Un modelo de novela In Vitro de lesión cerebral traumática por explosión

Lesión cerebral traumática (TBI) por explosión es un tipo complejo de la lesión cerebral que resulta de la detonación de artefactos explosivos^1,2. Blast TBI ha emergido como un importante problema de salud en los últimos 15 años con los conflictos militares recientes en Irak y Afganistán^2,3. En general, se estima que entre el 4.4% y 22,8% de soldados que regresan de Irak y Afganistán han sufrido TBI suave, una gran proporción de ellos está relacionado con explosión, con una mayor tasa informó de la explosión TBI en las fuerzas de Estados Unidos en comparación con las fuerzas de UK^{4 ,5}.

El uso de dispositivos explosivos improvisados ha sido responsable de la mayoría del trauma asociado de explosión, incluyendo ráfaga TBI, soportada por el fuerzas militares⁶. La detonación de una carga explosiva resulta en una muy rápida, pero transitoria, aumento de presión, que ocurre en milisegundos. La onda de sobrepresión resultante de una explosión de campo libre de la vida real es modelada por la función de Friedlander, con una subida repentina a la sobrepresión máxima seguida de un decaimiento exponencial^7,8. La gama de fuerzas extremas y su curso rápido tiempo de respuesta en un evento de explosión generalmente no tienen experiencia en traumas de la explosión no^1,9. La sobrepresión máxima, que es la presión máxima de la onda y la duración de la onda positiva se cree que son contribuidores importantes a la lesión cerebral de la ráfaga y éstos dependen de la carga explosiva y la distancia de la detonación de^{10, 11}.

El trauma que los resultados de un soplo explosivo está clasificado como cuatro componentes discretos, denominados primario, secundario, terciario y cuaternario de la ráfaga lesión^10,12,13,14. Cada uno de estos componentes se asocia con mecanismos específicos de lesiones. Lesión por explosión primaria resulta de la acción directa de la onda de sobrepresión en órganos y tejidos^2,13. Resultados de lesión explosión secundaria del impacto de fragmentos del proyectiles, causando penetrantes y no penetrantes heridas^2,15. Lesión por explosión terciaria ocurre cuando el cuerpo de la víctima es desplazado contra el suelo o los objetos y se asocia con las fuerzas de aceleración/deceleración^1,10,13. Lesión por explosión cuaternario describe un grupo heterogéneo de lesiones directamente relacionados con la explosión no cubierta por la primera tres lesión mecanismos descritos^12,13. Incluye (pero no se limita a) lesión termal, inhalación de humo, radiación, ondas electromagnéticas y efectos psicológicos adversos^13,15. Mayoría TBI asociada a explosión da directamente en los primeros tres mecanismos de lesión, mientras que el cuaternarios mecanismos de lesión de ráfaga se asocian generalmente a lesión sistémica¹³. Los efectos de las fuerzas de aceleración/desaceleración (p. ej., lesión por latigazo), contundente y penetrante traumatismo craneoencefálico se han estudiado ampliamente en relación con otros tipos de TBI (p. ej., accidentes de vehículo de motor, caídas, heridas balísticas). Sin embargo, la onda de sobrepresión de la explosión primaria es exclusiva de lesión por explosión y sus efectos en el tejido cerebral son mucho menos bien entendidos¹⁶. Los mecanismos de lesión explosión primaria, asociados a una onda de sobrepresión, son las primeras de las fuerzas mecánicas para interactuar con el cerebro.

Numerosos modelos preclínicos de TBI se han desarrollado en las últimas décadas que han sido invaluables para entender blast TBI mecanismos de lesión y de la patofisiología e investigar potenciales nuevos tratamientos, que de otro modo sería imposibles hacerlo exclusivamente en la clínica entorno^17,18,19. Aunque ningún modelo preclínico solo puede reproducir la complejidad del trauma de cerebro de explosión clínica, típicamente diversos modelos preclínicos de TBI replican aspectos distintos de TBI humana. La acción perjudicial de las fuerzas asociadas con una explosión de la explosión puede ser estudiada de forma aislada o en combinación en modelos TBI de explosión tanto in vitro e in vivo . Modelos in vitro tienen la ventaja de permitir un control estricto del ambiente experimental (tejido condiciones fisiológica y biomecánica de la lesión), lo que reduce la variabilidad biológica y mejora la reproducibilidad, que permita el estudio de específico molecular cascadas sin los factores de confusión presentes en animales modelos²⁰. Nuestro objetivo fue desarrollar un modelo de vitro para investigar los efectos de la explosión primaria en tejido cerebral. El objetivo fue desarrollar un modelo con una onda de choque supersónica con un representante de la forma de onda de Friedlander de una explosión, campo libre como la producida por un artefacto explosivo improvisado (IED).

Los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron en cumplimiento de la ley de Reino Unido los animales (procedimientos científicos) de 1986 y han sido aprobados por el bienestar de los animales y ética de cuerpo del Imperial College de Londres. Cuidado de los animales fue en cumplimiento de las directrices institucionales del Imperial College de Londres.

1. hippocampal Organotypic rodaja preparación y cultura

Nota: Este protocolo permite la producción de rebanadas hippocampal organotypic según el método de interfaz descrito por Stoppini y colegas con modificaciones menores^21,22,23. Idealmente, no más de tres animales sacrificados y disecados en una sesión para que cada paso se realiza con rapidez y evitar comprometer la calidad de las láminas. Utilizar técnica aséptica en todo.

1. Los siguientes pasos se adopten antes de iniciar el protocolo de disección.
   1. Preparar y filtro esterilizar todas las soluciones de antemano con un filtro 0,22 de μm.
   2. Manten las soluciones a 4 º C durante el almacenamiento y a lo largo de la disección de cerebro y rebanada hippocampal preparación manteniendo los contenedores y placas de Petri en un disipador de calor de metal sentada en hielo húmedo en todo momento.
   3. Autoclave de todo el metal instrumentos, aros y pañuelos de papel.
   4. Asegurar todos los instrumentos y material que se utilizará para cada paso del protocolo están listos para su uso, establecidas de antemano y rociado con etanol al 70%. Asegúrese de que se les permite enfriar y secar.
2. Eutanasia a un 5-7 días-viejo C57BL/6N ratón cachorro por dislocación cervical y brevemente Limpie la superficie de la piel entera con pañuelo de papel estéril empapado en etanol al 70%. Acariciar la piel seca y decapitar el cachorro con unas tijeras de Mayo.
3. Cortar la piel del cuero cabelludo con tijeras de iris a lo largo de la línea media de la cabeza comenzando en la región occipital y terminando cerca del hocico y se retraen lateralmente.
4. Inserte la punta de las tijeras de Vannas en el foramen magnum y hacer dos pequeños cortes laterales en el hueso a lo largo de los sinos transversales, luego cortar el cráneo a lo largo de la línea media hasta el bulbo olfatorio y hacer dos pequeños cortes perpendicular a la línea media en esta región.
5. Con fino punto fórceps curvado, retraer las aletas del hueso lateralmente de la línea media, cuidadosamente Quite el cerebro con una pequeña espátula y transferirlo a un 90 mm silicona elastómero recubierto Petri que contenía "disección mediano.
   Nota: Medio de disección es que Gey equilibrada solución de sal (5 mg/mL de D-glucosa, solución antibiótico-antimicótico 1%, con 10.000 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 10 mg/mL y 25 μg/mL de anfotericina B).
6. Quite el cerebelo y separar los hemisferios cerebrales a lo largo de la línea media usando una cuchilla de afeitar. Use una espátula para transferir los hemisferios cerebrales a una nuevo silicona 90 mm lleno de revestimiento de elastómero de Petri con medio fresco helado disección. Si más de un animal debe ser utilizado en una sola sesión, repita los pasos 1,2 – 1,6.
7. Bajo un estereomicroscopio, el bulbo olfatorio y la punta de la corteza frontal con una hoja de afeitar y separe la corteza cerebral desde el resto del tejido cerebral con unas pinzas de punta fina. Este paso deja el hipocampo expuesto en la superficie medial del tejido cortical. De este paso adelante, uso de campana de flujo laminar cultivo de tejidos (ultravioleta esteriliza y limpia con solución de etanol al 70%).
8. Aplique medio helada disección a un disco plano de plástico para picar y, usando una espátula, coloque el tejido cerebral en el disco tal que la superficie medial de la corteza es hacia arriba y el eje del hipocampo es perpendicular al eje de la cuchilla de picar.
9. Eliminar lo más posible del medio de disección desde el disco para picar con una pipeta Pasteur de punta fina.
10. Cortar el cerebro 400 μm con un picador de tejido a una velocidad de picado de 50% y la fuerza.
    Nota: Es muy importante que este paso se realiza tan rápido como sea posible como el tejido cerebral no está sumergido en medio de la disección.
11. Reemplazar el medio de la disección en el revestimiento de elastómero de silicona de Petri con medio fresco helado.
12. Una vez finalizado el picador de tejido, cuidadosamente sumerja el tejido cerebral en medio de la disección fresco y transferir el tejido cortado a los 90 mm silicona recubierto de elastómero de Petri utilizando un bisturí de hoja recta.
13. Bajo un estereomicroscopio, separar cuidadosamente las rebanadas corticales con unas pinzas de punta fina. Para cada rebanada, inspeccione el hipocampo para morfología y potencial daño a los tejidos como resultado de la disección o corte.
14. Separar los hipocampos de la corteza entorrinal y la fimbria utilizando pinzas de punta fina y pequeñas tijeras de Vannas. Por lo general, se generan alrededor de 6 a 8 rebanadas hippocampal por hemisferio.
15. Transferencia de hasta 6 rebanadas hippocampal a un inserto de cultivo de tejidos mediante un corte pipeta Pasteur y lugar adentro un 35 mm Petri dish. Asegúrese de que las láminas se separan aparte unos milímetros (Esto asegurará que cada rodaja puede ser reflejada individualmente).
16. Inmediatamente agregar helado "medio de cultivo" para la parte inferior de cada placa de Petri, debajo de la estufa de cultivo de tejidos, justo debajo de la parte superior de la cultura de tejido inserta borde.
    Nota: Medio de cultivo contiene medio esencial mínimo de 50% águila, 25% Hanks equilibrada solución de sal, 25% de suero de caballo, 5 mg/mL D-glucose, 2 mmol/L-glutamina, solución antibiótico-antimicótico 1% y 10 mmol/L HEPES, graduado pH a 7.2 con hidróxido de sodio.
17. Cambiar el medio de crecimiento el día después de la disección y luego cada 2 a 3 días después de eso (uso medio de cultivo a 37 ° C). Asegúrese de que el medio de crecimiento se agrega en cantidad suficiente, pero no tanto que se desborda sobre la membrana de inserto de cultivo de tejidos, que puede comprometer la viabilidad de las rebanadas de tejido.
18. Mantener los cortes de tejido en una incubadora humidificada a 37 ° C con 5% de dióxido de carbono en el aire durante 12 a 14 días antes de ser utilizados en experimentos.

2. preparación de las rebanadas Hippocampal Organotypic para el protocolo de TCE de explosión Experimental

Nota: Todos los pasos de esta sección, excepto la proyección de imagen, llevará a cabo en una campana de flujo laminar cultivo de tejidos.

1. Inserte los anillos de acero inoxidable a medida en una placa bien 6 (uno por pozo).
   Notas: Los anillos tienen un borde con una muesca (que debe sentarse en la posición 12:00) y ajuste perfectamente dentro de los pozos, mientras que inserta el cultivo de tejidos se adaptan fácilmente a este borde. Asegúrese de que los anillos son lavados con un desinfectante bactericido, bien enjuagados con agua purificada, esterilizada y dejar enfriar previamente.
2. Llene el pocillo de la placa de la pozo de 6 con precalentado (37 ° C) sin suero "medio experimental" con yoduro de propidio.
   Nota: El medio Experimental con yoduro de propidio es: medio esencial mínimo de 75% águila, 25% Hanks equilibrada solución de sal, 5 mg/mL D-glucose, 2 mmol/L L-glutamina, 1% solución antibiótico-antimicótico, 10 mmol/L HEPES y yoduro de propidio 4.5 μmol/L, pH valorada a 7.2 con hidróxido de sodio.
3. Asegúrese de que el nivel del medio no se alcanza por encima de la muesca del anillo. Transferir la placa de la pozo de 6 con los anillos a la incubadora durante 1 h para que el medio esté a 37 ° C inmediatamente antes de transfieran los insertos de cultivo de tejidos.
4. Transferir los insertos de cultivo de tejidos con las rebanadas de organotypic de los platos de Petri de 35 mm en la placa de la pozo de 6 con los anillos y el medio experimental con fórceps.
5. Hacer un punto en el borde de inserción en la posición 3:00 con un rotulador permanente.
   Nota: Los insertos se van a quitar de la placa de 6 pozos durante el experimento y este paso facilita regresar la inserción a su posición original después de la exposición de ondas de choque y fácilmente hacer un seguimiento de cada rebanada en el protocolo.
6. Cada placa de 6 pozos con un nombre único y fecha de la etiqueta y hacer un mapa de los pozos de cada placa, nombrando cada pozo (e.g., A, B, C, etcetera.) y cada rodaja en cada pozo (e.g., 1, 2, 3, etcetera.), de modo que cada segmento tiene un identificador único ( por ejemplo., A1, A2, A3, etcetera.).
7. Transferir la placa de 6 pozos a la incubadora durante 1 h para las rebanadas a 37 ° C inmediatamente antes de la proyección de imagen.
   Nota: Evitar el desbordamiento del medio o cualquier burbuja de aire debajo de la cultura de tejido Inserte membrana, que puede comprometer la viabilidad de las rodajas.
8. 1 h después de la transferencia al medio experimental, imagen cada rebanada individualmente usando un microscopio de fluorescencia (objetivo de 2 X, NA 0.06) provisto de una adecuada excitación (BP 535/50 nm) y filtro de la emisión (LP 610 nm) para evaluar la salud del segmento antes de la lesión Protocolo se lleva a cabo.
   Notas: Los sectores que presentan áreas de denso rojo coloración en esta etapa se deben considerar presentar viabilidad comprometida y deben excluirse del análisis (estos por lo general representan menos del 10% del número total de segmentos generados). Asegúrese de que la proyección de imagen se realiza de manera secuencial y tan rápidamente como sea posible para reducir al mínimo el tiempo que las rebanadas están fuera de la incubadora (típicamente 6 pozos deben tomar menos 30min a imagen).
9. Mantenga la tapa de la placa de 6 pozos en todo el tiempo. Condensación puede acumularse en el interior de la tapa. Si esto sucede, brevemente use un secador en la posición low.
10. Asegúrese de que todas las condiciones de proyección de imagen son idénticas en diferentes días y entre los experimentos.
    Nota: El objetivo de la proyección de imagen cuantificar la fluorescencia de tejidos, por lo tanto, este paso es importante para asegurar la reproducibilidad de los resultados y permite la comparación de los datos obtenidos.

3. inmersión y transporte de la cultura del tejido se inserta con las rebanadas Hippocampal Organotypic

1. Inmediatamente después de la proyección de imagen, en una campana de flujo laminar, tomar un cultivo de tejidos parte movible de la placa de la pozo de 6 con unas pinzas.
2. Cuidadosamente transfiera el inserto a una bolsa de polietileno estéril (3 x 5 pulg.) previamente lleno con 20 mL de medio experimental caliente (37 ° C) recién burbujas con 95% de oxígeno y 5% dióxido de carbono.
   Nota: Asegúrese de que el medio experimental enriquecido oxígeno y dióxido de carbono fue burbujeado durante por lo menos 40 min 95% oxígeno y 5% dióxido de carbono usando un grifo de scintered de vidrio dentro de una botella de Dreschel y transferido en las bolsas de polietileno estéril dentro de un cultivo de tejido campana de flujo laminar con un filtro bacteriano y un tubo de llenado estéril (127 mm) conectado a una jeringa de 20 mL. Sellar las bolsas inmediatamente y transferirlos a una incubadora de 37 ° C durante al menos 1 h antes de la cultura tejido Inserte a transferencia.
3. Asegúrese de que cada bolsa estéril está marcado correctamente (con la placa y la identificación del bien). Repita este paso para cada inserción de cultivo de tejidos. Excluir las burbujas de aire cuidadosamente al sellado de las bolsas estériles (hechas firmemente girando la parte superior de las bolsas y aplicando una abrazadera de plástico).
4. Retorno las bolsas estériles con los insertos de cultivo de tejidos y las placas de 6 pozos con medio experimental dentro de la incubadora de 37 ° C.
5. Después de 1 h, paquete cuidadosamente las bolsas estériles con los insertos de cultivo de tejidos en cajas de plástico dentro de una caja termo-regulada, llenado con agua desionizada a 37 º C para mantener las rebanadas organotypic a temperatura fisiológica a lo largo de la exposición de ondas de choque Protocolo.

4. preparación del tubo de descarga y exposición de ondas de choque de Hippocampal Organotypic rebanada

1. Use botas de punta de acero de Protecto, una capa de laboratorio y guantes durante la preparación del tubo de choque y la exposición de ondas de choque.
2. Perno de la estructura de soporte de la bolsa estéril para el reborde distal de tubo choque, asegurando que el agujero central está alineado con la salida del tubo de choque (con una varilla esconde).
3. Montar dos transductores de presión radialmente: sensor 1, en la parte media de la sección conducida y sensor 2 en el reborde distal del tubo de descarga (figura 1A). Conecte los transductores de presión a un osciloscopio a través de una unidad de energía de fuente actual.
4. Asegúrese de que todos los controles de flujo y válvulas de liberación de tubo de descarga estén cerrados.
5. Abra la línea de aire comprimido exterior y carga de la válvula de solenoide a 2,5 bar.
6. Abra la válvula de seguridad del cilindro de aire comprimido y abra lentamente el regulador de presión para aumentar la presión de 5 bar.
   Nota: La presión de este regulador debe estar ligeramente por encima del diafragma alta presión de ruptura.
7. Preparar los diafragmas sábanas poliéster de 23 μm de espesor cortar en cuadrados de 10 x 10 cm² . Preparar las manijas con cinta de autoclave y pegarse a la parte superior e inferior de cada diafragma.
8. Colocar un diafragma (única ranura de la recámara doble - configuración de diafragma simple) o dos diafragmas (dos ranuras de la recámara doble - configuración de doble diafragma) en la recámara (figura 1B).
9. Centro de los diafragmas y sujetarlos usando cuatro pernos M24 y tuercas les fijación secuencialmente en forma diagonal simétrica y asegurándose de que los diafragmas son libre de arrugas.
10. Cada bolsa estéril en posición vertical sobre la estructura soporte de la abrazadera, asegurando que la superficie de la cultura del tejido se inserta con las rebanadas hippocampal organotypic se enfrenta a la salida del tubo de descarga y la estufa de cultivo de tejidos se centra en el estéril bolsa (figura 1). Asegúrese de que la bolsa estéril quede firmemente asegurada todo para inmovilización firme y uniforme.
11. Usar orejeras y gafas de seguridad al presionar el tubo de descarga. Encienda la actual fuente de alimentación y osciloscopio para adquirir los datos de la onda expansiva (tasa de adquisición de 50 mega-muestras/s, récord de longitud 20 ms, 1 millón de puntos) y cerrar la válvula solenoide.
12. Usando la perilla de control de flujo en el panel de control de tubo de choque, presurice lentamente la sección controlador de volumen del tubo de descarga para la configuración de diafragma único o la sección de volumen del conductor y la sección podálica doble del tubo de descarga de doble diafragma configuración.
    Nota: Para la configuración de simple diafragma, la presión de ruptura dependerá sólo del material del diafragma y grueso y el diafragma se rompen espontáneamente una vez alcanzado el presión de ruptura de material. Para la configuración de doble diafragma, las presiones de trabajo dependerá de la presión de gas diferencial en el controlador y las cámaras de doble cerrojo y de los diafragmas a punto de estallar de forma controlada, se abre la válvula de seguridad de doble cerrojo manualmente una vez se alcanzan las presiones de destino.
13. Tan pronto como el diafragma de las rupturas (produciendo un ruido), rápidamente cierra el flujo de aire comprimido utilizando la perilla de flujo y abra la válvula de solenoide.
    Nota: El volumen total de la sección de controlador puede ser modificado por la inserción de segmentos, permitiendo una gama más amplia de sobrepresión de pico de la onda expansiva y duraciones que se obtendrá de esconder. La combinación ideal de los parámetros de la onda de choque debería ser suficiente para causar lesiones de tejido pero no tan alto lo hace inserción del cultivo de tejidos o bolsa estéril distorsión o ruptura.
14. Exponer cada bolsa estéril con una inserción de cultivo de tejidos para una onda de tubo de choque solo y volver inmediatamente a la caja termo-regulado antes de una nueva bolsa estéril se toma de la caja y afianzado con abrazadera en el bastidor de soporte. Asegúrese de que pasos 4.10-4.14 se realizan suavemente y rápidamente como sea posible (dentro de unos minutos) para evitar el enfriamiento medio experimental, como temperaturas por debajo de 37 ° C pueden interferir con el desarrollo de lesiones.
15. Una vez que todos los insertos de cultivo de tejidos han estado expuestos a una onda de choque (o protocolo de sham), volver las inserciones de cultivo de tejidos para la original placa de 6 pozos y sus respectivos bien (dentro de una campana de flujo laminar cultivo de tejidos) y vuelva a la incubadora.
16. Mantenga la placa de 6 pozos en la incubadora con 5% de dióxido de carbono en el aire a 37 ° C hasta más de imagen.
17. Incluyen controles de farsa para cada experimento, junto con la exposición de ondas de choque de la rebanada.
    Nota: Rebanadas de farsa se tratan idénticamente a los sectores expuestos a una onda de choque (sellado en bolsas estériles con medio experimental, transportadas al laboratorio de tubo de descarga en la misma caja termo-regulado y suspendido en el marco del metal por un período equivalente de tiempo) pero el choque no se enciende el tubo.

5. cuantificación de lesiones hippocampal Organotypic rebanada

1. En 24 h, 48 h y 72 h, las rebanadas de la imagen como se describe en pasos 2.8 y 2.9.
2. Después de la proyección de imagen en la exposición de ondas de choque de 72 h post, deseche el tejido biológico local siguiente protocolos de residuos y desinfectar autoclave el metal anillos.

El tubo de choque utilizado en este método permite la generación de oscilaciones de sobrepresión que simulan explosiones reales espacio modeladas por la función de Friedlander7,8. Ondas de choque supersónicos con una velocidad de 440 m/s (Mach 1.3) se obtienen (figura 2A). Los datos de forma de onda registrados están de sensor 2, situado radialmente al final de la sección por el tubo de descarga.

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, las culturas de rebanada hippocampal organotypic expuestas a una sola onda de choque (figura 2A) desarrollan lesión significativa cuantificado utilizando yoduro de propidio, un colorante fluorescente altamente polar que penetra sólo las células con comprometida de las membranas celulares24,25 (figura 2B, C).

Incluso en condiciones óptimas y consistentes a otros OHSC publican modelos21,22, hay un bajo nivel de fluorescencia de yoduro de propidio fondo debido, en parte, menores daños causados por el () las manipulaciones inherentes del tejido como los cambios en los medios de comunicación durante el período de cultivo o extracción de la incubadora para la proyección de imagen). Este protocolo de TCE de explosión implica manipulación sustancial que incluye la inmersión de las rodajas en medio de bolsas estériles y un grado considerable de manipulación durante el protocolo de exposición de ondas de choque (e.g., sujeción de las bolsas estériles para la estructura de soporte). Sin embargo, si todos los pasos se realizan con cuidado, esta manipulación adicional no tiene un impacto en la salud subyacente de la OHSC como no observaron diferencias significativas entre un grupo control de rebanadas de mantenerse en las placas de 6 pozos en todo momento (es decir., los insertos no fueron sumergidos o manipulados) y el grupo sham, que incluye segmentos que se sumergieron dentro de bolsas estériles con abrazadera para el tubo de descarga (figura 2B).

Las ondas de choque dos escogidas, a 50 kPa y sobrepresión máxima de 55 kPa, produjo significativos (p < 0,05 y p < 0.0001, respectivamente) y lesión reproducible en comparación con la farsa ileso rodajas en todos momentos después de la exposición de la ráfaga Protocolo (figura 2B) sin causar daños a los insertos de cultivo de tejidos o bolsas estériles. Para determinar la sensibilidad del modelo a pequeñas diferencias en el pico de sobrepresión, decidimos seleccionar valores diferentes en ~ 10%. Estos resultados también muestran que, como era de esperar, las lesiones resultantes de 55 kPa es mayor que después de una onda de choque de 50 kPa.

Los datos se expresan como media ± error estándar de la media. Significación se evaluó mediante una 2-forma de medidas repetidas análisis de varianza con prueba post hoc de Holm-Sidak. El factor 1 fue grupo (control, sham, ráfaga) y factor 2 fue tiempo después de la lesión (-1 h, 24 h, 48 h y 72 h), donde el factor 1 el factor repetido. El ajuste del valor de p para las comparaciones múltiples se utilizó. Se tomaron valores de P de menos de 0.05 para indicar una diferencia significativa entre los grupos. Se aplicaron pruebas estadísticas utilizando un paquete de software de gráficos y estadísticas.

Figura 1: esquema del dispositivo de tubo de choque con la estructura de soporte de bolsa estéril de. (A). el tubo de descarga es un tubo largo de acero inoxidable de 3,8 m, de tres tramos largo de 1.22 m, conectados por juntas y bridas, con un diámetro interno de 59 mm. recuadro (B) muestra la Asamblea de doble cerrojo. Uno o dos diafragmas de Mylar se pueden fijar en la Asamblea con el sello proporcionado por anillos o de goma. (C) estructura de soporte de bolsa estéril. El cuerpo de la estructura consiste en dos placas de metal con un agujero circular centrado (59 mm de diámetro) que se alinea con la salida del tubo de descarga. Disponen de dos hojas de fina (4 mm) de elastómero de silicona entre las dos placas de metal. El propósito de estas fichas es proporcionar una superficie uniforme y adherente para sujetar las bolsas estériles. La distancia entre la bolsa y la salida del tubo de descarga es de 7 cm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: shockwave típico y lesiones resultantes de hippocampal organotypic de la rebanada culturas. (A) ejemplo de ondas de choque obtenido usando 23 μm de espesor película de poliéster 2.16 bar presión de ruptura, 55 kPa sobrepresión de pico, duración de onda positiva de 0,4 ms, impulso de 10,1 kPa·ms. Se obtuvieron datos de forma de onda del sensor 2 montado radialmente en el reborde distal del tubo de choque impulsada por sección. La velocidad de la onda de choque fue 440 m/s (Mach 1.3). (B) el desarrollo de la lesión es proporcional a la intensidad de la onda de choque. 50 kPa y 55 kPa máxima sobrepresión ondas de choque habían causado lesión significativa que desarrolló a lo largo del Protocolo de 72 h en comparación con el grupo sham. La lesión resultante de una exposición de onda de sobrepresión 55 kPa pico fue significativamente superior después de 50 kPa a las 48 h y rebanadas de 72 h. simulacro fueron tratados idénticamente a rodajas blast pero tubo de choque no fue despedido. Rebanadas de control fueron mantenidos en 6 placas de pozos en una incubadora sin ninguna manipulación. Las barras representan valores medios y barras de error son errores estándar (n = 7, controles; n = 48, farsa; n = 30, blast 50 kPa; n = 51, blast 55 kPa; n = número de cortes, de 6 experimentos independientes). * p < 0.05, *p < 0.0001 comparado con el tratamiento simulado. # p < 0.05, #p < 0.01 comparado con blast 55 kPa. Imágenes de fluorescencia de yoduro (C) representante propidio organotypic rebanadas de farsa (), (ii) blast 50 kPa (iii) blast 55 kPa grupos y a las 72 h después de la lesión. El segmento de farsa muestra bajos niveles de fluorescencia, es decir., lesiones y la explosión láminas expuestas muestran altos niveles de lesión difusa, más marcada en el segmento de sobrepresión expuesto pico de 55 kPa (barra de escala = 500 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores tienen intereses financieros que compiten.