Artículo de método

Visualización en tiempo real y análisis de la lesión de condrocitos debido a cargas mecánicas en explantes de cartílago murino intacta

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DOI:

10.3791/58487

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7 de enero de 2019

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1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

En este artículo

Resumen

Se presenta un método para evaluar la extensión espacial de las lesiones o la muerte de la célula en la superficie articular de articulaciones murinas intactas después de la aplicación de cargas mecánicas controladas o impactos. Este método puede utilizarse para investigar cómo osteoartritis, factores genéticos o los regímenes de carga diferentes afectan la vulnerabilidad de los condrocitos en situ .

Resumen

La homeostasis del cartílago articular depende de la viabilidad de las células residentes (condrocitos). Lamentablemente, trauma mecánico puede inducir la muerte de condrocitos generalizada, puede conducir a la ruptura irreversible de la articulación y la aparición de la artrosis. Además, el mantenimiento de la viabilidad de los condrocitos es importante en los procedimientos de injerto osteocondral de resultados quirúrgicos óptimos. Se presenta un método para evaluar la extensión espacial de las lesiones o la muerte de la célula en la superficie articular de las articulaciones sinoviales murinas intactas después de la aplicación de cargas mecánicas controladas o impactos. Este método puede utilizarse en estudios comparativos para investigar los efectos de los regímenes de cargas mecánicas diferentes, diferentes condiciones ambientales o manipulación genética, así como diferentes etapas de la degeneración del cartílago en corto o a largo plazo vulnerabilidad de los condrocitos articulares in situ. El objetivo del protocolo presentado en el manuscrito es evaluar la extensión espacial de las lesiones o la muerte de la célula en la superficie articular de las articulaciones sinoviales murinas. Importante, este método permite la prueba en el cartílago completamente intacto sin comprometer condiciones nativas. Además, permite la visualización en tiempo real de los condrocitos articulares tinción vital y único análisis basado en imágenes de la lesión celular inducida por la aplicación de static control y regímenes de carga de impacto. Nuestros resultados representativos demuestran que en explantes de cartílago sano, la extensión espacial de la lesión de la célula depende de sensible intensidad de magnitud y el impacto de carga. Nuestro método puede adaptarse fácilmente para investigar los efectos de los regímenes de cargas mecánicas diferentes, diferentes condiciones ambientales o diferentes manipulaciones genéticas de la vulnerabilidad de la mecánica de en situ condrocitos articulares.

Introducción

Cartílago articular (CA) es una tejido que recubre y protege los huesos en las articulaciones sinoviales, proporcionando suave articulación conjunta de carga. Homeostasis del tejido depende de la viabilidad de los condrocitos, el tipo de célula única que reside en la CA. Sin embargo, exposición del cartílago a fuerzas extremas debido al trauma (p. ej., cataratas, lesiones accidente o deportes) o debido a la inestabilidad postraumática de la articulación puede inducir la muerte de condrocitos, conduciendo a la degradación irreversible de la articulación (artrosis) 1. Además, en osteocondral procedimientos que tienen por objeto reparar los defectos locales en cartílago dañado de injertos, trauma mecánico asociado de inserción del injerto reduce la viabilidad de los condrocitos y tiene efectos perjudiciales en los resultados quirúrgicos2.

Modelos de explantes de cartílago se utilizan para estudiar la susceptibilidad de los condrocitos articulares a la muerte celular inducida mecánicamente. Estos modelos normalmente utilizan explantes de animales grandes para estudiar los efectos de carga de las condiciones, las condiciones ambientales y otros factores celulares vulnerabilidad3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Sin embargo, debido al gran tamaño de las articulaciones nativas, estos modelos generalmente requieren remoción del tapón de la superficie articular de una articulación intacta, tal modo comprometer condiciones nativas de. Por otra parte, generalmente necesitan de aplicación de cargas mecánicas grandes para inducir lesión de la célula. Por otra parte, cartílago murino explante modelos ofrecen varias ventajas sobre los modelos animales más grandes en el estudio de la vulnerabilidad mecánica de condrocitos en situ . En particular, debido a sus dimensiones más pequeñas, estos modelos facilitan pruebas del cartílago articular intacta sin alterar la integridad del tejido propio. Además, carga del cartílago murino se produce en pequeñas áreas de contacto tales que la muerte, lesión de condrocitos puede ser inducida con cargas pequeñas (< 1 N). Por último, el genoma del ratón es manipulado fácilmente, permitiendo pruebas de impacto cómo específico de genes de la susceptibilidad de los condrocitos en situ a lesión mecánica.

El objetivo general del método introducido en este manuscrito es cuantificar y visualizar en real-time-la extensión espacial de situ en muerte/lesión de la célula debido a cargas mecánicas aplicadas en ratón intacta cartílago en hueso de explantes in vitro. Este método requiere la disección cuidadosa de articulaciones sinoviales ratón sin comprometer la viabilidad de condrocitos, seguido de ensayos mecánicos de los explantes vital manchados usando un microscopio montado dispositivo similar a una plataforma de pruebas que recientemente desarrollados cuantificar murino cartílago propiedades mecánicas16. Durante la prueba mecánica, una gran parte de la superficie articular (intacta) del hueso disecado es visible en una micrografía de fluorescencia sola, lo que permite un análisis rápido de la viabilidad celular después se aplica una carga. Un análisis similar de la viabilidad de la superficie celular en explantes de cartílago murino se ha realizado previamente, pero sin el uso simultáneo de carga17. Posibilidades de aplicación de nuestro método incluyen estudios comparativos para investigar la vulnerabilidad de los condrocitos articulares a diferentes condiciones ambientales y mecánicas controladas, así como la investigación de tratamientos para reducir la sensibilidad de los condrocitos a la carga mecánica.

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Protocolo

Todos los trabajos de animales fue aprobado por el Comité de la Universidad de Rochester sobre los recursos.

1. las soluciones

  1. Preparar la solución salina balanceada de Hank (HBSS de X 1) que contiene calcio, magnesio y sin rojo fenol. Ajustar el pH a 7.4 mediante la adición de pequeñas cantidades de HCl o NaOH.
  2. Adición de NaCl o agua desionizada para ajustar la osmolaridad a 303 mOsm. Utilizar el búfer durante las disecciones, preparación de muestras y ensayos mecánicos.

2. disección del fémur Distal y húmero Proximal con cartílago Articular intacta

  1. Eutanasia el ratón según las pautas del uso de una cámara de inhalación de CO2 seguida por dislocación cervical. Seguir una técnica aséptica en todo.
    Nota: Pueden utilizarse ratones entre 81 y 8 semanas de edad de cualquier tensión y sexo.
  2. Utilice las siguientes herramientas quirúrgicas para disecciones: micro tijeras (utilizados para hacer incisiones), tijeras de disección estándar (utilizados para el corte del hueso), bisturí # 11 hoja de bisturí (utilizado para el tejido suave de corte), pinzas de joyero (utilizados para la eliminación de soft tejido) y pinzas estándar (utilizados para pelar la piel y el tejido blando).
  3. Siga estas instrucciones para disecciones del fémur distal .
    1. Coloque el ratón en una posición supina.
    2. Haga una incisión pequeña (~ 5 mm) en la piel en la porción anterior de la rodilla.
    3. Ampliamos la incisión todo el camino alrededor de la rodilla y tire hacia atrás la piel para dejar al descubierto los músculos de la articulación y de la pierna de rodilla.
    4. A partir del extremo proximal del fémur, utilice una hoja de bisturí (#11) para cortar en la dirección distal. Posición de la hoja entre la unidad músculo-tendón de cuadriceps y la parte anterior del eje femoral. Extiende el corte hacia y más allá de la rótula y termine cortando por en medio del tendón rotuliano, eliminando la unidad músculo-tendón de cuadriceps.
    5. A partir del extremo proximal del fémur, utilice una hoja de bisturí (#11) para cortar en la dirección distal. Coloque la lámina entre el tendón de músculo del tendón de la corva y la parte posterior del eje femoral. Una vez que la corte acerca a la articulación de la rodilla, empezar a cortar a través del tejido blando, evitando el contacto entre el bisturí y la superficie articular de los cóndilos distales del fémur. Acabado el corte más allá de la articulación de la rodilla.
    6. Tire hacia atrás el cuádriceps y el tendón de la corva músculos para exponer el fémur. Corte cualquier exceso muscular en los lados laterales y mediales del fémur.
    7. Cortar el músculo de la pantorrilla en el lado posterior de la tibia proximal y girar la pierna para visualizar la parte posterior del fémur.
    8. Exponga los cóndilos distales del fémur y la superficie posterior de la tibia proximal mediante la eliminación de exceso de tejido alrededor de la articulación de la rodilla.
    9. Corte de los ligamentos cruzados anteriores y posteriores con un bisturí, cortando lejos de los cóndilos femorales. Tire de la tibia del fémur y cortar todos los ligamentos para separar el fémur de la pierna más baja.
    10. Usando las tijeras de disección estándar, cortar a través el fémur en el extremo proximal del hueso (8 mm por encima de la articulación femoral tibio-femorales) desde el lado lateral . Después de cortar el hueso, limpie cualquier médula ósea visible en la parte exterior del hueso para evitar la posible contaminación de células de médula ósea.
      Nota: Corte de lado lateral reduce el riesgo de propagación de la grieta a lo largo del hueso.
    11. Eliminar alrededor de los tejidos blandos (es decir, ligamentos y músculo sobrante) de fémur con unas pinzas de joyero y exponer el cartílago en ambos cóndilos en el extremo distal del fémur. Evite el contacto entre el cartílago y el fórceps.
  4. Para disecciones del húmero siga las siguientes instrucciones.
    1. Coloque el ratón en una posición supina.
    2. Hacer una incisión (~ 5 mm) en la piel en el lado posterior del codo con micro tijeras, extender la incisión alrededor del codo y tire hacia atrás la piel para dejar al descubierto los músculos del brazo y del hombro.
    3. A partir del extremo proximal del húmero, utilice una hoja de bisturí (#11) para cortar en la dirección distal. Coloque la lámina entre el tendón del músculo tríceps y el lado posterior del húmero. Extiende el corte hacia el extremo distal del húmero y terminar cortando a través del tendón del tríceps.
    4. Entonces tire el tríceps hacia el extremo proximal del húmero hasta que la cabeza humeral está expuesta.
    5. Cortar el tejido conectivo alrededor de la cabeza humeral con una hoja de bisturí (#11) sin tocar la superficie articular y eliminar del cuerpo el miembro (brazo y hombro). Periódicamente hidratar la superficie articular de la cabeza humeral con HBSS.
    6. Desconecte el húmero del brazo por primera rompiendo el extremo proximal del cúbito en la parte posterior del brazo con unas pinzas y luego corte el tejido conectivo alrededor del extremo distal del húmero. Retire cualquier exceso de tejido en el húmero.
    7. Corte la tuberosidad deltoide del lado posterior del húmero con tijeras de disección estándar.
  5. Coloque la muestra disecada en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con tampón HBSS.

3. vivo (calceína AM) / muertos (yoduro de propidio) protocolo de tinción

  1. Mancha con calceína AM como sigue.
    1. Hacer una solución madre de calceína AM añadiendo 12.5 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) en un frasco de 50 μg de calceína AM, dando por resultado una concentración stock de 4 mg/mL (4,02 mM).
    2. Diluir la solución de calceína stock 1: 400 en HBSS para llegar a una concentración de 10 μg/mL (10.05 μm) de calcio AM (por ejemplo, agregar 1.25 μl de la solución madre en 500 μl de HBSS).
    3. Centrifugue la solución diluida de tinción durante 5 s a 2.000 x g para asegurar que todo el tinte, que en ocasiones puede pegarse a las paredes del tubo, se mezcla con el buffer. No retire el sobrenadante. La solución para asegurar una mezcla adecuada de vórtice.
    4. Colocar al espécimen disecado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL conteniendo 500 μl de la solución diluida de tinción. Incubar a la muestra a 37 ° C por 30 min en un Termomezcladores mientras agita a 800 rpm. Asegúrese de que los tubos están cubiertos en papel de aluminio para proteger de la exposición a la luz.
    5. Transferir a la muestra en tampón HBSS AM-libre de calceína. En este punto, la muestra está lista para pruebas mecánicas.
  2. Preparación de yoduro de propidio (PI) solución de tinción como se indica a continuación.
    1. Preparar solución de tinción por dilución de la solución stock comprado (1 mg/mL, 1, 5 mM) 1:25 en HBSS a 40 μg/mL (60 μm) de PI PI. Por ejemplo, agregar 40 μl de la solución madre de 1000 μl de HBSS.
    2. Mantenga el PI tinción solución cubierto en papel de aluminio para protegerlo de la exposición a la luz. Utilizar una solución de tinción inmediata después de la prueba mecánica para detectar las células dañadas (ver sección 4).
      Nota: Se puede realizar la tinción de PI antes de cargar así evaluar más rigurosamente la calidad de las disecciones.

4. mecánica protocolo de pruebas

  1. Coloque al espécimen (fémur o húmero) sobre el portaobjetos de cristal de un personalizado montado en microscopio mecánico dispositivo tal que la superficie articular del cóndilo femoral posterior o cabeza humeral está sentado sobre el vidrio (figura 1).
    Nota: Fije un aplicador de madera 10 mm de longitud (diámetro = 2 mm) hasta el lado distal del húmero con el pegamento del cianocrilato antes de colocarla en el dispositivo para estabilizar la muestra sobre la superficie plana. Para una descripción detallada de la plataforma de pruebas mecánica ver archivo complementario 1: sección 1.
  2. Hidratar a la muestra con HBSS y coloque el dispositivo con la muestra en un microscopio de fluorescencia.
  3. Imagen de los condrocitos articulares teñidos con calceína AM (longitudes de onda de excitación/emisión = 495/515 nm) antes de aplicación (línea base) de la carga bajo un microscopio de fluorescencia con un 4 X lente en seco (NA = 0,13). Ajustar los parámetros de adquisición para optimizar la calidad de imagen.
  4. Aplique de carga mecánica sobre la muestra tal que el cartílago articular se comprime contra el vidrio de la cubierta.
    1. Para la carga estática, se aplica una carga estática prescrita (e.g., 0.5 N) en la parte superior del espécimen (fémur o húmero). Sostener la carga durante 5 minutos y luego retírela.
    2. Impacto, aplicar una energía de impacto prescritas (e.g., 1 mJ) sobre la muestra dejando caer un impactador cilíndrico de peso conocido (por ejemplo, 0.1 N) desde una altura prescrita (por ejemplo, 1 cm). Liberar la carga 5 s después del impacto.
      Nota: El peso del impactador (mg) y la altura prescrita (h) se puede convertir en energía del impacto (E) utilizando la siguiente ecuación: E = mgh.
  5. Incubar a la muestra en solución por 5 min a temperatura ambiente la coloración de la PI.
  6. Imagen de los condrocitos articulares teñidos con calceína AM y PI (longitudes de onda de excitación/emisión = 535/617 nm) bajo un microscopio de fluorescencia (figura 2).

5. Análisis de datos

  1. Cuantificar el área de células muertas o lesionadas por el régimen de la carga mecánica aplicada.
    1. Abrir las micrografías de la superficie articular adquirido antes y después de la aplicación de la carga mecánica en ImageJ18.
    2. Combinar las imágenes en una pila.
    3. Establecer la escala de las imágenes basado en la resolución de imagen.
    4. Utilice la herramienta polígono para definir el área donde las células se convirtieron calceína-negativo (pérdida de fluorescencia verde) y PI-positivo (aumento de fluorescencia roja). Estas células se consideran lesionados o muertos.
    5. Determinar el área de células muertas o heridas usando la herramienta de medición .

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Resultados

Seis diferentes aplicación protocolos de carga (carga estática: 0.1 N, 0.5 N y 1 N por 5 min; y carga de impacto: 1 mJ y 2 mJ mJ 4) reproducible inducida cuantificables áreas localizadas de lesión celular en el cartílago femoral y humeral obtenido (ratones BALB/c) 8-10 semanas de edad Figura 2). Lo importante es la extensión espacial de la lesión de condrocitos en la superficie articular se midió rápidamente y fácilmente en ImageJ. Resultados representativos ...

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Discusión

Los métodos descritos anteriormente se emplearon con éxito para visualizar viable y heridos o muertos en situ condrocitos articulares de las articulaciones del ratón después de prescribir cargas mecánicas o impactos. En particular, hemos sido capaces de analizar la vulnerabilidad mecánica de condrocitos en el cartílago articular intacta de dos articulaciones sinoviales diferentes: la articulación de la rodilla (fémur distal) y hombro (Húmeros). Nuestros resultados representativos muestran que la extensión espaci...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Dr. Richard Waugh y Luis Delgadillo el uso abundante de su medidor de pH y osmómetro. Además, los autores desean agradecer a Andrea Lee por contribuir al desarrollo inicial del mecánica del sistema de prueba. Este estudio fue financiado por los NIH P30 AR069655.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Calceína, AM Invitrogen de Thermo Fisher ScientificC3100MP20x50mg , Eugene, OR, USA
Yoduro de propidioInvitrogen de Thermo Fisher ScientificP35661 mg/mL solución en agua, 10mL, Eugene, OR, USA
Dimethyl sulfóxido (DMSO)Sigma-Aldrich2768551L DMSO, anhidro, ≥ 99.9%, St. Louis, MO, EE. UU.
HBSS (calcio, magnesio, sin rojo fenol)  Gibco by Thermo Fisher Scientific14025-0921X, 500 ml, Grand Island, NY, EE. UU
Cuchilla quirúrgica de plumas (#11)VWR102097-822Hatfield, PA, EE. UU
Osmómetro de presión de vapor, VAPROELITechGroupModelo 5520Puteaux, Francia
Medidor de pH Modelo BeckmanPhi 32 Brea, CA, EE. UU.
Termomezclador Eppendorf Eppendorf AG Modelo 5350Hamburgo, Alemania
Microscopio de investigación invertido motorizadoOlypmusModelo IX-81Center Valley, PA, EE. UU.
Aplicador de maderaPuritan Medical Products Company, LLC8076"x100, Guilford, ME, EE. UU.
1.5 Cubreobjetos de vidrioWarner Instruments, LLC64-1696#1.5, 0.17 mm de grosor, 40 mm de diámetro, Hamden, CT, EE. UU.
. .

Referencias

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