Aquí, presentamos un protocolo detallado para la identificación de eventos de recombinación homóloga que se produjeron en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot o PCR. Este método es ejemplificado por la generación de modelos UROLOGICAL miosina II reemplazo genético ratón tecnología tradicional embrionario basada en células madre homólogo mediada por la recombinación dirigida a.
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Artículo de método
Identificación de eventos de recombinación homóloga en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot y reacción en cadena de polimerasa
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En este artículo
Resumen
Resumen
Relativo a las cuestiones de efectos off-target y la dificultad de insertar un largo fragmento de ADN en la aplicación de diseño nucleasas para edición tallo genoma embrionario (ES) de la célula gene targeting tecnología no tiene estas deficiencias y es ampliamente utilizado para modificar el genoma del animal y el ratón que van desde grandes deleciones/inserciones a sustituciones de un solo nucleótido. En particular, identificando los relativamente pocos eventos de recombinación homóloga (HR) necesarios para obtener el deseado ES clones es un paso fundamental, que exige métodos precisos y fiables. Southern blot y/o PCR convencional se utiliza a menudo para este propósito. Aquí, describimos los procedimientos detallados de la utilización de estos dos métodos para identificar eventos de recursos humanos que ocurrieron en células ES de ratón que el gen Myh9 endógeno pretende ser interrumpida y reemplazada por cDNAs codifican otros cadena pesada del myosin UROLOGICAL IIs (IIs de NMHC). Todo el procedimiento de borrar meridional incluye la construcción de objetivos vector(s), electroporación, selección de drogas, la expansión y el almacenamiento de las células ES/clones, preparación, digestión y blot de DNA genómico (gDNA), la hibridación y lavado de sonda y un paso final de la autorradiografía en las películas de rayos x. PCR se puede realizar directamente con gDNA preparada y diluida. Para obtener resultados ideales, las sondas y la enzima de la restricción (RE) sitios de corte para borrar meridional y los cebadores para PCR deben ser cuidadosamente planificadas. Si la ejecución de borrar meridional es desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva y PCR resultados falsos positivos, la correcta identificación por borrar meridional y el cribado rápido por PCR permite la aplicación única o en combinación de estos métodos descritos en este documento para ser ampliamente utilizado y consultado por los laboratorios más en la identificación de genotipos de células madre embrionarias y genéticamente modificados animales.
Introducción
La tecnología del gene targeting por HR en células de madre embrionarias murinas proporciona una poderosa herramienta para disecar las consecuencias celulares de mutaciones genéticas específicas1,2. La importancia y el significado de esta tecnología se reflejan en su reconocimiento por el Premio 2007 Nobel en la fisiología o la medicina3,4; mientras tanto, representa el advenimiento de la era moderna de la ingeniería gen5. Gene targeting por hora puede ser utilizado para diseñar prácticamente cualquier alteración que van desde m....
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Protocolo
1. diseño de la focalización Construct(s), puntas de prueba de Southern Blot y cebadores para PCR
- Seleccione el primer exón (exón 2) codificación del gen Myh9 de inserción o interrupción en la aplicación del nocaut/knock-in divulgado aquí.
- Recuperar las 5 kb aguas arriba y 5 kb abajo secuencias de ADN que rodea el Myh9 exón 2 de la Página Web genome.ucsc.edu .
- Analizar patrones de digestión de la restricción de enzimas (REs) con cortes de 1-2 en esta región de 10 kb, utilizando el software de pDRAW para determinar RE(s) conveniente para digerir el ADN genómico para borrar meridional.
Nota: Dra cumple este requisito y s....
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Resultados
En este trabajo se describe un protocolo detallado de Southern blot y de PCR, que se utiliza para identificar eventos de HR que se produjeron en las células ES de ratón para la generación de modelos de ratón de recambio genético NM II, tecnología ES basada en células mediada por recursos humanos dirigidos a. Aunque borrar meridional y PCR, así como técnica de gene targeting tradicional, ha sido ampliamente utilizado desde hace varias décadas, la aplicación exitosa de ellos debe ser planea.......
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Discusión
En la actualidad, diseñador nucleasas para la edición del genoma todavía no pueden reemplazar ES célula gene targeting tecnología debido a sus problemas de efectos off-target y dificultad en la inserción de un ADN largo fragmento30,31. Como los métodos de oro para identificar eventos de HR que se producido en células de ratón ES, este informe proporciona un protocolo detallado de Southern blot y de PCR para el campo. Validamos la fiabilidad de estos métodos media.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo recibió apoyo del Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (subvenciones no. 31571432), el humano Provincial Ciencias naturales Fundación de China (Grant No. 2015JC3097) y la investigación Fundación de Educación Oficina de Hunan Provincia, China (Grant no. 15 K 054).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| CLON DE BAC | Centro de Recursos de BACPAC (BPRC) | BMQ-330E21 | |
| QIAGEN Kit de construcción grande | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Kit de extracción de gel | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick Kit de purificación de PCR | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra Alta Fidelidad ADN Polimerasa | Agilent | 600382 | |
| Vector T-easy | Promega | A1360 | |
| Solución de lisis de núcleos | Promega | A7941 | |
| Solución de precipitación de proteínas | Promega | A7951 | |
| Solución desnaturalizante de ADN | VWR | 351-013-131 | |
| Solución neutralizante de ADN | VWR | 351-014-131 | |
| Perlas de etiquetado de ADN listas para usar (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20x | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Solución de ADN de esperma de salmón | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq ADN polimerasa de alta fidelidad | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman Sistema de Transferencia TurboBlotter, Kits Grandes | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α 32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro Columnas | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Solución de hibridación | Millipore | S4040 | |
| Kodak Película de rayos X | Z& Z Médico | 844 5702 |
Referencias
- Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
- Skarnes, W., et al.
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Reimpresiones y permisos
