Este método de separación de tripanosoma de sangre depende de su carga superficial ser menos negativa que mamífero las células de la sangre. Sangre infectada es colocada y tratada en una columna de intercambiador de aniones. Este método, más apropiado diagnóstico de la tripanosomiasis africana, proporciona parásitos purificados para las investigaciones inmunológicas, biológicas, bioquímicas, farmacéutica y biología molecular.
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Artículo de método
Purificación de tripanosomas extracelulares, incluyendo a africano, de la sangre por intercambiadores de aniones (celulosa Diethylaminoethyl columnas)
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Resumen
Resumen
Este método permite la separación de tripanosomas, parásitos responsables de tripanosomiasis africana humana y animal (sombrero) de sangre infectada. Este es el mejor método para el diagnóstico de la primera etapa sombrero y además este método de purificación del parásito permite serológica e investigación las investigaciones.
SOMBRERO es causado por la mosca tsetsé transmitidos Trypanosoma brucei gambiense y T. b. rhodesiense. Relacionados con tripanosomas son los agentes causativos de tripanosomiasis animal. Detección de tripanosoma es esencial para el diagnóstico, tratamiento y seguimiento de sombrero. La técnica descrita aquí es la técnica de detección de parásito más sensible, adaptada a condiciones de campo para el diagnóstico de T. b. gambiense sombrero y puede ser completada dentro de una hora. Es capas de sangre sobre una columna de Intercambiador aniónico (DEAE celulosa) previamente ajustada a pH 8, y se añade tampón de elución. Cargadas altamente negativa de las células sanguíneas son adsorbidas en la columna mientras que los tripanosomas menos negativamente cargadas pasan a través. Tripanosomas recogidos son peleteados por centrifugación y observados por microscopia. Por otra parte, parásitos están preparados sin daño celular manteniendo su infectividad.
Tripanosomas purificadas se requiere para las pruebas inmunológicas; se utilizan en el análisis de trypanolysis, el estándar de oro para serología de sombrero. Tinción de parásitos se utilizan en la prueba de aglutinación de la tarjeta (CATT) para serología de campo. Antígenos de tripanosomas purificados, como la glicoproteína variante de superficie, exoantígenos, también se utilizan en diferentes inmunoensayos. El procedimiento descrito aquí está diseñado para tripanosomas africanos; en consecuencia, tienen condiciones de cromatografía para adaptarse a cada cepa de Tripanosoma y más generalmente, a la sangre de cada especie de mamífero anfitrión.
Estos fascinantes patógenos son fácilmente purificada y disponible para usar en Bioquímica, molecular y estudios de la biología incluyendo co-cultivo con células hospedadoras para investigar las relaciones huésped-parásito en el nivel de receptores de membrana, la señalización y el gen de la célula expresión; la droga de prueba in vitro; investigación de canceladura del gene, mutación o sobreexpresión de procesos metabólicos, biogénesis del citoesqueleto y supervivencia del parásito.
Introducción
El método se describe aquí permite la separación de tripanosomas, parásitos responsables de tripanosomiasis africana humana y animal (HAT), de la sangre. Este es el mejor método para el diagnóstico de la primera etapa sombrero y además este método de purificación del parásito permite sólida investigación serológica y la investigación.
SOMBRERO es causado por la mosca tsetsé transmitidos Trypanosoma brucei gambiense y T. b. rhodesiense1. Estos parásitos protozoarios se multiplican extracelularmente en el torrente sanguíneo, linfa y líquidos intersticiales durante la primera etapa de la enfer....
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Protocolo
Las investigaciones conforman a las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio (NIH Publication no. 85±23, revisado 1996). Protocolos fueron aprobados por el Comité de ética local.
1. los animales
- Mantener los ratones femeninos de Suiza (de-1) de edad de ocho a diez semanas, 20-25 g, en un animal vivienda instalaciones quince días antes de cada experimento. Casa en cajas ventiladas que se mantienen en una protegida, temperatura (22 ° C) y humedad (50%) control de habitación, con 12 horas ciclo de luz de encendido/apagado.
- Dar animales libre acceso a alimentos y agua. Minimizar el dolor, el sufri....
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Resultados
Purificada tripanosomas se han utilizado en pruebas farmacéuticas. Parásitos se transfieren en pocillos de cultivo que contiene diluciones seriadas de fármacos específicos, ya sea solo o mezclado19. Observaciones microscópicas, evaluar la motilidad es un marcador de viabilidad, puede realizarse con sólo unas pocas drogas están siendo analizadas, mientras que AlamarBlue análisis de viabilidad de la célula es un excelente método para ensayos de gran motilidad durante.......
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Discusión
Tripanosomas purificadas representan un medio poderoso para estudiar Inmunología, bioquímica, biología celular y molecular. Grandes extensiones de datos y resultados se han obtenido de tripanosomas, que luego ha ayudado a obtener información de otras células eucariotas30. Tripanosomas son también el tema de investigación importante e interesante porque han ideado numerosos mecanismos que les permiten sobrevivir y crecer en dos ambientes muy diferentes: el vector de la mosca tsetsé y el del huésped.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a todos los miembros de la UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Esta investigación fue apoyada por el financiamiento interno de la Universidad de Burdeos y el apoyo de la ANR, la empresa LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024 y de la Asociación pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale y el servicio de Service de Coopération et d ' action culturelle de l ' Ambassade de France à Bangui (Centroafricana).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pipetas de 10 mL | Falcon | 357.551 | |
| Pipetas de 2 mL | Falcon | 352,507 | |
| Tubo de centrifugación 50 mL | Centrífuga Falcon | 352,070 | |
| Sigma Aldrich | 4K15 | ||
| DEAE celulosa | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| papel de filtro | Whatman | 1,001,125 | |
| Matraz de fondo plano cuello estrecho | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glucosa | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparina | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 g |
| Olympus | CH-20 | ||
| Cubreobjetos de microscopio | Thermofisher scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Portaobjetos de | microscopioThermofisher scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026; 260 | 500 g |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616; 262 | |
| Frascos de medios de plástico Nalgene de 500 g tamaño 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Frascos de medios de plástico Nalgene tamaño 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pipeta Pasteur | VWR | BRND125400 | |
| Penicilina 10,000 UI/Estreptomicina 10,000 y micro; g | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Rojo fenol | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Syringue | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Campana de cultivo de tejidos | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Instituto de Medicina Tropical (Amberes, Bélgica). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Instituto de Medicina Tropical (Amberes, Bélgica). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | Escuela de Higiene y Medicina Tropical de Londres (Reino Unido) | Partinico II |
Referencias
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P....
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Reimpresiones y permisos
