fatiga de los músculos⁸.

Los seres humanos son, sin duda, la más social de todos los primates y han desarrollado el lenguaje como un componente de comunicación social. Todavía, sin embargo, los seres humanos utilizan expresión facial como medio de comunicación visual y tienen el mayor repertorio de pantalla facial conocido entre primates. En un esfuerzo para entender más completamente las variables que rodean la evolución del comportamiento social de primates humanos y general, es deseables una mayor comprensión de la morfología y fisiología de la musculatura mimética del primate. Porque la musculatura mimética se une a la piel sí mismo y, en algunas especies, puede excepcionalmente fina y difícil de visualizar, hemos desarrollado un método único de visualizar esta musculatura para que tanto los procesos de registro bruto de presencia/ausencia y los accesorios como toma de muestras para el procesamiento de microanatomical.

"Disección inversa" es un método para la preservación de la musculatura mimética por quitar la máscara facial completa de la cabeza y aumentar la visibilidad de los músculos incluso pequeños. Debido a disección inversa es un proceso destructivo, ejemplares raros y valiosos pueden no siempre estar disponibles para esta metodología. DiceCT es un método eficaz que puede visualizar muchos de los músculos miméticos en pequeñísimos especies^12,13,14. Este método se puede utilizar en concierto con la disección del reverso o en casos raros, valiosos especímenes no pueden ser disecados y pueden proporcionar mucha información sin tener que quitar la máscara facial en "disección inversa"^{12,13, 14}. El presente Protocolo describe un conjunto de métodos para combinar la disección inversa con DiceCT para examinar la musculatura mimética del primate.

Porque estos procedimientos utilizan animales que murieron de causas naturales en parques zoológicos o fueron sacrificados en laboratorios de investigación donde fueron parte de los estudios sin relación, estos protocolos no requieren aprobación del IACUC.

1. inversa de la disección

Nota: El protocolo de disección inversa es efectivo para muy pequeños mamíferos, como ratones de laboratorio, hasta grandes mamíferos, como el caballo doméstico. Los músculos miméticos son a menudo mejor conservados y mejor visualizados cuando se queda con la dermis suprayacente en lugar de dejar en el cráneo. Vea la figura 1-3.

1. Desarticular la cabeza de la parte cervical de la columna vertebral antes de procedimientos de disección. Si el cadáver está congelado, deje que se descongele completamente antes de proceder a través de este paso.
   1. Independientemente del estado de conservación, palpar la región occipital del cráneo y la Apófisis espinosa de la segunda vértebra cervical (C2). Tenga en cuenta que la primera vértebra cervical (C1) carece de una Apófisis espinosa, palpando hasta C2 y la región occipital del cráneo dará una ubicación aproximada de C1.
   2. Con un bisturí, hacer cortes horizontales entre la región occipital del cráneo y C2 para comenzar a separar el cráneo de la columna vertebral en el C1. Continuar haciendo cortes hasta que el cráneo es desarticulado de la columna vertebral.
   3. Si la muestra es fresca y no fijadas, 1.1.2-1.2 pasos deba ser ejecutado en un plazo relativamente corto. Además, si el cerebro permanece intacto dentro de la cavidad craneal, necrosis del tejido neural puede proceder rápidamente, por lo que se recomienda que el cerebro sea eliminada del cadáver si el espécimen debe permanecer no fijadas.
      Nota: Como un paso opcional, la muestra puede estar inmerso en formalina al 10% tamponado durante 24 horas para la fijación de la muestra. Esto permitirá un procedimiento de recogida de datos sin prisas.
   4. Si la muestra ya se fija con alcohol etílico o 10% tamponada con formalina, enjuague durante varias horas con agua fresca.
2. Hacer incisiones para soltar la máscara facial del cráneo. Si el cerebro y que cubría la calvaria hayan sido retirados durante la autopsia, hacer una incisión cerca de la región glabelar del cráneo y otro en el aspecto caudal del cráneo en el hueso craneal está intacto.
   1. Una vez que el espécimen ha sido aclarado por varias horas, séquelo con toallas de papel y transferencia al trabajo estación.
   2. Palpar por la protuberancia occipital externa en el borde caudal (o posterior) del cráneo. Esto marca la zona donde el cráneo se une con la columna vertebral. Haga una incisión de línea media empezando en la protuberancia occipital externa y llegar rostral (o adelante) sobre la región frontal y parietal del cráneo, la región orbital con un bisturí #4 para muestras grandes o un bisturí #3 para muestras pequeñas, y entre los ojos, a la región nasal, hasta el área nasal externa entre las narinas.
   3. Hacer un corte en la mandíbula entre los incisivos inferiores, central y avanzar caudalmente (o al revés) hacia la clavícula.
   4. Elegir un lado de la mascarilla para eliminar y dejar el otro lado en el lugar.
3. Liberar un lado de la máscara facial del cráneo.
   1. A partir de la región occipital, utilice el bisturí para cortar la máscara facial, incluyendo la musculatura mimética, lejos del hueso occipital del cráneo, tirar la máscara rostral (o adelante) y lateralmente (al lado). Cortar el músculo occipital del cráneo, dejando una pequeña cantidad del músculo detrás en el cráneo por lo que su adhesión aún puede ser visualizado después de quitar la máscara facial. Dejando una parte del músculo detrás sobre el cráneo cartilaginoso/óseo, los accesorios se pueden preservar para la grabación en un momento posterior.
   2. Una vez que es el oído externo, localizar la musculatura auricular. Corte a través de estos para que una pequeña porción de cada uno queda con el cráneo. Corte a través del cartílago elástico, colocar el oído externo en el cráneo.
   3. Seguir tirar la máscara rostral y suelte cada músculo mimético del cráneo dejando una pequeña porción de cada músculo detrás del cráneo.
   4. Una vez allí es una intacta máscara facial de un lado del cráneo, le permiten sentarse, expuesta al aire, durante una hora (para muestras pequeñas como una rata de laboratorio) hasta a tres horas (para una muestra grande como un caballo doméstico), con la musculatura hacia arriba. Este paso diseca algunas del tejido conectivo en la mascarilla facial y aumenta el contraste de color entre el músculo y tejido conectivo.
4. Retire suficiente tejido conectivo para visualizar la musculatura.
   1. Usando un #3 bisturí, pinzas y microscissors, a desplumar el tejido conectivo que separa la musculatura mimética del uno con el otro.
   2. Para acceder a la capa superficial de la musculatura mimética en esta disección"inversa", levante suavemente y separar la capa profunda de la musculatura de la capa superficial y eliminar el tejido conectivo que rodea la musculatura superficial. La mascarilla resultante puede ser devuelto a la formalina y el procedimiento puede hacer una pausa aquí antes de pasar a otra disección o a las manchas (paso 2). En cada paso intermedio más disección, deje que la máscara facial secar lo suficiente para que el tejido conectivo se puede discernir fácilmente del tejido muscular.

2. proceso de tinción para DiceCT

Nota: Ejemplares deberán ser fijados en formalina al 10% tamponado si DiceCT debe ser utilizado con el fin de preservar el tejido durante el procedimiento de tinción muy largo. Si la muestra no se ha solucionado aún, coloque en un recipiente con suficiente formalina 10% tamponado para sumergir todo el tejido y dejar durante 48 horas.

1. Hacer de 1.75% (m/v) Lugol (I₂KI) para la tinción de la mascarilla.
   Nota: Me hacen₂KI solución para sumergir totalmente la mascarilla dentro del contenedor elegido. Hacen más o menos solución escalar los valores de los solutos y el disolvente igualmente en los pasos 2.1.1 y 2.1.2.
   1. Bajo una campana de humos, añadir 3.50 g yoduro de potasio (KI) a 200 mL de agua destilada en un vaso de vidrio grande. Agregue revolviendo hasta que se disuelva completamente la barra de vidrio.
      PRECAUCIÓN: el yoduro de potasio (KI) puede causar ojo, piel e irritación respiratoria o daño. Use protección ocular y manipular bajo una campana de humos.
   2. Lentamente añadir 1,75 g de cristales de yodo (I₂), revolviendo hasta que se disuelva completamente. Esto le llevará varios minutos.
      PRECAUCIÓN: Cristales yodo (I₂) puede causar ojo, piel e irritación respiratoria o daño. Use protección para los ojos y la piel y trabajar bajo una campana de humos durante la manipulación de este producto químico.
   3. Filtrar la solución en frasco de vidrio ámbar con papel de filtro con tamaño de poro de 11 micras para remover los cristales sin disolver que podrían producir inconsistencias en la tinción.
      PRECAUCIÓN: Esta solución es altamente tóxica para la vida acuática. No se deshaga de la solución de drenaje. En caso de derrame, neutralizar triiodide acuosa (I₃^–) en yoduro (I^–) con 5% (m/v) tiosulfato de sodio (Na₂S₂O₃). Compruebe las condiciones institucionales de residuos yoduro y deshacerse de estos residuos en consecuencia.
2. La mancha la mascarilla.
   1. Coloque la mascarilla parte cortada hacia abajo en un vidrio de color ámbar o recipiente (para que no entre luz) a oscuras lo suficientemente grande como para permitir que la mascarilla para descansar en una forma natural y completamente sumergido.
   2. Vierte la solución de yodo de Lugol sobre la mascarilla hasta que esté totalmente sumergida. Un peso puede ser necesaria para mantener la mascarilla totalmente sumergida y evitar de flotante a la parte superior de la solución. Sellar el recipiente para evitar la evaporación y mantener fuera la luz.
   3. Agite el recipiente continuamente en un eje de balancín eléctrico o regularmente con la mano para facilitar incluso la coloración y evitar cristales de colocar al menos dos semanas. Si más tiempo es necesario manchar adecuadamente los fascículos musculares, reemplazar la solución de Lugol con solución fresca.
   4. Después de dos semanas, retire la mascarilla de la solución. Vierta una pequeña cantidad de agua destilada sobre ambas superficies de la mascarilla a la aclaración. Envuelva la mascarilla facial en toallas de papel húmedo y coloque en una bolsa de plástico sellada durante al menos 24 horas permitir un secado ligero antes de pasar al siguiente paso.
      Nota: El protocolo puede hacer una pausa de hasta una semana. Asegúrese que la mascarilla permanezca ligeramente húmeda durante este período.

3. Análisis de DiceCT

1. Preparar la mascarilla para la exploración del CT.
   1. Monte las mascarillas en un material de baja densidad, tales como la espuma floral, para eliminar cualquier arruga en la máscara y limitar el movimiento de la máscara, la máscara se seca ligeramente durante la exploración. Fijar la mascarilla a la espuma con palillos de madera.
2. Análisis y ajuste de los parámetros de la exploración del CT.
   1. Usar una resolución alta para estas exploraciones, como pequeños fascículos se oscurecerán con resolución menor. Utilizar un espaciamiento entre rebanada y entre distancia de pixel alrededor 0,05 mm.
   2. Analizar la mascarilla montada en un escáner de tomografía computada de alta resolución rayos x.
   3. Si no puede visualizarse completamente, debido al exceso de tinción, fascículos Coloque la mascarilla en solución de formalina al 10% o 5% tiosulfato de sodio para eliminar algunas de la mancha. Si los fascículos no se tiñen lo suficiente, volver de Lugol. Después de ajustar la tinción, scan de nuevo la mascarilla. Seguir hacer los ajustes necesarios y escanear hasta fascículos puedos visualizarse completamente.

4. preparar la mascarilla para la preservación a largo plazo.

1. Neutralizar químicamente la mancha de yodo en la máscara de la cara, eliminar la decoloración del proceso de tinción.
   1. Lugar teñido mascarilla en solución de tiosulfato de sodio 5% (m/v) para neutralizar químicamente muestras. Esto puede tomar varias horas o días. Agitar regularmente durante la extracción.
   2. Volver destained mascarilla a solución de formalina al 10% para la preservación. Si la mancha sigue lixiviación de la muestra en solución, reemplace formalina decolorada con formalina fresca hasta que quede claro para la preservación a largo plazo.

Esta sección presentan ejemplos de resultados en forma de la musculatura facial que puede lograrse mediante el uso de "disección inversa" en concierto con la exploración del DiceCT. Utilizando "disección inversa" para crear una máscara facial, una representación más completa del músculo (facial) mimética a veces se aprecia que en la metodología tradicional de disección. Este método funciona en una gama de tamaños de cuerpo de los primates pequeños, de cuerpo pequeño, por ejemplo, el tití común Callithrix jacchus (figura 4), a los primates de gran tamaño como el chimpancé Pan troglodytes (figura 5), y un primate de tamaño mediano como el macaco rhesus Macaca mulatta (figura 6). Metodologías tradicionales de la disección pueden funcionar bien en primates de gran tamaño que tienen sólida musculatura mimética. Sin embargo, métodos de disección tradicional "enfoque de frente" pueden no funcionar bien con primates pequeños-bodied que tienen músculos faciales gráciles. En estos casos, algunos de la musculatura facial pueden ser indistinguibles del tejido conectivo circundante y pueden perderse durante la disección.

La mancha de yodo ligado a la musculatura mimética y al menos algunos de los escaneos son de calidad suficiente que podemos resolver ambos músculos MIMETICAS individuales (figura 7) así como fascículos individuales del músculo (figura 8) y, por primera vez, obtener volúmenes de músculo entero de estos músculos gráciles. Como se muestra en la figura 7, algunos de los muy pequeños músculos asociados con el oído externo son claramente visibles en las exploraciones DiceCT. No es raro que estos músculos se pierda en algunos procedimientos de disección inversa, tal vez debido a su pequeño tamaño.

Figura 1 : Vista caudal (o posterior) de la cabeza desarticulada de un tití común (Callithrix jacchus) mostrando el inicio del proceso para la creación de la máscara facial en "disección inversa". Musculatura facial asociada con el oído externo se muestra a la derecha de la máscara facial en desarrollo en tonos anaranjados. Tejido adiposo, o grasa, es agrupado alrededor de la musculatura en tonos de amarillo brillante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Vista dorsal de la cabeza desarticulada de un tití común (Callithrixjacchus C.) que muestra la fase media de crear la máscara facial en disección inversa, aquí quitando la máscara de la región orbital del cráneo. La flecha negra indica el área donde los músculos tales como el músculo del oculi de orbicularis se encuentran, antes de la remoción del tejido conectivo. El músculo de los temporalis no es un músculo facial, pero es indicado para dar una idea de la ubicación relativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Vista del lado derecho del tití común (Callithrixjacchus C.) que muestra cerca de la fase final de la creación de la máscara facial en disección inversa, aquí quitando la máscara de la región de labio superior e inferior del cráneo. El músculo masetero no es un músculo facial, pero es indicado para dar una idea de la ubicación relativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Visión profunda (o dentro) de todo el lado derecho de la máscara facial del tití común (Callithrixjacchus C.), mostrando la máscara facial completamente disecada con músculos seleccionadas indicado. Varios músculos se destacan con color para indicar límites. Abreviaturas: AA - auricularis anterior del músculo; DAO - depresor anguli oris del músculo; DLI - depresor labii inferioris del músculo; LLS - músculo elevador del labio superior; OO - músculo del oculi de orbicularis; OOM - orbicularis oris músculo; PA - auricularis posterior músculo; SAL - auriculolabialis superior del músculo; ZM - del músculo cigomático mayor; ZM - músculo menor cigomático. Esta imagen apareció en madrigueras, 20082. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Visión profunda (o dentro) de todo el lado derecho de la máscara facial de chimpancé común (Pan troglodytes), mostrando la máscara facial completamente disecada con músculos seleccionadas indicada. El músculo risorius se indica aquí, un músculo que se pensaba estar presentes entre primates en seres humanos. Esta imagen apareció en Burrows et al., 200615. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 : Visión profunda (o dentro) de todo el lado derecho de la máscara facial del macaco rhesus (Macaca mulatta), mostrando la máscara facial completamente disecada con músculos seleccionadas indicada. CS - músculo de corrugador supercilli; OOM - orbicularis oris músculo; z menor - cigomático menor músculo; 1 - cigomático mayor músculo; 2 - músculo del oculi de orbicularis; 3 - caninus músculo; 4 - músculo en levator labii superioris; 5 - del levator labii superioris y nasi músculo; 6 - músculo de depresor septi; 7 - cortar el borde del músculo buccinators; 8 - muscular en depresor labii inferioris. Esta imagen apareció en Burrows et al., 200916. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7 : Vista profunda (o dentro) de todo el lado derecho de una exploración de la DiceCT de un Eulemur flavifrons demostrando las habilidades de DiceCT para recoger mimética de las fibras musculares. AA: músculo auricularis anterior; CN5: par craneal 5; CN7: nervio craneal 7; DH: músculo depresor helicis; DLI: músculo depresor labii inferioris; F: parte frontal del músculo occipitofrontal; H: helicis músculo; Lia: auriculolabialis inferior músculo; LL: músculo elevador de la labial; M: músculo mentalis; MA: músculo mandibuloauricularis; ML: músculo de maxillolabialis; N: músculo de los nasalis; NL: músculo nasolabialis; O: parte occipital del músculo occipitofrontal; OccA: occipitoauricularis muscular; OO: músculo de oris de orbicularis; OOc: orbicularis occuli muscular; P: músculo platisma; PA: músculo de auricularis posterior; SAL: músculo auriculolabialis superior; T: tragicus músculo; TA: músculo de tragoantitragus haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8 : Visión profunda (o dentro) de todo el lado izquierdo de una exploración de la DiceCT de un Eulemur flavifrons demostrando las secciones seriales en varios puntos. Mancha azul más profunda es de áreas donde hay una fuerte presencia de fibras de músculo miméticas (por ejemplo, alrededor de la abertura del oído externo, apartados a. y b. y la región orbital superior, sección c.). Ligera mancha azul es de las zonas donde hay menos mimética fibra del músculo (por ejemplo, la región del labio superior, sección d.). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen ninguna revelación al informe.