Tecnología de microarrays de proteínas extracelulares para detección de alto rendimiento de las interacciones ligando-Receptor de baja afinidad

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de pantalla proteína extracelular microarrays para la identificación de las interacciones receptor-ligando novela en alto rendimiento. También se describe un método para mejorar la detección de interacciones proteína-proteína transitorias mediante el uso de complejos de proteína-microbead.

Resumen

Factores secretados, receptores de membrana atada y sus socios interactúan son los reguladores principales de la comunicación celular y la iniciación de cascadas de señalización durante la homeostasis y la enfermedad y como tal representan dianas terapéuticas principales. A pesar de su importancia, estas redes de interacción quedan significativamente subrepresentadas en las bases de datos actuales; por lo tanto, más proteínas extracelulares no tienen ningún socio obligatorio documentado. Esta discrepancia es sobre todo debido a los problemas relacionados con el estudio de las proteínas extracelulares, incluyendo la expresión de proteínas funcionales y la débil, baja afinidad, las interacciones de la proteína a menudo se establece entre receptores de superficie celular. El propósito de este método es describir la impresión de una librería de proteínas extracelulares en un formato de microarray para la detección de interacciones proteína-proteína. Para habilitar la detección de interacciones débiles, se describe un método basado en multimerization de la proteína de consulta bajo estudio. Junto a esta base del microbead multimerization para mayor multivalency, el microarray de proteínas permite la detección robusta de interacciones proteína-proteína transitorias en alto rendimiento. Este método ofrece un muestra rápida y de bajo consumo de enfoque para la identificación de nuevas interacciones aplicables a cualquier proteína extracelular. Impresión de microarrays de la proteína y el protocolo de detección se describen. Esta tecnología será útil para los investigadores que buscan un método robusto para el descubrimiento de las interacciones de la proteína en el espacio extracelular.

Introducción

El método revisado aquí describe la impresión de una colección de proteínas extracelulares en un formato de microarrays, seguido de un método para la detección de un objetivo de interés contra esta biblioteca. Hemos identificado proteínas multimerization como un paso crucial para la detección de interacciones caracterizados por afinidades de unión baja. Para mejorar la detección de estas interacciones, se describe un protocolo basado en multimerization de la proteína de consulta de interés utilizando microesferas.

Segregada y superficie expresan proteínas de la célula (colectivamente llamadas proteínas extracelulares) junto con sus socios d....

Protocolo

1. generación de una biblioteca de extracelulares proteínas humanas

1. Compilar una lista de receptores de superficie celular o proteínas secretadas de interés para la construcción de la biblioteca de microarrays de proteínas. Familias de proteínas específicas (por ejemplo, la superfamilia de las inmunoglobulinas) o proteínas selectivamente expresan en particular tipos pueden seleccionarse para el estudio de la célula.
2. Para receptores de superficie celular, determinar los límites del dominio extracelular (ECD), identificando las regiones transmembranales utilizando herramientas de software y péptido señal. Algunas de las herramientas, libremente dispo....

Resultados

Figura 1muestra un esquema del flujo de trabajo para la tecnología de microarrays de proteínas extracelulares. Una vez disponibles las diapositivas de microarrays que contiene la biblioteca de la proteína extracelular, la proyección de la proteína de interés y análisis de datos puede completarse en un día. Muchas interacciones fisiológicamente relevantes entre receptores de membrana integrado se caracterizan por fuerzas de enlace muy débil (K_D en e.......

Discusión

Un número significativo de receptores huérfanos permanece en el genoma humano, y nuevos socios interactúan siguen apareciendo para proteínas extracelulares con ligandos previamente caracterizados. Definición de las interacciones ligando-receptor en humanos y organismos modelo es esencial para comprender los mecanismos que determinan la comunicación celular durante la homeostasis, así como desregulación conduce a la enfermedad y por lo tanto informar de nuevos o mejorados opciones terapéuticas. Sin embargo, la detección d.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Glicerol ultra puro de grado MB USB	Corporation	56-81-5 Almacenamiento de	proteínas
Tampón de bloqueo SeptoMark	Zeptosens	BB1, 90-40	Portaobjetos de microarrays de tampón de bloqueo
Albúmina sérica bovina	Roche	03-117-957-001	Control de corredera para la colocación de mascarillas (opcional)
Placas multipocillos de polipropileno	Greiner Bio One	82050-678	Almacenamiento de proteínas
Placas multipocillos de polipropileno	Arrayit	MMP384	Impresión de diapositivas
NanoPrint LM60, o contacto similar microarrayer	Arrayit	NanoPrint LM60, o similar microarrayer de contacto	Impresión de diapositivas
Micro clavijas de desmanchado	Arrayit	Micro clavijas de desmanchado	Impresión de portaobjetos
Estación de bloqueo ZeptoFOG Zeptosens	de	bloqueo ZeptoFOG, 1210	Bloquea las diapositivas después de la impresión
Leche desnatada en polvo	Thermo Fisher	LP0031	Solución
de bloqueoPortaobjetos de vidrio recubierto de epoxisilano	Nextrion Slide E	1064016	Microarray Portaobjetos Juego de
soporte de vidrio y estante de portaobjetos	Wheaton		900303 Almacenamiento de portaobjetos
Colorante monorreactivo Cy5	Healthcare	PA23031	Etiquetado de albúmina
Cy5 Colorante monorreactivo GE	Healthcare	PA25001	Etiquetado de IgG humana
Columna de desalinización Pro-spin	Princeton Separaciones	CS-800	Eliminar el tinte libre
Sello adhesivo de papel de aluminio	AlumaSeal	F-384-100	Sellar placas de stock
Viales criogénicos de polipropileno	Viales Corning	430658	Master para el almacenamiento de bibliotecas de proteínas
Microperlas de proteína A	Miltenyi	120-000-396	Consulta multimerización de proteínas
IgG humana	Jackson Immunoresearch	& nbsp; 009-000-003	IgG irrelevante para el etiquetado de
la proteína A	Sigma	P7837	Bloqueo de portaobjetos de microarray
Estación de hibridación, a-Hyb o similar	Miltenyi	Estación de hibridación, a-Hyb o similar	Procesamiento automatizado de microarrays (opcional)
Escáner GenePix 4000B o similar	Molecular Devices	Escáner GenePix 4000B o similar	Escaneo de portaobjetos
GenePix Pro o software de extracción de datos equivalente	Molecular Devices	GenePix Pro o software de extracción de datos equivalente	Procesamiento de datos
Señal P4.1	DTU Bioinformatics, Universidad Técnica de Dinamarca	software en línea	Herramienta de predicción para determinar la presencia y ubicación de sitios de escisión de péptidos señal
Servidor TMHMM 2.0	DTU Bioinformatics, Universidad Técnica de Dinamarca	software en línea	Predicción de hélices transmembrana en proteínas
Phobius	Software en línea del Centro de Bioinformática de Estocolmo		Un predictor combinado de topología transmembrana y péptidos señal
TOPCONS	Universidad de Estocolmo	Software en línea	Predicción de la topología de membrana y péptidos señal

Estación GE