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Artículo de método

Identificación de eventos de recombinación homóloga en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot y reacción en cadena de polimerasa

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DOI:

10.3791/58467

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20 de noviembre de 2018

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1Lab of Animal Models and Functional Genomics (LAMFG), The Key Laboratory of Animal Vaccine & Protein Engineering, College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University (HUNAU), 2Department of Pathology, Georgetown University Medical School, 3College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University (HUNAU), 4Lab of Molecular Cardiology (LMC), National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH), 5Transgenic Core, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH)

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo detallado para la identificación de eventos de recombinación homóloga que se produjeron en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot o PCR. Este método es ejemplificado por la generación de modelos UROLOGICAL miosina II reemplazo genético ratón tecnología tradicional embrionario basada en células madre homólogo mediada por la recombinación dirigida a.

Resumen

Relativo a las cuestiones de efectos off-target y la dificultad de insertar un largo fragmento de ADN en la aplicación de diseño nucleasas para edición tallo genoma embrionario (ES) de la célula gene targeting tecnología no tiene estas deficiencias y es ampliamente utilizado para modificar el genoma del animal y el ratón que van desde grandes deleciones/inserciones a sustituciones de un solo nucleótido. En particular, identificando los relativamente pocos eventos de recombinación homóloga (HR) necesarios para obtener el deseado ES clones es un paso fundamental, que exige métodos precisos y fiables. Southern blot y/o PCR convencional se utiliza a menudo para este propósito. Aquí, describimos los procedimientos detallados de la utilización de estos dos métodos para identificar eventos de recursos humanos que ocurrieron en células ES de ratón que el gen Myh9 endógeno pretende ser interrumpida y reemplazada por cDNAs codifican otros cadena pesada del myosin UROLOGICAL IIs (IIs de NMHC). Todo el procedimiento de borrar meridional incluye la construcción de objetivos vector(s), electroporación, selección de drogas, la expansión y el almacenamiento de las células ES/clones, preparación, digestión y blot de DNA genómico (gDNA), la hibridación y lavado de sonda y un paso final de la autorradiografía en las películas de rayos x. PCR se puede realizar directamente con gDNA preparada y diluida. Para obtener resultados ideales, las sondas y la enzima de la restricción (RE) sitios de corte para borrar meridional y los cebadores para PCR deben ser cuidadosamente planificadas. Si la ejecución de borrar meridional es desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva y PCR resultados falsos positivos, la correcta identificación por borrar meridional y el cribado rápido por PCR permite la aplicación única o en combinación de estos métodos descritos en este documento para ser ampliamente utilizado y consultado por los laboratorios más en la identificación de genotipos de células madre embrionarias y genéticamente modificados animales.

Introducción

La tecnología del gene targeting por HR en células de madre embrionarias murinas proporciona una poderosa herramienta para disecar las consecuencias celulares de mutaciones genéticas específicas1,2. La importancia y el significado de esta tecnología se reflejan en su reconocimiento por el Premio 2007 Nobel en la fisiología o la medicina3,4; mientras tanto, representa el advenimiento de la era moderna de la ingeniería gen5. Gene targeting por hora puede ser utilizado para diseñar prácticamente cualquier alteración que van desde mutaciones puntuales a grandes cambios cromosómicos en el genoma del ratón ES células6,7. Es bien sabido que, antes de la aparición de herramientas de edición llamado genoma, la generación de un ratón knockout de genes requiere la aplicación de tecnología gene targeting en ES las células8,9,10. Durante las últimas dos décadas, más de 5.000 ratones dirigidos por gene fueron producidos por este enfoque para modelar enfermedades humanas o el estudio de las funciones del gen11. Un esfuerzo de nocaut en el genoma se ha establecido para la distribución de vectores gene targeting objetivos clones de células ES y ratones vivos a la comunidad científica2,12,13,14 , 15. sin duda, ES celular tecnología basada en HR-mediated gene targeting ha avanzado grandemente nuestra comprensión de las funciones de los genes en el contexto fisiológico o patológico.

Debido a que HR es un evento relativamente infrecuente en mamíferos células16,17, la importante y siguiente paso después de gene targeting en células de madre embrionarias murinas es analizar numerosas colonias ES para la identificación de algunos clones con mutaciones resultantes de Recursos humanos con el objetivo de vectores18. Los métodos del oro para la identificación de eventos de recursos humanos incluyen Southern blot y PCR19,20. Las ventajas de los enfoques incluyen que borrar meridional puede identificar clones ES correctamente dirigidas y permite a los investigadores a analizar la estructura del evento dirigido de genes, como una verificación de una inserción de copia única de la construcción, mientras que un Estrategia basada en la PCR permite la detección más rápida de HR eventos21,22. Aunque estos métodos tienen inconvenientes, como que son lentos y pueden tener falsos positivos, el uso de la combinatoria de ellos es ampliamente aceptados y aplicados por los laboratorios más en la identificación de eventos de recursos humanos, particularmente en células madre embrionarias, para generar genéticamente modificado animales.

Tres isoformas de la miosina UROLOGICAL II (NM II) en los mamíferos, cada uno con dos IIs NMHC idénticos que son codificadas por tres genes diferentes (llamado Myh9 Myh10 y Myh14) y dos pares de cadenas ligeras, se denominan NM II-A, II B y II-C23. Estudios previos han indicado que al menos las isoformas de NM II-A y II-B son esenciales para el desarrollo del ratón debido a la ablación en vivo de estas isoformas en mortalidad embrionaria24,25,26. Para evitar este problema y obtener nuevos conocimientos sobre las funciones específicas de la isoforma de NM II-A y II-B en las últimas etapas del desarrollo del ratón, un reemplazo genético estrategia tecnología ES celular HR-mediated gene targeting se adoptó para generar una serie de modelos de ratón27. En el curso de identificación de los clones ES deseados, borrar meridional y los métodos de PCR fueron utilizados, y estas demostraron para ser eficiente y confiable27,28.

Este documento pretende proporcionar una descripción detallada de Southern blotting y PCR, incluyendo el diseño de la focalización vector(s), sonda y cartillas y la ejecución de los experimentos, así como el análisis de resultados ejemplificados mediante la identificación de eventos de recursos humanos ocurrencia en células madre embrionarias para la creación de ratón de recambio genético NM II modelos y datos representativos. Los protocolos de estos dos métodos presentados aquí también pueden ser adoptados para la identificación de los genotipos de células genéticamente modificadas o los animales.

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Protocolo

1. diseño de la focalización Construct(s), puntas de prueba de Southern Blot y cebadores para PCR

  1. Seleccione el primer exón (exón 2) codificación del gen Myh9 de inserción o interrupción en la aplicación del nocaut/knock-in divulgado aquí.
  2. Recuperar las 5 kb aguas arriba y 5 kb abajo secuencias de ADN que rodea el Myh9 exón 2 de la Página Web genome.ucsc.edu .
  3. Analizar patrones de digestión de la restricción de enzimas (REs) con cortes de 1-2 en esta región de 10 kb, utilizando el software de pDRAW para determinar RE(s) conveniente para digerir el ADN genómico para borrar meridional.
    Nota: Dra cumple este requisito y se selecciona para el propósito.
  4. Seleccione un fragmento de 4 kb inmediato aguas arriba del exón Myh9 2 como el brazo izquierdo de homología (LHA) y una secuencia descendente inmediata de 1,7 kb fragmento como el brazo derecho de homología (RHA); elegir un fragmento de 1 kb 5' aguas arriba de la LHA como la sonda de izquierda (LP) para borrar meridional y un fragmento de 1,2 kb 3' aguas abajo de la RHA como la punta de prueba derecho (RP), basado en el análisis anterior.
  5. Utilice un programa primer3 para diseñar los cebadores de avance y retroceso para amplificar los cuatro fragmentos de DNA por PCR. Diseño de un par de primers con el primer avance residido cerca de la terminal 3' de un gen de resistencia del neomyocin del marcador de la selección (P1) y la cartilla reversa ubicado a las afueras de la RHA (P2).
    Nota: Este par de imprimación se utilizará para la identificación de clones ES dirigidas por PCR29.
  6. Encontrar un clon de BAC 129Sv cubriendo el lugar geométrico del gene de ratón Myh9 visitando el sitio web de bacpac.chori.org (Nota: ADN isogénicas es preferido). Aislar ADN BAC utilizando un kit adecuado para purificar los pedazos grandes de ADN siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
    Nota: Se utilizará como plantilla de ADN purificado de BAC para amplificación por PCR.
  7. Dibujar una representación esquemática del targeting construcciones, sondas y primers para resumir esta información.

2. generación de apuntar Construct(s) y puntas de prueba de Southern Blot y la preparación de los Primers para PCR

  1. Ordenar los cebadores PCR descritos anteriormente y disolverlos en una concentración de 20 μm.
  2. Amplificar los brazos de homología y las puntas de prueba por PCR en una solución de reacción incluye 1 μl μl hacia adelante y 1 reversa imprimaciones, 1 μl de ADN BAC (50 ng) como la plantilla, 5 μl de tampón de Pfu y 1 μl de Pfu ultra como la ADN polimerasa , y H2O hasta 50 μl. llevar a cabo la polimerización en cadena en una máquina PCR bajo las siguientes condiciones: 95 ° C por 3 min; 95 ° C por 30 s; 60 ° C por 30 s; 72 ° C y a 1 kb/min; 30 ciclos; por último, 72 ° C 10 minutos.
  3. Purificar productos PCR utilizando un kit de limpieza PCR según el protocolo proporcionado por el fabricante y eluir los fragmentos de ADN con 40 μl de H2O. Resumen de los productos PCR purificados con REs prediseñados en una solución de reacción que contiene 5 μl de tampón de x 10 para la REs , 2.5 μl de RE1 y 2,5 μl de RE2 y el ADN eluído, a 37 ° C por 2 h. correr un gel de DNA 1% separar bandas de ADN blanco, suprimir el gel que contiene el ADN bajo luz UV, Diana purificar los fragmentos de DNA de la blanco del gel con una extracción de gel de DNA kit según en el protocolo proporcionado por el fabricante y eluir los fragmentos de ADN con 40 μl de H2O.
  4. Clonar los brazos de homología y casetes de expresión de reemplazo en el vector de mpNTKV-LoxP según el orden de los amplificados y purificados RHA, LHA y reemplazo expresión casetes de otros vectores para obtener el objetivo final Construct(s). Clonar fragmentos de ADN de las sondas amplificadas y purificadas en el vector T-fácil.
  5. Las secuencias de nucleótidos de todos los fragmentos de ADN clonados para confirmar la secuencia27,28.

3. preparación de apuntar el Construct(s), la electroporación de células madre embrionarias y la amplificación de los Clones ES

  1. Preparar cada dirigida a construir usando un plásmido maxiprep kit según el protocolo proporcionado por el fabricante. Alinear cada plásmido construcción por digerir no i en una reacción de 400 μL incluyendo 40 μl de buffer 10 x para no I, 10 μl de no, 100 μg de DNA y H2O hasta 400 μL, a 37 ° C durante la noche.
  2. Purificar el construct(s) segmentación lineal.
    1. Extraer la solución de reacción digerido 1 x con un volumen igual de Alcohol de fenol: cloroformo: isoamílico (25:24:1) y centrifugar a una fuerza de 2.000 x g por 10 min.
    2. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL, precipitar el ADN con 2.5 x etanol y 0.1 x 3M acetato de sodio (pH 5,2) (cociente del volumen) y centrifugar a una fuerza de 2.000 x g por 10 min.
    3. Eliminar el sobrenadante, lavado el ADN 1 x con 1 mL de etanol al 75% de pellets y centrifugar a una fuerza de 2.000 x g durante 5 minutos.
    4. Quite el sobrenadante y secar el pellet de ADN durante 5 minutos.
    5. Disolver el precipitado de DNA lineal en estéril buffer Tris-EDTA (TE) a una concentración final de 1 μg/μl.
  3. Mezclar 50 μg de cada construcción segmentación lineal con 0,5 x 107 ES células. Realizar la electroporación en 320 V y 250 μF. placa las células electroporated ES en platos con alimentadores MEF neo-resistente.
  4. Después de 24 h, cambie a medio de celular ES con 400 μg/mL G418 y 200 μm ganciclovir y continúan cultura de 4 – 5 días con un cambio medio diario. Recoger resistente a los medicamentos ES clones en placas de 48 pocillos.
    Nota: Normalmente, se utilizan cuatro placas de 48 pocillos por construir.
  5. Duplicar las placas 48-bien.
    Nota: Un sistema de las placas es criopreservado, y el otro sistema se utiliza para la preparación de ADN genómico.

4. preparación de DNAs Genomic y la digestión con Restriction Enzyme(s)

  1. Preparar gDNAs de células madre embrionarias utilizando un kit comercial (kit de purificación de ADN genómico) con modificaciones menores.
    1. Quitar los medios de comunicación de la cultura de célula ES y agregar 500 μl de solución de lisis de núcleos, incluyendo RNaseA, directamente a los pozos para lisar las células.
      Nota: El lisado celular puede ser almacenada a-80 ° C o tratada inmediatamente.
    2. Pipeta de arriba y abajo varias veces para lisar las células completamente y transferirlos a un tubo limpio de 1,5 mL.
    3. Añadir un tercio del volumen de la solución de precipitación de la proteína en el tubo de 1,5 mL, vortex vigorosamente durante 20 s, enfriar las muestras en hielo durante 5 minutos y luego centrifugar a una fuerza de 2.000 x g durante 5 min transferencia el sobrenadante a otro limpio de 1,5 mL tubo contai Ning un volumen igual de isopropanol; mezclar suavemente la solución. (Nótese que blancas hebras de hilo-como pueden verse en este momento). Centrifugar a una fuerza de 2.000 x g durante 1 min; a continuación, descartar el sobrenadante.
    4. Lavar el sedimento gDNA con 1 mL de etanol al 70% a temperatura ambiente, centrifugar a una fuerza de 2.000 x g durante 1 min, aspirar el sobrenadante con cuidado y luego, secar el pellet gDNA por 3 min.
    5. Disolver el gDNAs con 100 μl de solución de rehidratación de ADN y, luego, incubar a 65 ° C por 1 h o a 4 ° C durante la noche.
    6. Tienda el gDNAs a 2 – 8 ° C.
  2. Resumen de la gDNAs con prediseñados RE Dra I. situado encima de una reacción de digestión 30 μL mezclando 3 μl de 10 x tampón para Dra I, 3 μl de Dra I, 10 μg de muestra de gDNAs y H2O hasta 30 μl e incubar a 37 ° C durante la noche.
  3. Comprobar la integridad de la digestión por el gel de ADN, análisis de 5 μl de la reacción digerida y luego agregar 3 μl de 10 x buffer de carga de ADN para el paso posterior.

5. Southern blot y PCR identificación

  1. Southern blot proyección
    1. Separar la gDNAs digerido por electroforesis y transferencia a una membrana.
      1. Preparar un gel de electroforesis de agarosa al 1% con bromuro de etidio (EB), cargar las muestras de paso 4.3 y una escalera de 1 kb y correr el gel con una tensión baja (30-40 V) durante la noche.
      2. Sacar el gel y tomar una foto con un sistema de proyección de imagen de gel de ADN después de la electroforesis. Compruebe si el digerido y separados gDNAs mostrar una borrón de transferencia de imagen.
      3. Remojo el gel en una bandeja con solución de ácido clorhídrico N 0.2 y agitar suavemente durante 20 min a temperatura ambiente.
      4. Transferir el gel a la solución de desnaturalización de DNA y agitar suavemente durante 20 min a temperatura ambiente.
      5. Cambiar el gel en la solución de ADN neutralizando y agitar suavemente durante 20 min a temperatura ambiente.
        Nota: El gel es propenso a la rotura después de este paso, por lo que debe ser manipulado con cuidado.
      6. Utilice el sistema de transferencia hacia abajo rápido para transferir el ADN del gel a la membrana. Monte la TurboBlotter y Blot pila según las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
        Nota: 10 x o 20 x solución de citrato de sodio solución salina (SSC) se utiliza como un buffer de transferencia. En general, 3 h de transferencia es bastante para transferir el 95% de gDNAs de gel a la membrana; sin embargo, un tiempo de transferencia es inofensivo.
      7. Sacar la membrana y lavar con 2 x SSC de 1 minuto, absorber el líquido con los tejidos y luego reaccione el ADN con la membrana usando un crosslinker UV.
        Nota: La membrana puede almacenarse a 4 ° C durante una semana.
    2. Etiqueta de las sondas de ADN con radiactividad.
      1. Purificar la plásmidos de la sonda utilizando un miniprep kit según el protocolo proporcionado por el fabricante.
      2. Liberación del ADN fragmentos de las sondas del vector plásmido por EcoR digestión en una solución de reacción incluyendo 5 μl de tampón de EcoR I, 2 μl de EcoR I enzima, 20 μg de plásmido ADN y H2O hasta 50 μl , por 2 h.
      3. Ejecutar un 1% gel de DNA para separar los fragmentos de ADN de la sonda desde el vector y purificar los fragmentos de ADN de las sondas con un kit de extracción de gel de ADN según el protocolo proporcionado por el fabricante.
      4. Utilizando 1 μl de solución de ADN, medir la concentración de ADN de los fragmentos de ADN de la sonda con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260/280 nm.
      5. Preparar 40 ng de sonda de ADN en un tubo de 1,5 mL con 45 μl de tampón TE, hervir durante 3 minutos, girar brevemente y luego, coloque los tubos en hielo durante 2 minutos.
      6. Añadir el ADN sonda desnaturalizada por el calor al tubo que contiene granos de etiquetado ADN listo a (-dCTP), pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar, añadir 5 μl de [α32P] dCTP y luego, incubar a 37 ° C durante 15 minutos.
      7. Purificar las puntas de prueba etiquetadas usando microcolumns G-50 según las instrucciones proporcionadas por el fabricante y, luego, medir la radiactividad de un contador de centelleo (opcional).
    3. Hibridar el membrane(s) con las puntas de prueba etiquetadas.
      1. Prehybridize la membrana.
        1. Precaliente la solución de hibridación a 42 ° C para 30 min mezclar 20 mL de solución de hibridación precalentado con 200 μg de esperma de salmón hervida ADN en un tubo de 50 mL.
        2. Colocar la membrana en el tubo de hibridación. Agregar la solución prehybridization mezclada al tubo de hibridación. Coloque en el horno de hibridación (sistema del balanceo y la temperatura a 42 ° C) y dejar que la prehybridization durante 30 minutos.
      2. Hibridar la membrana con la sonda marcada.
        1. Sacar el tubo de hibridación y verter la solución prehybridization en un tubo de 50 mL; Añadir la sonda desnaturalizada (calentada a 100 ° C por 3 min) de paso 5.1.2.7 a este tubo y mezcla suavemente.
          Nota: Reducir cualquier inducir burbujas.
        2. Devolver la solución mezclada al tubo de hibridación y efectuar la hibridación a 42 ° C durante la noche.
    4. Lavar la membrane(s) para quitar las puntas de prueba nonhybridized.
      1. Coloque el membrane(s) en una bandeja con 1 x SSC + 0.1% SDS y agitar suavemente en el 55 – 60 ° C durante 10 minutos.
      2. Transferir el membrane(s) a una bandeja con 0,5 x SSC + SDS 0.1% y agitar suavemente en el 55 – 60 ° C durante 10 minutos.
      3. Comprobar la radiactividad en el membrane(s) mediante un contador Geiger portátil para decidir si un tercer lavado es necesario.
    5. Exponga la radiactividad en la membrana a películas de rayos x.
      1. Retire el líquido de los lavados membrane(s).
      2. Envuelven la membrane(s) con envoltura de plástico y fijar it/ellos en el cassette de la exposición.
      3. Exponer la membrana dos hojas de película de rayos x en un cuarto oscuro.
      4. Coloque el cartucho de la exposición a-80 ° C durante la noche o más.
    6. Desarrollar las películas para visualizar los resultados. Evaluar si un clon ES correspondiente es la deseada con la recombinación específica o no, según los tamaños de las bandas de ADN detectados por las sondas.
    7. Rehybridize la misma membrana por otra sonda después de la extracción de la sonda usada según el siguiente procedimiento: sacar la membrana utilizada, lavar 1 x con limpiar el H2O y luego, la incubar en la solución de bandas (55% de formamida, 2% PES, 1% SDS, H 2 O) a 65 ° C con agitación suave durante 1 – 2 h.
  2. Identificación de la PCR
    1. Realizar la identificación de la polimerización en cadena de los clones ES deseados en una solución de reacción de 50 μl incluyendo 5 μl de buffer de x PCR 10, 2 μl de 50 mM MgSO4, 1 μl de dNTP 10 mM, 1 μl de cebador forward 20 μm, 1 μl de cebador inverso de 20 μm , 1 μl de Taq platinum de alta fidelidad, gDNAs (~ 100 ng) y H2O hasta 50 μl.
    2. Utilice las siguientes condiciones de reacción de PCR: una desnaturalización inicial a 94° C por 3 min, 30 ciclos de desnaturalización a 94° C por 30 s, recocido a 60° C por 30 s y una extensión a 68° C 132 s y un paso final de 68° C durante 10 minutos.
    3. Analizar los productos PCR por electroforesis en agarosa al 1.0%.
    4. Clonar los fragmentos PCR con el tamaño esperado en el vector T-easy y la secuencia para confirmar la presencia de una secuencia parcial del vector objetivo.

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Resultados

En este trabajo se describe un protocolo detallado de Southern blot y de PCR, que se utiliza para identificar eventos de HR que se produjeron en las células ES de ratón para la generación de modelos de ratón de recambio genético NM II, tecnología ES basada en células mediada por recursos humanos dirigidos a. Aunque borrar meridional y PCR, así como técnica de gene targeting tradicional, ha sido ampliamente utilizado desde hace varias décadas, la aplicación exitosa de ellos debe ser planea...

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Discusión

En la actualidad, diseñador nucleasas para la edición del genoma todavía no pueden reemplazar ES célula gene targeting tecnología debido a sus problemas de efectos off-target y dificultad en la inserción de un ADN largo fragmento30,31. Como los métodos de oro para identificar eventos de HR que se producido en células de ratón ES, este informe proporciona un protocolo detallado de Southern blot y de PCR para el campo. Validamos la fiabilidad de estos métodos media...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo recibió apoyo del Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (subvenciones no. 31571432), el humano Provincial Ciencias naturales Fundación de China (Grant No. 2015JC3097) y la investigación Fundación de Educación Oficina de Hunan Provincia, China (Grant no. 15 K 054).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CLON DE BACCentro de Recursos de BACPAC (BPRC)BMQ-330E21
QIAGEN Kit de construcción grandeQIAGEN12462
QIAquick Kit de extracción de gelQIAGEN28704
QIAquick Kit de purificación de PCRQIAGEN28104
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27104
QIAGEN Plasmid Plus Maxi KitQIAGEN12963
PfuUltra Alta Fidelidad ADN PolimerasaAgilent600382
Vector T-easyPromegaA1360
Solución de lisis de núcleosPromegaA7941
Solución de precipitación de proteínasPromegaA7951
Solución desnaturalizante de ADNVWR351-013-131
Solución neutralizante de ADNVWR351-014-131
Perlas de etiquetado de ADN listas para usar (-dCTP)VWR27-9240-01
UltraPure SSC, 20xThermo Fisher15557036
UltraPur Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1, v/v)Thermo Fisher15593031
G418Thermo Fisher10131035
Solución de ADN de esperma de salmónThermo Fisher15632011
Platinu Taq ADN polimerasa de alta fidelidadThermo Fisher11304029
Not IThermo ScientificER0592
Dra IThermo ScientificER0221
EcoR IThermo ScientificER0271
GanciclovirSigmaG2536
Whatman  Sistema de Transferencia TurboBlotter, Kits GrandesFisher Scientific09-301-188
[α 32P]dCTPPerkinElmerNEG013H100UC
ProbeQuan G-50 Micro ColumnasGE Healthcare28-9034-08
Hybrisol I Solución de hibridaciónMilliporeS4040
Kodak Película de rayos XZ& Z Médico844 5702

Referencias

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