Artículo de método

Técnicas de microescala Phenotyping de maíz haces vasculares basados en tomografía de rayos x Microcomputed

DOI:

10.3791/58501

⸱

9 de octubre de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Lab of Digital Plant, Beijing Research Center for Information Technology in Agriculture, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Ofrecemos un novedoso método para mejorar el contraste de la absorción de rayos x del maíz tejido adecuado para la exploración de la tomografía de la microcomputed ordinaria. Basado en imágenes del CT, presentamos un conjunto de flujos de trabajo de procesamiento de imágenes para diferentes materiales de maíz extraer efectivamente fenotipos microscópicos de haces vasculares del maíz.

Resumen

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Es necesario cuantificar con precisión las estructuras anatómicas de maíz materiales basados en técnicas de análisis de imagen de alto rendimiento. Aquí, ofrecemos un 'protocolo de preparación de muestra' para materiales de maíz (es decir, tallo, hoja y raíz) convenientes para los microcomputed exploración de la tomografía (micro-CT). Basado en imágenes de alta resolución CT de tallo, hoja y raíz, Describimos dos protocolos para el análisis fenotípico de los haces vasculares: (1) basado en la imagen de CT de tallo y hoja, hemos desarrollado una tubería de análisis de imagen específica para extraer automáticamente 31 y 33 rasgos fenotípicos de haces vasculares; (2) basado en la serie de imagen de CT de maíz raíz, configurar un esquema de procesamiento de imagen para la segmentación (3D) tridimensional de los vasos metaxylem y extrae dos dimensiones (2-D) y 3-d características fenotípicas, tales como volumen, superficie de embarcaciones metaxylem, etc. En comparación con la medición manual tradicional de haces vasculares de materiales de maíz, los protocolos propuestos mejoran significativamente la eficiencia y la exactitud de la cuantificación fenotípica de la escala del micrón.

Introducción

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El sistema vascular maíz recorre toda la planta, de la raíz y el tallo a las hojas, que forma las rutas de transporte clave para la entrega de agua, nutrientes minerales y sustancias orgánicas1. Otra función importante del sistema vascular es proporcionar soporte mecánico para la planta de maíz. Por ejemplo, la morfología, número y distribución de haces vasculares en raíces y tallos están estrechamente relacionados con la resistencia del alojamiento de plantas de maíz2,3. En la actualidad, estudios sobre la estructura anatómica de haces vasculares utilizan principalmente microscópicas y ultramicroscópicos técnicas para visualizar las estructuras anatómicas de una cierta parte del tallo, hoja o raíz y luego medir y contar estas estructuras de interés por la investigación manual. Sin duda, medición manual de diferentes estructuras microscópicas en microfilmes a gran escala es un trabajo muy tedioso e ineficiente y limita seriamente la precisión de microphenotypic rasgos, debido a su subjetividad y la inconsistencia4, 5.

Maíz no tiene crecimiento secundario, y el contenido de la celda consiste esencialmente de agua en el meristemo primario. Sin ningún tratamiento previo, muestras frescas de tejidos de maíz pueden ser directamente escaneadas utilizando un dispositivo micro-CT; sin embargo, los resultados del análisis son probablemente pobre y áspero. Las razones principales se resumen a continuación: las densidades de atenuación baja (1) de los tejidos de la planta, resultando en un bajo contraste de número atómico y alto nivel de ruido en imágenes; (2) materiales vegetales fresco son propensos a deshidratarse y encogimiento durante el ambiente exploración normal, según Du6. Los problemas antes mencionados se han convertido en las principales limitaciones para el desarrollo y aplicación de la tecnología de microphenotyping de maíz, trigo, arroz y otras monocotiledóneas. Aquí, presentamos el 'protocolo de preparación de muestra' a pretratar las muestras de tallo, hoja y raíz. Este protocolo evita la deshidratación y la deformación de materiales vegetales durante la CT exploración; por lo tanto, es beneficioso aumentar el tiempo de conservación de muestras de plantas con nondeformation. Por otra parte, el paso tintura basado en yodo sólido también mejora el contraste de materiales vegetales; así, hace mejoras significativas en la calidad de imagen de micro-CT. Además, desarrollamos software de procesamiento de imagen, llamado VesselParser, para procesar las imágenes del CT de maíz tallos y hojas. Este software integra un conjunto de tuberías de proceso de imagen para realizar análisis phenotyping automáticas y de alto rendimiento para imágenes del CT 2-D de los tejidos vegetales diferentes. Haces vasculares en la sección representativa entera del tallo y hoja se detectan, extraído e identificado utilizando un método automático de procesamiento de imágenes. Como resultado, obtenemos 31 fenotipos microscópicos de la espiga de maíz y 33 fenotipos microscópicos de la hoja de maíz. Para la serie de imagen del CT de la raíz del maíz, se desarrolló un sistema de procesamiento de imágenes para adquirir rasgos fenotípicos 3D de vasos metaxylem. Este esquema es superior en eficiencia de adquisición de imágenes y reconstrucción en comparación con los métodos tradicionales.

Estos resultados indican que la imagen de proceso tuberías teniendo en cuenta que las proyección de imagen características de ordinario rayos x micro-CT proporcionan un método eficaz para el fenotipado microscópica de haces vasculares; Esto extremadamente amplía las aplicaciones de las técnicas de TAC en ciencia de planta y mejora el fenotipado automático de materiales vegetales en resolución celular6,7.

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Protocolo

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1. muestra preparación protocolo

  1. Para la toma de muestras, recoger el tallo, hoja, raíz de plantas de maíz frescas y dividirlas en tres tipos de muestra grupos (cada grupo con cuatro repeticiones). Luego, cortar en pequeños segmentos utilizando una cuchilla quirúrgica de la siguiente manera: (1) cortar un segmento del medio entrenudo del tallo 1-1.5 cm de longitud; (2) cortar un segmento de la anchura máxima de la hoja de 0,5 - 3 cm de longitud a lo largo de la dirección vertical con la vena principal; (3) cortar un segmento de la raíz corona 0,5 cm de longitud.
  2. Para la fijación de la FAA, remoje los segmentos de la muestra en una solución de FAA (90:5:5 v/v/v, 70% etanol: 100% formaldehído: 100% ácido acético) para al menos 3 d.
  3. Realizar el procedimiento de deshidratación en seis gradientes de etanol secuencial (es decir, 30%, 50%, 70%, 85%, 95% y 100%) y establecer el tiempo de procesamiento de cada gradiente de etanol como 30 min.
  4. Colocar los materiales de planta en los correspondientes cestos muestra fabricados mediante una impresora 3-d; a continuación, transferir rápidamente las cestas de la muestra a la celda de muestra de un sistema de secado de punto crítico de2 de CO. Configurar los parámetros de secado como sigue:
    1 CO2 : velocidad rápida. Rellenos de titular: 100%.
    (2) cargo: CO2 carga demora 120 s en el ciclo. Cambio de velocidad: 5. número de ciclo: 12.
    (3) gas: calor, rápido. Velocidad: lento, 50%.
    1. Según las diferencias morfológicas de maíz raíz, tallo y hoja, cestas de muestra de diseño e impresión utilizando una impresora 3-d (p. ej., figura 1).
  5. Colocar los materiales de planta seca (maíz raíz tallo y hoja) en un tubo de centrífuga de 50 mL con 2 g de yodo sólido para teñir los materiales de planta con vapor de yodo volátil y, a continuación, coloque los tubos en un cuarto hermético para 4-5 h.

2. Protocolo de análisis micro-CT en

  1. Para analizar en los datos brutos de CT, establece el CT exploración parámetros como sigue: 40 kV/250 μA (de tallo y hoja) o 34 kV/210 mA (de raíz). El correspondiente análisis de rangos para los diferentes tamaños y volúmenes de los materiales de planta usados y ajuste los tamaños de pixel de imagen como sigue: 2.0 μm (para la raíz del maíz), 6.77 μm (para el tallo) y 10,0 μm (para la hoja de maíz).
  2. Para reconstruir imágenes, convertir los datos brutos de la TAC en imágenes con una resolución de 2K (2.000 x 2.000 píxeles) CT utilizando un software de reconstrucción de imagen. Más detalles se proporcionan en el Manual del usuario NRecon (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf).

3. imagen protocolo de análisis de una imagen de CT solo de un tallo o una hoja

Nota: Utilizar software de proyección de imagen automática para haces vasculares para llevar a cabo el análisis phenotyping de haces vasculares dentro de las imágenes de slice CT del tallo y hoja (figura 2). Los pasos de uso del software se describen a continuación.

  1. Nombrar el tipo de órgano para inicializar el algoritmo diferentes tuberías. Haga clic en el botón parámetros de método y seleccionar tallo u hojas de maíz en el primer cuadro de lista desplegable.
  2. Para importar las imágenes, haga clic en el botón de gestión de datos , configurar el directorio de trabajo y automáticamente todas las imágenes de slice en este directorio de importación. Seleccionar imágenes individuales o multi-slice en las tuberías de la imagen.
  3. Determinar el tamaño de píxel real de la imagen. Haga clic en el botón parámetros de método y entrar en el tamaño de píxel real de la imagen en el artículo de la edición del tamaño de píxel.
  4. Para el cómputo de phenotyping, pulse el botón de cálculo Phenotyping para extraer automáticamente los rasgos fenotípicos de los haces vasculares para todas las imágenes.
  5. Haga clic en el botón de análisis estadístico para los resultados de salida como un formato de archivo TXT o CSV.

4. imagen protocolo de análisis para la serie de imagen del CT de una raíz de maíz

Nota: La serie de imagen de CT de raíces de maíz se utiliza para extraer las estructuras 3D de vasos metaxylem utilizando software de procesamiento de imagen. Los pasos principales son los siguientes.

  1. Importar las imágenes reconstruidas de raíces de maíz (en formato BMP) y determinar los parámetros de espaciado exacto (el tamaño de un voxel [es decir, x, y, z]). Utilice la herramienta gaussiano de recursiva para suavizar estas imágenes para mejorar la calidad de imagen.
  2. Realizar segmentación 3D de vasos metaxylem ajustando los parámetros de umbral; Esto genera una etiqueta de color uniforme para cada buque metaxylem conectado.
  3. Mejorar e identificar los vasos de metaxylem interactivamente usando morfología, bit a bit y las operaciones de relleno de inundación.
  4. Realizar reconstrucción de superficie y visualización de volumen de los vasos. Utilice la herramienta de estadísticas de máscara para contar y medir los rasgos fenotípicos de un buque en los niveles 2D y 3D.

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Resultados

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El protocolo de preparación de muestra adecuado para el análisis de micro-CT en ordinario no sólo previene la deformación de los tejidos vegetales pero también mejora el contraste de la absorción de rayos x. Materiales de planta pretratados se analizan mediante un sistema de micro-CT en imágenes de alta calidad, y la resolución más alta puede alcanzar 2 μm/píxeles. La figura 4 muestra las imágenes micro-CT de tallo, hoja y raíz, y el contraste de la imagen ti...

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Discusión

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Con la aplicación exitosa de la tecnología de CT en los campos de la biomedicina y Ciencias de los materiales, esta tecnología se ha introducido gradualmente en los campos de la botánica y la agricultura, promoción de investigaciones en Ciencias de la vida vegetal como una herramienta técnica prometedora . A finales de 1990, CT tecnología primero fue utilizada para el estudio de las estructuras morfológicas y desarrollo de sistemas de la raíz de la planta. En la última década, sincrotrón TCAR se ha convertido en una herr...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Esta investigación fue apoyada por la nacional naturaleza ciencia Fundación de China (No.31671577), la ciencia y tecnología innovación especial construcción financiado por programa de Pekín Academia de agricultura y silvicultura Sciences(KJCX20180423), la investigación Programa de desarrollo de China (2016YFD0300605-01), la Fundación de Ciencias naturales de Beijing (5174033), el Beijing Postdoctoral de investigación Fundación (ZZ 2016-66) y la Academia de Pekín de la agricultura y silvicultura Ciencias Grant (KJCX20170404),) JNKYT201604).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Skyscan 1172 sistema de tomografía computarizada de rayos XBruker Corporation, BélgicaNAPara escaneo de TC
Sistema de secado de puntos críticos de CO2 (Leica CPD300)Leica Corporation, AlemaniaNAPara el secado de muestras
EtanolAnyNAFAA
FormaldehídoCualquierNAPara fijación de FAA
Acético ácidoCualquierNAPara la fijación de FAA
Cuchilla quirúrgicaCualquierNAPara cortar los sgements de la muestra
Impresora 3DMakerbot replicator 2, MakerBot Industries,USA NAPara imprimir las cestas de muestras de raíz, tallo y hoja de maíz Tubo de
centrífugaCorning, USANAColoque los materiales de la raíz, el tallo o la hoja
Yodo sólidoCualquierNAPara teñido de muestras
SkyScan Nrecon softwareSkyScan NRecon, Versión: 1.6.9.4, Bruker Corporation, BélgicaNAPara la reconstrucción de imágenes
Software VesselParserVesselParser, Versión: 3.0, Centro Nacional de Investigación de Ingeniería para Tecnología de la Información en la Agricultura (NERCITA), Pekín, ChinaNAProtocolo de análisis de imágenes para una sola imagen CT de tallo u hoja de maíz
ScanIPScanIP, versión: 7.0; Simpleware, Exeter, Reino UnidoNASoftware de procesamiento de imágenes 3D
Guantes de látexCualquieraNA
PinzasCualquierNA
Para fijación de

Referencias

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