Describimos el montaje, operación y limpieza de un aparato de flujo diseñado para la formación de biopelículas fúngicas de imagen en tiempo real bajo flujo. También ofrecemos y discutir los algoritmos cuantitativos para ser utilizado en las imágenes adquiridas.
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Artículo de método
Imagen en tiempo real y cuantificación del desarrollo de biopelículas fúngicas mediante un sistema recirculación de flujo bifásico
En este artículo
Resumen
Resumen
En la candidiasis orofaríngea, miembros del género Candida deben cumplir y crecen en la superficie de la mucosa oral mientras que bajo los efectos del flujo salival. Mientras que se han desarrollado modelos para el crecimiento bajo flujo, muchos de estos sistemas son caros, o no permiten la proyección de imagen mientras que las células están bajo flujo. Hemos desarrollado un novedoso aparato que permite el crecimiento y desarrollo de las células de la Candida albicans bajo flujo y en tiempo real de la imagen. Aquí detallamos el protocolo para el montaje y el uso de este aparato de flujo, así como la cuantificación de los datos que se generan. Somos capaces de cuantificar los tipos de las células a y separan de la diapositiva, así como determinar una medida de la biomasa en la diapositiva con el tiempo. Este sistema es económico y versátil, trabajando con muchos tipos de microscopios ópticos, como microscopios de mesa barato, y es capaz de extendido veces en comparación con otros sistemas de flujo de imágenes. En general, se trata de un sistema de bajo rendimiento que puede proporcionar información muy detallada en tiempo real sobre el crecimiento de biofilm de especies fúngicas bajo flujo.
Introducción
Candida albicans (C. albicans) es un patógeno fúngico oportunista de seres humanos que pueden infectar a muchos tipos de tejido, incluyendo superficies de la mucosa orales, provocando candidiasis orofaríngea y resultando en una menor calidad de vida para los individuos afectados1. Formación de biofilms es una característica importante para la patogenia de la C. albicans, y se han realizado numerosos estudios sobre la formación y la función de C. albicans biofilms2,3,4, 5, muchos de....
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Protocolo
1. montar el aparato de flujo
- Configurar las piezas listadas en la Tabla de materiales de acuerdo con el esquema en la figura 1 con las consideraciones que se discuten más abajo.
Nota: Para mayor comodidad, el flujo de aparatos se dividieron en dos partes, la parte verde (todo aguas arriba de la corredera a los frascos de los medios de comunicación) y la naranja lado (todo aguas abajo de la diapositiva para los frascos de los medios de comunicación).- Asegúrese de que todo el aparato de flujo es hermético para evitar fugas, con la única excepción de los frascos de los medios de comunicación (
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Resultados
Imágenes representativas de un normal noche Time-lapse experimento usando tipo C. albicans las células a 37 ° C se aprecia en la figura 2A y 1 de Video suplementaria. Las imágenes han sido contraste mejorado para mejorar la visibilidad. Se realizó la cuantificación de los datos originales, y gráficos representativos pueden verse en la figura 2B. Para generar estos gráfic.......
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Discusión
Utilizando el sistema de flujo señalados anteriormente permite la generación de vídeos Time-lapse cuantitativas de biofilm hongos crecimiento y desarrollo. Para permitir comparaciones entre experimentos es de vital importancia para poder garantizar los parámetros de proyección de imagen son el mismo. Esto incluye asegurar que el microscopio está configurado para la iluminación Köhler para cada experimento (muchas guías están disponibles en línea para este proceso). Aparte de los parámetros de la proyección de imagen, hay.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer el Dr. Wade Sigurdson para proporcionar valiosas contribuciones en el diseño de los aparatos de flujo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Bomba | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Cabezal de bomba | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubos | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| trampa de burbujas | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Adaptador de vacío de trampa de burbujas para 1/4" Línea de vacío ID | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| Adaptador de filtro en línea (se necesitan 4) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Correderas | ibidi | 80196 | 4 |
| * Corredera luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum Trampa de burbujas asistida | Elveflow/Darwin microfluídica | KBTLarge - Trampa de burbujas microfluídica Kit | 3 |
| matraces de medios | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µ m filtro de aire | Corning | 431229 | 1 |
| Botella de vidrio roscada para PD y matraz de filtro (2 necesarios) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Tapón de rosca para PD y matraz de filtro (2 necesarios) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Conector de tubo | de rosca Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Conector de tubo arandela biselada | Danco | 88579 | 5,10 |
| Conector de tubo arandela plana | Danco | 88569 | 5,10 |
| Abrazaderas para filtros en línea y aguas abajo Y (7 necesarias) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Herramienta de sujeción | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 μ m filtro de medios en línea | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 μ m filtro de medios en línea | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 μ m filtro de medios de entrada | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µ m filtro de medios | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µ Filtro de medios m " adaptador" | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Tapón de goma | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Agitador de placa calefactora con puerto de sonda externo | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Sonda de temperatura | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
Referencias
- Pankhurst, C. L. Candidiasis (oropharyngeal). BMJ clinical evidence. 2012, 1304(2012).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Revista iberoamericana de micología. 18 (4), 163-170 (2001).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P.
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Reimpresiones y permisos
