Análisis de expresión génica de las células endoteliales expuestas a estrés mediante múltiples cámaras de placas paralelas flujo del esquileo

H.S. Jeffrey Man; Aravin N. Sukumar; Kyung Ha Ku; Michelle K. Dubinsky; Noeline Subramaniam; Philip A. Marsden

doi:10.3791/58478

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Análisis de expresión génica de las células endoteliales expuestas a estrés mediante múltiples cámaras de placas paralelas flujo del esquileo

8.8K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/58478

⸱

21 de octubre de 2018

H.S. Jeffrey Man¹^,² , Aravin N. Sukumar¹^,² , Kyung Ha Ku²^,³ , Michelle K. Dubinsky¹^,² , Noeline Subramaniam¹^,² , Philip A. Marsden¹^,²^,³^,⁴

¹Institute of Medical Science, University of Toronto, ²Keenan Research Centre in the Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital, ³Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, ⁴Department of Medicine, University of Toronto

En este artículo

Resumen

Aquí, se presenta un flujo de trabajo para el análisis de expresión cultura y genes de células endoteliales bajo tensión de esquileo líquido. Incluido es un arreglo físico para simultáneamente y monitoreo de múltiples cámaras de flujo en un entorno controlado y el uso de un RNA de referencia exógena para PCR cuantitativa.

Resumen

Se describe un flujo de trabajo para el análisis de la expresión génica de las células endoteliales sometidos a un constante flujo laminar utilizando múltiples cámaras monitoreadas flujo de placas paralelas. Las células endoteliales forman el revestimiento celular interno de los vasos sanguíneos y están crónicamente expuestas a la fuerza de fricción del flujo de sangre llamado tensión de esquileo. En condiciones fisiológicas, la función de las células endoteliales en presencia de varias condiciones de esfuerzo cortante. Por lo tanto, la aplicación de las condiciones de tensión de esquileo en vitro modelos permiten comprender mejor una mayor respuesta endotelial in vivo. La cámara de placas paralelas flujo previamente publicada por Lane et al. ⁹ se adapta para estudiar la regulación de los genes endoteliales en presencia y ausencia de flujo laminar (no pulsátil) constante. Adaptaciones claves en la configuración para flujo laminar como se presenta aquí incluyen un entorno grande, dedicado a los circuitos de flujo concurrente de la casa, el control de caudales en tiempo real y la inclusión de una referencia exógena RNA para la normalización de datos cuantitativos de PCR en tiempo real. Para evaluar varias condiciones de tratamientos con la aplicación de la tensión de esquileo, múltiples circuitos de flujo y bombas se utilizan simultáneamente en la misma incubadora calentada y humidificada. El caudal de cada circuito de flujo se mide continuamente en tiempo real a estandarizar las condiciones de esfuerzo cortante a lo largo de los experimentos. Debido a estos experimentos tienen condiciones múltiples, también utilizamos un RNA de referencia exógena que se enriquecieron en el momento de la extracción de RNA para la normalización de la extracción de RNA y la eficiencia de síntesis de primera-strand cDNA. Estos pasos minimizan la variabilidad entre las muestras. Esta estrategia se emplea en nuestros proyectos para el análisis de expresión génica con tensión de esquileo experimentos usando la cámara de flujo paralelo de la placa, pero partes de esta estrategia, como la exógena de referencia punto de RNA, pueden fácilmente y rentable utilizadas para otras aplicaciones.

Introducción

Las células endoteliales vasculares forman la guarnición celular interna de los vasos sanguíneos en el sistema cardiovascular cerrado de especies mayores. Forman la interfaz entre la sangre y los tejidos y se caracterizan por luminal y abluminal superficies. El endotelio es un sistema diverso, activo y adaptativo que regula el flujo de sangre, trata de nutrientes, inmunidad y el crecimiento de los vasos de sangre nueva¹. En el cuerpo, las células endoteliales existen normalmente en un entorno donde están expuestos a la fuerza friccional de la circulación, tensión de cizalla². Tensión de esquileo es un importante regulado....