Artículo de método

Un modelo de novela In Vitro de lesión cerebral traumática por explosión

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DOI:

10.3791/58400

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21 de diciembre de 2018

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1Anaesthetics, Pain Medicine and Intensive Care Section, Department of Surgery and Cancer, Imperial College London, 2Royal British Legion Centre for Blast Injury Studies, Department of Bioengineering, Imperial College London, 3Department of Bioengineering, Imperial College London, 4Department of Life Sciences, Imperial College London, 5Department of Anaesthetics, Royal Berkshire Hospital NHS Foundation Trust, 6Royal Centre for Defence Medicine, Medical Directorate Joint Force Command

En este artículo

Resumen

Este papel describe un modelo novedoso de lesión de cerebro traumática de la explosión primaria. Un tubo de descarga por aire comprimido se utiliza para exponer en vitro ratón rebanada hippocampal culturas una sola onda de choque. Este es un protocolo simple y rápido de generar una lesión de tejido de cerebro reproducible con un alto rendimiento.

Resumen

Lesión cerebral traumática es una causa principal de muerte y discapacidad en poblaciones militares y civiles. Blast cerebral traumática lesión proviene de la detonación de artefactos explosivos, sin embargo, los mecanismos que subyacen a los daños cerebrales resultantes de la exposición de sobrepresión de la ráfaga no se entienden completamente y se creen que son únicas para este tipo de lesión cerebral. Modelos preclínicos son herramientas cruciales que contribuyen a entender mejor la lesión del cerebro inducida por la explosión. Se desarrolló un modelo TBI novela en vitro blast utilizando un tubo de descarga abierta para simular las olas de la vida real campo abierto explosión modeladas por la forma de onda de Friedlander. Culturas de rebanada hippocampal organotypic ratón C57BL/6N fueron expuestas a la sola ondas de choque y el desarrollo de lesiones se caracterizó hasta 72 h utilizando yoduro de propidio, un marcador fluorescente bien establecido de daño celular que solamente penetra en las células con comprometida de las membranas celulares. Fluorescencia de yoduro de propidio fue significativamente mayor en los sectores expuestos a una onda de explosión cuando se compara con rebanadas de simulacro durante toda la duración del protocolo. Lesión del tejido cerebral es muy reproducible y proporcional a la sobrepresión de pico de la onda de choque aplicada.

Introducción

Lesión cerebral traumática (TBI) por explosión es un tipo complejo de la lesión cerebral que resulta de la detonación de artefactos explosivos1,2. Blast TBI ha emergido como un importante problema de salud en los últimos 15 años con los conflictos militares recientes en Irak y Afganistán2,3. En general, se estima que entre el 4.4% y 22,8% de soldados que regresan de Irak y Afganistán han sufrido TBI suave, una gran proporción de ellos está relacionado con explosión, con una mayor tasa informó de la explosión TBI en las fuerzas de Estados Unidos en comparación con las fuerzas de UK4 ,5.

El uso de dispositivos explosivos improvisados ha sido responsable de la mayoría del trauma asociado de explosión, incluyendo ráfaga TBI, soportada por el fuerzas militares6. La detonación de una carga explosiva resulta en una muy rápida, pero transitoria, aumento de presión, que ocurre en milisegundos. La onda de sobrepresión resultante de una explosión de campo libre de la vida real es modelada por la función de Friedlander, con una subida repentina a la sobrepresión máxima seguida de un decaimiento exponencial7,8. La gama de fuerzas extremas y su curso rápido tiempo de respuesta en un evento de explosión generalmente no tienen experiencia en traumas de la explosión no1,9. La sobrepresión máxima, que es la presión máxima de la onda y la duración de la onda positiva se cree que son contribuidores importantes a la lesión cerebral de la ráfaga y éstos dependen de la carga explosiva y la distancia de la detonación de10, 11.

El trauma que los resultados de un soplo explosivo está clasificado como cuatro componentes discretos, denominados primario, secundario, terciario y cuaternario de la ráfaga lesión10,12,13,14. Cada uno de estos componentes se asocia con mecanismos específicos de lesiones. Lesión por explosión primaria resulta de la acción directa de la onda de sobrepresión en órganos y tejidos2,13. Resultados de lesión explosión secundaria del impacto de fragmentos del proyectiles, causando penetrantes y no penetrantes heridas2,15. Lesión por explosión terciaria ocurre cuando el cuerpo de la víctima es desplazado contra el suelo o los objetos y se asocia con las fuerzas de aceleración/deceleración1,10,13. Lesión por explosión cuaternario describe un grupo heterogéneo de lesiones directamente relacionados con la explosión no cubierta por la primera tres lesión mecanismos descritos12,13. Incluye (pero no se limita a) lesión termal, inhalación de humo, radiación, ondas electromagnéticas y efectos psicológicos adversos13,15. Mayoría TBI asociada a explosión da directamente en los primeros tres mecanismos de lesión, mientras que el cuaternarios mecanismos de lesión de ráfaga se asocian generalmente a lesión sistémica13. Los efectos de las fuerzas de aceleración/desaceleración (p. ej., lesión por latigazo), contundente y penetrante traumatismo craneoencefálico se han estudiado ampliamente en relación con otros tipos de TBI (p. ej., accidentes de vehículo de motor, caídas, heridas balísticas). Sin embargo, la onda de sobrepresión de la explosión primaria es exclusiva de lesión por explosión y sus efectos en el tejido cerebral son mucho menos bien entendidos16. Los mecanismos de lesión explosión primaria, asociados a una onda de sobrepresión, son las primeras de las fuerzas mecánicas para interactuar con el cerebro.

Numerosos modelos preclínicos de TBI se han desarrollado en las últimas décadas que han sido invaluables para entender blast TBI mecanismos de lesión y de la patofisiología e investigar potenciales nuevos tratamientos, que de otro modo sería imposibles hacerlo exclusivamente en la clínica entorno17,18,19. Aunque ningún modelo preclínico solo puede reproducir la complejidad del trauma de cerebro de explosión clínica, típicamente diversos modelos preclínicos de TBI replican aspectos distintos de TBI humana. La acción perjudicial de las fuerzas asociadas con una explosión de la explosión puede ser estudiada de forma aislada o en combinación en modelos TBI de explosión tanto in vitro e in vivo . Modelos in vitro tienen la ventaja de permitir un control estricto del ambiente experimental (tejido condiciones fisiológica y biomecánica de la lesión), lo que reduce la variabilidad biológica y mejora la reproducibilidad, que permita el estudio de específico molecular cascadas sin los factores de confusión presentes en animales modelos20. Nuestro objetivo fue desarrollar un modelo de vitro para investigar los efectos de la explosión primaria en tejido cerebral. El objetivo fue desarrollar un modelo con una onda de choque supersónica con un representante de la forma de onda de Friedlander de una explosión, campo libre como la producida por un artefacto explosivo improvisado (IED).

Protocolo

Los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron en cumplimiento de la ley de Reino Unido los animales (procedimientos científicos) de 1986 y han sido aprobados por el bienestar de los animales y ética de cuerpo del Imperial College de Londres. Cuidado de los animales fue en cumplimiento de las directrices institucionales del Imperial College de Londres.

1. hippocampal Organotypic rodaja preparación y cultura

Nota: Este protocolo permite la producción de rebanadas hippocampal organotypic según el método de interfaz descrito por Stoppini y colegas con modificaciones menores21,22,23. Idealmente, no más de tres animales sacrificados y disecados en una sesión para que cada paso se realiza con rapidez y evitar comprometer la calidad de las láminas. Utilizar técnica aséptica en todo.

  1. Los siguientes pasos se adopten antes de iniciar el protocolo de disección.
    1. Preparar y filtro esterilizar todas las soluciones de antemano con un filtro 0,22 de μm.
    2. Manten las soluciones a 4 º C durante el almacenamiento y a lo largo de la disección de cerebro y rebanada hippocampal preparación manteniendo los contenedores y placas de Petri en un disipador de calor de metal sentada en hielo húmedo en todo momento.
    3. Autoclave de todo el metal instrumentos, aros y pañuelos de papel.
    4. Asegurar todos los instrumentos y material que se utilizará para cada paso del protocolo están listos para su uso, establecidas de antemano y rociado con etanol al 70%. Asegúrese de que se les permite enfriar y secar.
  2. Eutanasia a un 5-7 días-viejo C57BL/6N ratón cachorro por dislocación cervical y brevemente Limpie la superficie de la piel entera con pañuelo de papel estéril empapado en etanol al 70%. Acariciar la piel seca y decapitar el cachorro con unas tijeras de Mayo.
  3. Cortar la piel del cuero cabelludo con tijeras de iris a lo largo de la línea media de la cabeza comenzando en la región occipital y terminando cerca del hocico y se retraen lateralmente.
  4. Inserte la punta de las tijeras de Vannas en el foramen magnum y hacer dos pequeños cortes laterales en el hueso a lo largo de los sinos transversales, luego cortar el cráneo a lo largo de la línea media hasta el bulbo olfatorio y hacer dos pequeños cortes perpendicular a la línea media en esta región.
  5. Con fino punto fórceps curvado, retraer las aletas del hueso lateralmente de la línea media, cuidadosamente Quite el cerebro con una pequeña espátula y transferirlo a un 90 mm silicona elastómero recubierto Petri que contenía "disección mediano.
    Nota: Medio de disección es que Gey equilibrada solución de sal (5 mg/mL de D-glucosa, solución antibiótico-antimicótico 1%, con 10.000 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 10 mg/mL y 25 μg/mL de anfotericina B).
  6. Quite el cerebelo y separar los hemisferios cerebrales a lo largo de la línea media usando una cuchilla de afeitar. Use una espátula para transferir los hemisferios cerebrales a una nuevo silicona 90 mm lleno de revestimiento de elastómero de Petri con medio fresco helado disección. Si más de un animal debe ser utilizado en una sola sesión, repita los pasos 1,2 – 1,6.
  7. Bajo un estereomicroscopio, el bulbo olfatorio y la punta de la corteza frontal con una hoja de afeitar y separe la corteza cerebral desde el resto del tejido cerebral con unas pinzas de punta fina. Este paso deja el hipocampo expuesto en la superficie medial del tejido cortical. De este paso adelante, uso de campana de flujo laminar cultivo de tejidos (ultravioleta esteriliza y limpia con solución de etanol al 70%).
  8. Aplique medio helada disección a un disco plano de plástico para picar y, usando una espátula, coloque el tejido cerebral en el disco tal que la superficie medial de la corteza es hacia arriba y el eje del hipocampo es perpendicular al eje de la cuchilla de picar.
  9. Eliminar lo más posible del medio de disección desde el disco para picar con una pipeta Pasteur de punta fina.
  10. Cortar el cerebro 400 μm con un picador de tejido a una velocidad de picado de 50% y la fuerza.
    Nota: Es muy importante que este paso se realiza tan rápido como sea posible como el tejido cerebral no está sumergido en medio de la disección.
  11. Reemplazar el medio de la disección en el revestimiento de elastómero de silicona de Petri con medio fresco helado.
  12. Una vez finalizado el picador de tejido, cuidadosamente sumerja el tejido cerebral en medio de la disección fresco y transferir el tejido cortado a los 90 mm silicona recubierto de elastómero de Petri utilizando un bisturí de hoja recta.
  13. Bajo un estereomicroscopio, separar cuidadosamente las rebanadas corticales con unas pinzas de punta fina. Para cada rebanada, inspeccione el hipocampo para morfología y potencial daño a los tejidos como resultado de la disección o corte.
  14. Separar los hipocampos de la corteza entorrinal y la fimbria utilizando pinzas de punta fina y pequeñas tijeras de Vannas. Por lo general, se generan alrededor de 6 a 8 rebanadas hippocampal por hemisferio.
  15. Transferencia de hasta 6 rebanadas hippocampal a un inserto de cultivo de tejidos mediante un corte pipeta Pasteur y lugar adentro un 35 mm Petri dish. Asegúrese de que las láminas se separan aparte unos milímetros (Esto asegurará que cada rodaja puede ser reflejada individualmente).
  16. Inmediatamente agregar helado "medio de cultivo" para la parte inferior de cada placa de Petri, debajo de la estufa de cultivo de tejidos, justo debajo de la parte superior de la cultura de tejido inserta borde.
    Nota: Medio de cultivo contiene medio esencial mínimo de 50% águila, 25% Hanks equilibrada solución de sal, 25% de suero de caballo, 5 mg/mL D-glucose, 2 mmol/L-glutamina, solución antibiótico-antimicótico 1% y 10 mmol/L HEPES, graduado pH a 7.2 con hidróxido de sodio.
  17. Cambiar el medio de crecimiento el día después de la disección y luego cada 2 a 3 días después de eso (uso medio de cultivo a 37 ° C). Asegúrese de que el medio de crecimiento se agrega en cantidad suficiente, pero no tanto que se desborda sobre la membrana de inserto de cultivo de tejidos, que puede comprometer la viabilidad de las rebanadas de tejido.
  18. Mantener los cortes de tejido en una incubadora humidificada a 37 ° C con 5% de dióxido de carbono en el aire durante 12 a 14 días antes de ser utilizados en experimentos.

2. preparación de las rebanadas Hippocampal Organotypic para el protocolo de TCE de explosión Experimental

Nota: Todos los pasos de esta sección, excepto la proyección de imagen, llevará a cabo en una campana de flujo laminar cultivo de tejidos.

  1. Inserte los anillos de acero inoxidable a medida en una placa bien 6 (uno por pozo).
    Notas: Los anillos tienen un borde con una muesca (que debe sentarse en la posición 12:00) y ajuste perfectamente dentro de los pozos, mientras que inserta el cultivo de tejidos se adaptan fácilmente a este borde. Asegúrese de que los anillos son lavados con un desinfectante bactericido, bien enjuagados con agua purificada, esterilizada y dejar enfriar previamente.
  2. Llene el pocillo de la placa de la pozo de 6 con precalentado (37 ° C) sin suero "medio experimental" con yoduro de propidio.
    Nota: El medio Experimental con yoduro de propidio es: medio esencial mínimo de 75% águila, 25% Hanks equilibrada solución de sal, 5 mg/mL D-glucose, 2 mmol/L L-glutamina, 1% solución antibiótico-antimicótico, 10 mmol/L HEPES y yoduro de propidio 4.5 μmol/L, pH valorada a 7.2 con hidróxido de sodio.
  3. Asegúrese de que el nivel del medio no se alcanza por encima de la muesca del anillo. Transferir la placa de la pozo de 6 con los anillos a la incubadora durante 1 h para que el medio esté a 37 ° C inmediatamente antes de transfieran los insertos de cultivo de tejidos.
  4. Transferir los insertos de cultivo de tejidos con las rebanadas de organotypic de los platos de Petri de 35 mm en la placa de la pozo de 6 con los anillos y el medio experimental con fórceps.
  5. Hacer un punto en el borde de inserción en la posición 3:00 con un rotulador permanente.
    Nota: Los insertos se van a quitar de la placa de 6 pozos durante el experimento y este paso facilita regresar la inserción a su posición original después de la exposición de ondas de choque y fácilmente hacer un seguimiento de cada rebanada en el protocolo.
  6. Cada placa de 6 pozos con un nombre único y fecha de la etiqueta y hacer un mapa de los pozos de cada placa, nombrando cada pozo (e.g., A, B, C, etcetera.) y cada rodaja en cada pozo (e.g., 1, 2, 3, etcetera.), de modo que cada segmento tiene un identificador único ( por ejemplo., A1, A2, A3, etcetera.).
  7. Transferir la placa de 6 pozos a la incubadora durante 1 h para las rebanadas a 37 ° C inmediatamente antes de la proyección de imagen.
    Nota: Evitar el desbordamiento del medio o cualquier burbuja de aire debajo de la cultura de tejido Inserte membrana, que puede comprometer la viabilidad de las rodajas.
  8. 1 h después de la transferencia al medio experimental, imagen cada rebanada individualmente usando un microscopio de fluorescencia (objetivo de 2 X, NA 0.06) provisto de una adecuada excitación (BP 535/50 nm) y filtro de la emisión (LP 610 nm) para evaluar la salud del segmento antes de la lesión Protocolo se lleva a cabo.
    Notas: Los sectores que presentan áreas de denso rojo coloración en esta etapa se deben considerar presentar viabilidad comprometida y deben excluirse del análisis (estos por lo general representan menos del 10% del número total de segmentos generados). Asegúrese de que la proyección de imagen se realiza de manera secuencial y tan rápidamente como sea posible para reducir al mínimo el tiempo que las rebanadas están fuera de la incubadora (típicamente 6 pozos deben tomar menos 30min a imagen).
  9. Mantenga la tapa de la placa de 6 pozos en todo el tiempo. Condensación puede acumularse en el interior de la tapa. Si esto sucede, brevemente use un secador en la posición low.
  10. Asegúrese de que todas las condiciones de proyección de imagen son idénticas en diferentes días y entre los experimentos.
    Nota: El objetivo de la proyección de imagen cuantificar la fluorescencia de tejidos, por lo tanto, este paso es importante para asegurar la reproducibilidad de los resultados y permite la comparación de los datos obtenidos.

3. inmersión y transporte de la cultura del tejido se inserta con las rebanadas Hippocampal Organotypic

  1. Inmediatamente después de la proyección de imagen, en una campana de flujo laminar, tomar un cultivo de tejidos parte movible de la placa de la pozo de 6 con unas pinzas.
  2. Cuidadosamente transfiera el inserto a una bolsa de polietileno estéril (3 x 5 pulg.) previamente lleno con 20 mL de medio experimental caliente (37 ° C) recién burbujas con 95% de oxígeno y 5% dióxido de carbono.
    Nota: Asegúrese de que el medio experimental enriquecido oxígeno y dióxido de carbono fue burbujeado durante por lo menos 40 min 95% oxígeno y 5% dióxido de carbono usando un grifo de scintered de vidrio dentro de una botella de Dreschel y transferido en las bolsas de polietileno estéril dentro de un cultivo de tejido campana de flujo laminar con un filtro bacteriano y un tubo de llenado estéril (127 mm) conectado a una jeringa de 20 mL. Sellar las bolsas inmediatamente y transferirlos a una incubadora de 37 ° C durante al menos 1 h antes de la cultura tejido Inserte a transferencia.
  3. Asegúrese de que cada bolsa estéril está marcado correctamente (con la placa y la identificación del bien). Repita este paso para cada inserción de cultivo de tejidos. Excluir las burbujas de aire cuidadosamente al sellado de las bolsas estériles (hechas firmemente girando la parte superior de las bolsas y aplicando una abrazadera de plástico).
  4. Retorno las bolsas estériles con los insertos de cultivo de tejidos y las placas de 6 pozos con medio experimental dentro de la incubadora de 37 ° C.
  5. Después de 1 h, paquete cuidadosamente las bolsas estériles con los insertos de cultivo de tejidos en cajas de plástico dentro de una caja termo-regulada, llenado con agua desionizada a 37 º C para mantener las rebanadas organotypic a temperatura fisiológica a lo largo de la exposición de ondas de choque Protocolo.

4. preparación del tubo de descarga y exposición de ondas de choque de Hippocampal Organotypic rebanada

  1. Use botas de punta de acero de Protecto, una capa de laboratorio y guantes durante la preparación del tubo de choque y la exposición de ondas de choque.
  2. Perno de la estructura de soporte de la bolsa estéril para el reborde distal de tubo choque, asegurando que el agujero central está alineado con la salida del tubo de choque (con una varilla esconde).
  3. Montar dos transductores de presión radialmente: sensor 1, en la parte media de la sección conducida y sensor 2 en el reborde distal del tubo de descarga (figura 1A). Conecte los transductores de presión a un osciloscopio a través de una unidad de energía de fuente actual.
  4. Asegúrese de que todos los controles de flujo y válvulas de liberación de tubo de descarga estén cerrados.
  5. Abra la línea de aire comprimido exterior y carga de la válvula de solenoide a 2,5 bar.
  6. Abra la válvula de seguridad del cilindro de aire comprimido y abra lentamente el regulador de presión para aumentar la presión de 5 bar.
    Nota: La presión de este regulador debe estar ligeramente por encima del diafragma alta presión de ruptura.
  7. Preparar los diafragmas sábanas poliéster de 23 μm de espesor cortar en cuadrados de 10 x 10 cm2 . Preparar las manijas con cinta de autoclave y pegarse a la parte superior e inferior de cada diafragma.
  8. Colocar un diafragma (única ranura de la recámara doble - configuración de diafragma simple) o dos diafragmas (dos ranuras de la recámara doble - configuración de doble diafragma) en la recámara (figura 1B).
  9. Centro de los diafragmas y sujetarlos usando cuatro pernos M24 y tuercas les fijación secuencialmente en forma diagonal simétrica y asegurándose de que los diafragmas son libre de arrugas.
  10. Cada bolsa estéril en posición vertical sobre la estructura soporte de la abrazadera, asegurando que la superficie de la cultura del tejido se inserta con las rebanadas hippocampal organotypic se enfrenta a la salida del tubo de descarga y la estufa de cultivo de tejidos se centra en el estéril bolsa (figura 1). Asegúrese de que la bolsa estéril quede firmemente asegurada todo para inmovilización firme y uniforme.
  11. Usar orejeras y gafas de seguridad al presionar el tubo de descarga. Encienda la actual fuente de alimentación y osciloscopio para adquirir los datos de la onda expansiva (tasa de adquisición de 50 mega-muestras/s, récord de longitud 20 ms, 1 millón de puntos) y cerrar la válvula solenoide.
  12. Usando la perilla de control de flujo en el panel de control de tubo de choque, presurice lentamente la sección controlador de volumen del tubo de descarga para la configuración de diafragma único o la sección de volumen del conductor y la sección podálica doble del tubo de descarga de doble diafragma configuración.
    Nota: Para la configuración de simple diafragma, la presión de ruptura dependerá sólo del material del diafragma y grueso y el diafragma se rompen espontáneamente una vez alcanzado el presión de ruptura de material. Para la configuración de doble diafragma, las presiones de trabajo dependerá de la presión de gas diferencial en el controlador y las cámaras de doble cerrojo y de los diafragmas a punto de estallar de forma controlada, se abre la válvula de seguridad de doble cerrojo manualmente una vez se alcanzan las presiones de destino.
  13. Tan pronto como el diafragma de las rupturas (produciendo un ruido), rápidamente cierra el flujo de aire comprimido utilizando la perilla de flujo y abra la válvula de solenoide.
    Nota: El volumen total de la sección de controlador puede ser modificado por la inserción de segmentos, permitiendo una gama más amplia de sobrepresión de pico de la onda expansiva y duraciones que se obtendrá de esconder. La combinación ideal de los parámetros de la onda de choque debería ser suficiente para causar lesiones de tejido pero no tan alto lo hace inserción del cultivo de tejidos o bolsa estéril distorsión o ruptura.
  14. Exponer cada bolsa estéril con una inserción de cultivo de tejidos para una onda de tubo de choque solo y volver inmediatamente a la caja termo-regulado antes de una nueva bolsa estéril se toma de la caja y afianzado con abrazadera en el bastidor de soporte. Asegúrese de que pasos 4.10-4.14 se realizan suavemente y rápidamente como sea posible (dentro de unos minutos) para evitar el enfriamiento medio experimental, como temperaturas por debajo de 37 ° C pueden interferir con el desarrollo de lesiones.
  15. Una vez que todos los insertos de cultivo de tejidos han estado expuestos a una onda de choque (o protocolo de sham), volver las inserciones de cultivo de tejidos para la original placa de 6 pozos y sus respectivos bien (dentro de una campana de flujo laminar cultivo de tejidos) y vuelva a la incubadora.
  16. Mantenga la placa de 6 pozos en la incubadora con 5% de dióxido de carbono en el aire a 37 ° C hasta más de imagen.
  17. Incluyen controles de farsa para cada experimento, junto con la exposición de ondas de choque de la rebanada.
    Nota: Rebanadas de farsa se tratan idénticamente a los sectores expuestos a una onda de choque (sellado en bolsas estériles con medio experimental, transportadas al laboratorio de tubo de descarga en la misma caja termo-regulado y suspendido en el marco del metal por un período equivalente de tiempo) pero el choque no se enciende el tubo.

5. cuantificación de lesiones hippocampal Organotypic rebanada

  1. En 24 h, 48 h y 72 h, las rebanadas de la imagen como se describe en pasos 2.8 y 2.9.
  2. Después de la proyección de imagen en la exposición de ondas de choque de 72 h post, deseche el tejido biológico local siguiente protocolos de residuos y desinfectar autoclave el metal anillos.

Resultados

El tubo de choque utilizado en este método permite la generación de oscilaciones de sobrepresión que simulan explosiones reales espacio modeladas por la función de Friedlander7,8. Ondas de choque supersónicos con una velocidad de 440 m/s (Mach 1.3) se obtienen (figura 2A). Los datos de forma de onda registrados están de sensor 2, situado radialmente al final de la sección por el tubo de descarga.

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, las culturas de rebanada hippocampal organotypic expuestas a una sola onda de choque (figura 2A) desarrollan lesión significativa cuantificado utilizando yoduro de propidio, un colorante fluorescente altamente polar que penetra sólo las células con comprometida de las membranas celulares24,25 (figura 2B, C).

Incluso en condiciones óptimas y consistentes a otros OHSC publican modelos21,22, hay un bajo nivel de fluorescencia de yoduro de propidio fondo debido, en parte, menores daños causados por el () las manipulaciones inherentes del tejido como los cambios en los medios de comunicación durante el período de cultivo o extracción de la incubadora para la proyección de imagen). Este protocolo de TCE de explosión implica manipulación sustancial que incluye la inmersión de las rodajas en medio de bolsas estériles y un grado considerable de manipulación durante el protocolo de exposición de ondas de choque (e.g., sujeción de las bolsas estériles para la estructura de soporte). Sin embargo, si todos los pasos se realizan con cuidado, esta manipulación adicional no tiene un impacto en la salud subyacente de la OHSC como no observaron diferencias significativas entre un grupo control de rebanadas de mantenerse en las placas de 6 pozos en todo momento (es decir., los insertos no fueron sumergidos o manipulados) y el grupo sham, que incluye segmentos que se sumergieron dentro de bolsas estériles con abrazadera para el tubo de descarga (figura 2B).

Las ondas de choque dos escogidas, a 50 kPa y sobrepresión máxima de 55 kPa, produjo significativos (p < 0,05 y p < 0.0001, respectivamente) y lesión reproducible en comparación con la farsa ileso rodajas en todos momentos después de la exposición de la ráfaga Protocolo (figura 2B) sin causar daños a los insertos de cultivo de tejidos o bolsas estériles. Para determinar la sensibilidad del modelo a pequeñas diferencias en el pico de sobrepresión, decidimos seleccionar valores diferentes en ~ 10%. Estos resultados también muestran que, como era de esperar, las lesiones resultantes de 55 kPa es mayor que después de una onda de choque de 50 kPa.

Los datos se expresan como media ± error estándar de la media. Significación se evaluó mediante una 2-forma de medidas repetidas análisis de varianza con prueba post hoc de Holm-Sidak. El factor 1 fue grupo (control, sham, ráfaga) y factor 2 fue tiempo después de la lesión (-1 h, 24 h, 48 h y 72 h), donde el factor 1 el factor repetido. El ajuste del valor de p para las comparaciones múltiples se utilizó. Se tomaron valores de P de menos de 0.05 para indicar una diferencia significativa entre los grupos. Se aplicaron pruebas estadísticas utilizando un paquete de software de gráficos y estadísticas.

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Figura 1: esquema del dispositivo de tubo de choque con la estructura de soporte de bolsa estéril de. (A). el tubo de descarga es un tubo largo de acero inoxidable de 3,8 m, de tres tramos largo de 1.22 m, conectados por juntas y bridas, con un diámetro interno de 59 mm. recuadro (B) muestra la Asamblea de doble cerrojo. Uno o dos diafragmas de Mylar se pueden fijar en la Asamblea con el sello proporcionado por anillos o de goma. (C) estructura de soporte de bolsa estéril. El cuerpo de la estructura consiste en dos placas de metal con un agujero circular centrado (59 mm de diámetro) que se alinea con la salida del tubo de descarga. Disponen de dos hojas de fina (4 mm) de elastómero de silicona entre las dos placas de metal. El propósito de estas fichas es proporcionar una superficie uniforme y adherente para sujetar las bolsas estériles. La distancia entre la bolsa y la salida del tubo de descarga es de 7 cm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: shockwave típico y lesiones resultantes de hippocampal organotypic de la rebanada culturas. (A) ejemplo de ondas de choque obtenido usando 23 μm de espesor película de poliéster 2.16 bar presión de ruptura, 55 kPa sobrepresión de pico, duración de onda positiva de 0,4 ms, impulso de 10,1 kPa·ms. Se obtuvieron datos de forma de onda del sensor 2 montado radialmente en el reborde distal del tubo de choque impulsada por sección. La velocidad de la onda de choque fue 440 m/s (Mach 1.3). (B) el desarrollo de la lesión es proporcional a la intensidad de la onda de choque. 50 kPa y 55 kPa máxima sobrepresión ondas de choque habían causado lesión significativa que desarrolló a lo largo del Protocolo de 72 h en comparación con el grupo sham. La lesión resultante de una exposición de onda de sobrepresión 55 kPa pico fue significativamente superior después de 50 kPa a las 48 h y rebanadas de 72 h. simulacro fueron tratados idénticamente a rodajas blast pero tubo de choque no fue despedido. Rebanadas de control fueron mantenidos en 6 placas de pozos en una incubadora sin ninguna manipulación. Las barras representan valores medios y barras de error son errores estándar (n = 7, controles; n = 48, farsa; n = 30, blast 50 kPa; n = 51, blast 55 kPa; n = número de cortes, de 6 experimentos independientes). * p < 0.05, *p < 0.0001 comparado con el tratamiento simulado. # p < 0.05, #p < 0.01 comparado con blast 55 kPa. Imágenes de fluorescencia de yoduro (C) representante propidio organotypic rebanadas de farsa (), (ii) blast 50 kPa (iii) blast 55 kPa grupos y a las 72 h después de la lesión. El segmento de farsa muestra bajos niveles de fluorescencia, es decir., lesiones y la explosión láminas expuestas muestran altos niveles de lesión difusa, más marcada en el segmento de sobrepresión expuesto pico de 55 kPa (barra de escala = 500 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Entre todos los mecanismos de lesión asociada con explosión de TBI (mecanismos de lesión la explosión primaria, secundaria y terciaria), principal lesión por explosión es único al trauma de la ráfaga y es el menos entendían de los mecanismos asociados de ráfaga1,2 . El nuevo protocolo descrito aquí fue desarrollado para estudiar la explosión primaria TBI utiliza un tubo de descarga abierta para exponer en vitro ratón rebanada hippocampal culturas una sola onda de choque mediante un protocolo sencillo y rápido que permite la creación de un reproducible explosión principal TBI con un alto rendimiento.

Los primeros en vitro blast primaria TBI modelos aplican ondas de la presión hidrostática a células26,27. Sin embargo, la salida de presión no modelo la función de Friedlander, la duración de un pulso de presión hidrostática fue mucho más larga que la de ondas de sobrepresión blast aéreo13. La característica función de Friedlander se puede modelar fácilmente en el laboratorio utilizando un tubo de descarga1,8. El tubo de descarga puede producir ondas de choque que simulan explosiones de campo abierto de la vida real en un entorno de laboratorio convencional, permitiendo un control preciso de los parámetros de la onda, como la sobrepresión máxima, duración de la onda positiva y el impulso, variando la material del diafragma y grueso y el conductor volumen8,28,29.

Simple en vitro modelos como cultivos celulares suelen carecen de la heterogeneidad de tipos de la célula y de la conectividad sináptica30. Recientemente, el efecto de la explosión en vitro de la célula de cerebro 'esferoides' incorporando diferentes tipos de células ha sido investigado31. Se merecía una investigación adicional de estas preparaciones interesantes; sin embargo, no está claro cómo su organización celular y conectividad refleja el cerebro intacto. OHSC son un bien establecido en vitro modelo experimental23,32, son fáciles de la cultura y su Citoarquitectura del tejido tridimensional, diferenciación celular y conectividad sináptica están bien conservados y muy similar a ese en vivo33,34,35,36. OHSCs representan un nivel intermedio de complejidad entre la cultura de célula y un en vivo modelo23,32. OHSCs se han demostrado para reproducir in vitro patológicos neurodegenerativos cascadas en modelos en vivo y han sido muy útiles en la investigación de fármacos neuroprotectores potenciales y en la comprensión de sus mecanismos de acción17,21,22,37,38. Finalmente, el área anatómica estudiada, el hipocampo, es altamente relevante en los estudios TBI traslacionales, ya que esta región se daña con frecuencia en pacientes TBI39,40,41. OHSC han utilizado a la explosión del modelo TBI28,42,43,44, sin embargo, nuestro modelo es relativamente simple y puede ser adaptado a los tubos de descarga existentes ya sea horizontal o vertical configuraciones sin adaptaciones complejas.

OHSC puede conservarse en la cultura para muchos días, que facilita la investigación de los procesos biológicos sobre tiempo34. En este modelo, la lesión tisular resultante de la exposición de ondas de choque se midió diariamente durante tres días, después de la exposición de la ráfaga con yoduro de propidio, un marcador bien establecido del daño celular. Yoduro de propidio es un tinte no tóxico altamente polar que penetra en las células con las membranas celulares comprometidas, donde se une a los ácidos nucleicos y exhibe una característica fluorescencia roja brillante24,25,45. La fluorescencia medida con yoduro de propidio ha demostrado tener una buena correlación con el recuento de célula lesionada con46,47de tinción de Nissl.

Dado que la lesión producida en este modelo se difusa (figura 2), la fluorescencia de la rodaja entera se midió al realizar el análisis, similar a trabajos previamente publicados en otro cerebro lesiones paradigmas21,22 , en lugar de utilizar regiones específicas, como se ha hecho en otros en vitro blast TBI modelos28,43,44,48. El enfoque utilizado en el modelo descrito en este artículo también elimina la variabilidad potencial que se presenta cuando exponiendo regiones de interés definidas y proporciona una imagen más completa de las lesiones relacionadas con la explosión. Sobrepresiones de pico de la onda expansiva, el kPa 50 y 55 kPa, producir significativa (p < 0,05 y p < 0.0001, respectivamente) lesiones en comparación con rebanadas de sham (figura 2B). Como se anticipó, la onda de choque con la más alta sobrepresión máxima, kPa 55, producido más daños que la onda de 50 kPa. En un modelo en vitro con cerebro aislado el tejido directamente expuestos a una onda de choque, cómo escalar con precisión a todo el organismo o un ser humano no es sencillo. Sin embargo, las ondas de choque que están dentro de la gama de la sobrepresión máxima observados en el campo, normalmente 50 – 1.000 kPa8,49.

Con el fin de mantener la OHSC expuesto a la temperatura fisiológica y niveles de oxígeno y dióxido de carbono, asegurando que estaban libres de contaminación a través del Protocolo de exposición de ondas de choque, los insertos de cultivo de tejidos fueron sellados en estéril bolsas de polietileno, siguiendo una técnica aséptica, sumergida en medio experimental calentado a 37 ° C y recién burbujas con 95% oxígeno y 5% dióxido de carbono, igual que trabajo anteriormente publicado28,43,44 ,48. Contrario a estos modelos donde los dispositivos complejos fueron utilizados para sostener las bolsas estériles durante la exposición de ondas de choque, en el presente Protocolo, un método simple y rápido se utilizó para suspender los insertos de cultivo de tejidos OHSC delante de la salida del tubo de descarga (figura 1A, C ). El modelo descrito en este documento permite el procesamiento rápido y alto rendimiento, minimizando el riesgo de hipotermia. Estos aspectos son especialmente relevantes para los estudios de neuroprotección dado que algunas intervenciones terapéuticas pueden tener una ventana de tiempo muy limitado de aplicación potencial después de TBI. Este protocolo de exposición de la novela de la onda expansiva permite 6 a 9 cultivo de tejidos inserta (generalmente de 36 a 54 hippocampal organotypic rebanadas de tejido) para ser expuesto a una onda de choque en un intervalo corto de tiempo (aproximadamente 1 hora).

Los OHSCs requieren buena técnica aséptica en todo. Es importante utilizar una campana de flujo laminar aséptica durante todo el cultivo y cuando se transfiere a las bolsas estériles para la explosión. Para llevar a cabo la proyección de imagen de segmento bajo condiciones asépticas con las tapas de las placas de 6 pozos en el lugar, usamos anillos metálicos a la medida para elevar los insertos de cultura de célula para el plano focal del microscopio. Una parte importante de nuestro protocolo es que incluyamos lonchas sham ileso en todos los experimentos. Rebanadas de farsa tratan idénticamente a rebanadas de explosión con la excepción de que no se enciende el tubo de descarga; otro paso importante es que todos los sectores son imagen 1 h antes de la lesión o el tratamiento simulado, para garantizar que la salud de la población de sectores utilizados son idénticos (figura 2B).

Además de cuantificar la lesión de la célula en las rebanadas con el tiempo, el tejido puede ser fijo al final del experimento para inmunohistoquímica convencionales50. Desarrollamos y evaluamos el método utilizando rebanadas de hipocampo de ratón. Sin embargo, nuestra técnica podría ser fácilmente adaptado a utilizar otros tejidos que pueden cultivarse en la cultura, como la médula espinal, retina, pulmón o tejido epitelial. En este trabajo y nuestro trabajo anterior con el modelo, hemos investigado sólo el efecto de la exposición de una sola explosión. Sin embargo, el modelo sería idóneo para investigar los efectos de repetidas explosiones de bajo nivel en el cerebro u otro tejido. OHSCs se pueden mantener en cultivo durante muchas semanas o incluso meses, permitiendo efectos crónicos a investigarse.

Los modelos in vitro , siendo más simples que los modelos en vivo , tienen un rendimiento más alto, son menos costoso y experimentos pueden completarse generalmente en un corto tiempo escala17. Sin embargo, los resultados obtenidos en vitro modelos deben ser validadas en modelos animales como en vitro cultivados los tejidos se mantienen en un ambiente artificial y pueden responder a lesiones diferentemente de lo que lo harían en vivo17. No obstante, en vitro modelos han sido extremadamente valiosos para aumentar nuestra comprensión del cerebro lesiones cascadas y en investigación de drogas neuroprotective antes del uso de la más compleja en vivo modelos17,22 , 51 , 52. a pesar de las numerosas ventajas ofrecieron por este modelo, es importante tener en cuenta que en vitro modelos carecen de la clave características de TBI presentan en animales y en modelos en vivo , como los efectos sobre el sistema vascular, aumento intracraneal presión, respuesta inmune sistémica y deterioro funcional de la conducta, que pone de relieve la necesidad de validar los resultados encontrados en modelos en vitro en el animal entero. Sin embargo, en vitro modelos como el modelo descrito en este artículo son muy útiles herramientas científicas forma relevantes.

En conclusión, este trabajo describe un método novedoso y sencillo donde exponen tejido hippocampal organotypic de las culturas de ratón a firmemente controladas y reproducibles reales correspondientes ondas de choque mediante un tubo de descarga de laboratorio. La lesión global resultante, que se cuantificó utilizando yoduro de propidio, un marcador bien establecido del daño celular, es muy reproducible y es proporcional a la sobrepresión máxima de las ondas de choque aplicadas.

Divulgaciones

Los autores tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

Apoyado por: centro real de medicina de la defensa, Birmingham, Reino Unido, centro Legión británica real explosión lesiones estudios, Imperial College de Londres, Reino Unido. Consejo de investigación médica, Londres, Reino Unido (MC_PC_13064; MR/N027736/1). La seguridad de Gas Trust, Londres, Reino Unido. Rita Campos-Pires recibió un premio de formación doctoral de la Fundação para a Ciência e a Tecnologia, Lisboa, Portugal. Katie Harris recibió una beca de doctorado de la Westminster Medical School Research Trust, Londres, Reino Unido.

Este modelo fue desarrollado con el apoyo de la Legión británica real para estudios de lesión Blast (RBLCBIS) en el Imperial College. Nos gustaría reconocer el apoyo financiero de la Legión británica real. Los investigadores interesados en colaboraciones o detalle adicional pueden comunicarse con los autores o RBLCBIS.

Agradecemos Dr. Amarjit Samra, Director de investigación, centro de la real defensa medicina, Birmingham, Reino Unido, para apoyar este trabajo, Scott Armstrong, Departamento de cirugía y cáncer, Imperial College de Londres, para obtener ayuda con experimentos preliminares , Theofano Eftaxiopolou, Hari Arora y Luz Ngoc Nguyen, Departamento de Bioingeniería Imperial College de Londres y William Proud, Departamento de física de Imperial College de Londres, para asesoramiento sobre el tubo de descarga, Raquel Yustos, técnico, Departamento de investigación de Ciencias de la vida, Imperial College London, para encargado de taller de apoyo técnico, Paul Brown MBE y Steve Nelson, técnico del taller, Departamento de física del Imperial College de Londres, para hacer el metal anillos, Neal Powell del Departamento de física, Imperial College London, para obra de arte.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución salina equilibrada GeysSigma UKG9779
D-glucosaSigma UKG8270
Antibiótico/antimicóticoSigma UKA5955
Medio esencial mínimo EagleSigma UKM4655
Hanks solución salina equilibradaSigma UKH9269
Suero de caballoSigma UKH1138
L-glutaminaSigma UKG7513
HEPESVWR Prolabo, Bélgica441476L
Hidróxido de sodioSigma UKS-0945
Insertos para cultivo de tejidosMillicell CM 30 mm de baja altura MilliporePICM ORG 50
placas de 6 pocillosNUNC, Dinamarca140675
Yoduro de propidioSigma UKP4864
Bolsas estériles de polietileno - Twirl'em Bolsas de muestras estérilesFisherbrand01-002-30
Portex Avon Kwill Tubo de llenado 5" (127 mm)Smiths Medical SuppliesE910
Microscopio de epifluorescenciaNIKON Eclipse 80i, Reino Unido
Objetivo de microscopioNikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm
Filtro de microscopioNikon G-2B (emisión de paso largo)
Película aislante eléctrica de Mylar, 304 mm x 200 mm x 0,023 mmRS Components UK785-0782
Transductor de presiónDytran Instruments Inc.2300V1
Picadora de tejidosMickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, Reino Unido.de tejidos Mcllwain
Elastómero de siliconaDow Corning, Estados UnidosSylgard 184
Software de gráficos y estadísticasGraphPad Software, Estados UnidosPrisma 7.0
Picadora

Referencias

  1. Risling, M., Davidsson, J. Experimental animal models for studies on the mechanisms of blast-induced neurotrauma. Frontiers in Neurology. 3, 30(2012).
  2. Nakagawa, A., et al. Mechanisms of primary blast-induced traumatic brain injury: insights from shock-wave research. Journal of Neurotrauma. 28 (6), 1101-1119 (2011).
  3. Goldstein, L. E., McKee, A. C., Stanton, P. K. Considerations for animal models of blast-related traumatic brain injury and chronic traumatic encephalopathy. Alzheimer's Research & Therapy. 6 (5), 64(2014).
  4. Rona, R. J., et al. Mild traumatic brain injury in UK military personnel returning from Afghanistan and Iraq: cohort and cross-sectional analyses. Journal of Head Trauma and Rehabilitation. 27 (1), 33-44 (2012).
  5. Terrio, H., et al. Traumatic brain injury screening: preliminary findings in a US Army Brigade Combat Team. Journal of Head Trauma and Rehabilitation. 24 (1), 14-23 (2009).
  6. Elder, G. A., Stone, J. R., Ahlers, S. T. Effects of low-level blast exposure on the nervous system: is there really a controversy. Frontiers in Neurology. 5, 269(2014).
  7. Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. Explosive blast neurotrauma. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 815-825 (2009).
  8. Bass, C. R., et al. Brain injuries from blast. Annals of Biomedical Engineering. 40 (1), 185-202 (2012).
  9. Young, L. A., Rule, G. T., Bocchieri, R. T., Burns, J. M. Biophysical mechanisms of traumatic brain injuries. Seminars in Neurology. 35 (1), 5-11 (2015).
  10. Wolf, S. J., Bebarta, V. S., Bonnett, C. J., Pons, P. T., Cantrill, S. V. Blast injuries. Lancet. 374 (9687), 405-415 (2009).
  11. Kluger, Y., Nimrod, A., Biderman, P., Mayo, A., Sorkin, P. The quinary pattern of blast injury. American Journal of Disaster Medicine. 2 (1), 21-25 (2007).
  12. Champion, H. R., Holcomb, J. B., Young, L. A. Injuries from explosions: physics, biophysics, pathology, and required research focus. Journal of Trauma: Injury, Infection, and Critical. 66 (5), 1468-1477 (2009).
  13. Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. In-vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).
  14. Edwards, D. S., Clasper, J. Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. Bull, A. M. J., Clasper, J., Mahoney, P. F. , Springer International Publishing. 87-104 (2016).
  15. Kirkman, E., Watts, S., Cooper, G. Blast injury research models. Philosophical Translations of the Royal Society B: Biological Sciences. 366 (1562), 144-159 (2011).
  16. Hicks, R. R., Fertig, S. J., Desrocher, R. E., Koroshetz, W. J., Pancrazio, J. J. Neurological effects of blast injury. J Trauma. 68 (5), 1257-1263 (2010).
  17. Morrison, B., Elkin, B. S. 3rd, Dolle, J. P., Yarmush, M. L. In vitro models of traumatic brain injury. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 13, 91-126 (2011).
  18. Johnson, V. E., Meaney, D. F., Cullen, D. K., Smith, D. H. Animal models of traumatic brain injury. Handbook of Clinical Neurology. , 115-128 (2015).
  19. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 128-142 (2013).
  20. Morganti-Kossmann, M. C., Yan, E., Bye, N. Animal models of traumatic brain injury: is there an optimal model to reproduce human brain injury in the laboratory? Injury. 41, Suppl 1. S10-S13 (2010).
  21. Banks, P., Franks, N. P., Dickinson, R. Competitive inhibition at the glycine site of the N-methyl-D-aspartate receptor mediates xenon neuroprotection against hypoxia-ischemia. Anesthesiology. 112 (3), 614-622 (2010).
  22. Harris, K., et al. Neuroprotection against traumatic brain injury by xenon, but not argon, is mediated by inhibition at the N-methyl-D-aspartate receptor glycine site. Anesthesiology. 119 (5), 1137-1148 (2013).
  23. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  24. Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Research Protocols. 3 (3), 278-290 (1999).
  25. Macklis, J. D., Madison, R. D. Progressive incorporation of propidium iodide in cultured mouse neurons correlates with declining electrophysiological status: a fluorescence scale of membrane integrity. Journal of Neuroscience Methods. 31 (1), 43-46 (1990).
  26. Salvador-Silva, M., et al. Responses and signaling pathways in human optic nerve head astrocytes exposed to hydrostatic pressure in vitro. Glia. 45 (4), 364-377 (2004).
  27. Howard, D., Sturtevant, B. In vitro study of the mechanical effects of shock-wave lithotripsy. Ultrasound Medical Biology. 23 (7), 1107-1122 (1997).
  28. Effgen, G. B., et al. A Multiscale Approach to Blast Neurotrauma Modeling: Part II: Methodology for Inducing Blast Injury to in vitro Models. Front Neurol. 3, 23(2012).
  29. Nguyen, T. T. The characterisation of a shock tube system for blast injury studies. , Imperial College London. PhD Thesis (2016).
  30. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets CNS and Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  31. Sawyer, T. W., et al. Investigations of primary blast-induced traumatic brain injury. Shock Waves. 28 (1), 85-99 (2017).
  32. Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  33. Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
  34. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nature Protocols. 1 (3), 1439-1445 (2006).
  35. Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term live imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nature Protocols. 1 (3), 1223-1226 (2006).
  36. De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
  37. Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M. 3rd, Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS). Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
  38. Cater, H. L., et al. Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels. Journal of Neurochemistry. 101 (2), 434-447 (2007).
  39. Atkins, C. M. Decoding hippocampal signaling deficits after traumatic brain injury. Translational Stroke Research. 2 (4), 546-555 (2011).
  40. Bigler, E. D., et al. Hippocampal volume in normal aging and traumatic brain injury. American Journal of Neuroradiology. 18 (1), 11-23 (1997).
  41. Umile, E. M., Sandel, M. E., Alavi, A., Terry, C. M., Plotkin, R. C. Dynamic imaging in mild traumatic brain injury: support for the theory of medial temporal vulnerability. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 83 (11), 1506-1513 (2002).
  42. Effgen, G. B., et al. Primary Blast Exposure Increases Hippocampal Vulnerability to Subsequent Exposure: Reducing Long-Term Potentiation. Journal of Neurotrauma. 33 (20), 1901-1912 (2016).
  43. Effgen, G. B., et al. Isolated primary blast alters neuronal function with minimal cell death in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neurotrauma. 31 (13), 1202-1210 (2014).
  44. Vogel Iii, E. W., et al. Isolated Primary Blast Inhibits Long-Term Potentiation in Organotypic Hippocampal Slice Cultures. Journal of Neurotrauma. , (2015).
  45. Vornov, J. J., Tasker, R. C., Coyle, J. T. Direct observation of the agonist-specific regional vulnerability to glutamate, NMDA, and kainate neurotoxicity in organotypic hippocampal cultures. Experimental Neurology. 114 (1), 11-22 (1991).
  46. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
  47. Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V., Malouf, A. T. Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures. The Journal of Neuroscience. 15 (11), 7702-7711 (1995).
  48. Miller, A. P., et al. Effects of blast overpressure on neurons and glial cells in rat organotypic hippocampal slice cultures. Frontiers in Neurology. 6, 20(2015).
  49. Panzer, M. B., Wood, G. W., Bass, C. R. Scaling in neurotrauma: how do we apply animal experiments to people. Experimental Neurology. , 120-126 (2014).
  50. Campos-Pires, R., et al. Xenon Protects against Blast-Induced Traumatic Brain Injury in an In Vitro Model. Journal of Neurotrauma. 35 (8), 1037-1044 (2018).
  51. Coburn, M., Maze, M., Franks, N. P. The neuroprotective effects of xenon and helium in an in vitro model of traumatic brain injury. Critical Care Medicine. 36 (2), 588-595 (2008).
  52. Campos-Pires, R., et al. Xenon improves neurologic outcome and reduces secondary injury following trauma in an in vivo model of traumatic brain injury. Critical Care Medicine. 43 (1), 149-158 (2015).

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