Artículo de método

Análisis temporal de la translocación Nuclear-a-citoplásmico de una proteína del Virus 1 del Herpes simple por inmunofluorescencia microscopia Confocal

DOI:

10.3791/58504

⸱

4 de noviembre de 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Wayne State University

En este artículo

Resumen

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ICP0 sufre translocación nuclear-a-citoplásmico durante la infección de HSV-1. No se conoce el mecanismo molecular de este evento. Aquí describimos el uso de microscopio confocal como una herramienta para cuantificar el movimiento ICP0 infección por HSV-1, que establece las bases para el análisis cuantitativo de desplazamiento ICP0 en futuros estudios mecanicistas.

Resumen

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Proteína de la célula infectada 0 (ICP0) del virus del herpes simple 1 (HSV-1) es una proteína principios inmediata que contiene una anillo tipo E3 ubiquitina ligasa. Es responsable de la degradación proteasomal de factores restrictivos de host y la activación de genes virales subsecuentes. ICP0 contiene una secuencia canónica de localización nuclear (NLS). Entra en el núcleo inmediatamente después de la síntesis de novo y ejecuta sus funciones de defensa del huésped contra principalmente en el núcleo. Sin embargo, más adelante en la infección, ICP0 se encuentra exclusivamente en el citoplasma, lo que sugiere la ocurrencia de un desplazamiento nuclear-a-citoplásmico durante la infección de HSV-1. Probablemente ICP0 desplazamiento permite ICP0 modular sus funciones según sus localizaciones subcelulares en fases diferentes de la infección. Con el fin de delinear la función biológica y mecanismo regulador de translocación nuclear-a-citoplásmico ICP0, modificamos un método de microscopia inmunofluorescente para supervisar tráfico ICP0 durante la infección de HSV-1. Este protocolo trata de coloración inmunofluorescente, microscopio confocal imagen y nuclear vs distribución citoplásmica análisis. El objetivo de este protocolo es adaptar las imágenes confocales estado estacionario en un curso de tiempo en una documentación cuantitativa del movimiento ICP0 durante la infección lítica. Proponemos que este método se puede generalizar para analizar cuantitativamente nuclear vs localización citoplásmica de otras proteínas virales o celulares sin la participación de tecnología de imagen vivo.

Introducción

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Virus del herpes simple 1 (HSV-1) causa una amplia gama de leves a graves enfermedades herpéticas incluyendo herpes labial, herpes genital, encefalitis y queratitis stromal. Una vez infectado, el virus establece una infección latente de por vida en las neuronas de los ganglios. Ocasionalmente, el virus puede reactivarse por varios motivos como la fiebre, el estrés y la supresión inmune1, conduce a la infección por herpes recurrente. Proteína de la célula infectada 0 (ICP0) es un regulador viral clave crucial para lítica y latente la infección HSV-1. Transactivates virus aguas abajo genes por medio de contrarrestar el host intrínseca/innata defensas antivirales2,3. ICP0 tiene una actividad de ligasa de ubiquitina E3, que apunta a varios factores celulares de degradación proteasome-dependiente3. También interactúa con diversas vías de células para regular sus actividades y posteriormente compensar host antiviral restricciones3. ICP0 se sabe ubicar en diferentes compartimentos subcelulares como la infección procede de3,4,5. La proteína tiene una señal de arginina/lisina-ricos de localización nuclear (NLS) en residuos 500 a 5066. Sobre la síntesis de novo en la infección temprana por HSV-1, ICP0 se importa inmediatamente en el núcleo. Primero se detecta en una dinámica nuclear estructura denominado dominio nuclear 10 (ND10)7. La actividad de ligasa de ubiquitina E3 de ICP0 provoca la degradación de proteínas de organizador ND10, proteína de promyelocytic leucemia (PML) y proteína moteado 100 kDa (Sp100)8,9,10. Después de la pérdida de proteínas del organizador, ND10 cuerpos nucleares están dispersas y ICP0 se difunde para llenar el núcleo entero4,11.

Curiosamente, después del inicio de la replicación del DNA viral, ICP0 desaparece el núcleo. Únicamente se encuentra en el citoplasma, lo que sugiere la ocurrencia de un desplazamiento nuclear-a-citoplásmico en la infección de HSV-14,12. El requisito de la replicación del DNA implica la posible participación de una proteína viral finales para facilitar la translocación citoplásmica de HSV-1 ICP04,12. Al parecer ICP0 tráfico entre diferentes compartimentos durante la infección permite a ICP0 para modular sus interacciones a diversas vías celulares de una manera espacial y temporal, y por lo tanto coordinar sus múltiples funciones para ajustar el equilibrio entre la lítica y latente HSV-1 infección13. Para entender mejor ICP0 multifuncionalidad y la coordinación de dominios funcionales ICP0 durante la infección lítica, diseccionamos cuidadosamente la base molecular de la dinámica de desplazamiento ICP012. Para llevar a cabo el estudio de mecanismos previamente divulgados12, hemos aplicado un método de tinción inmunofluorescente para visualizar ICP0 localización subcelular en el estado de infección diferentes bajo el microscopio confocal. También hemos desarrollado un protocolo cuantitativo para analizar la nuclear vs citoplásmico distribución de ICP0 utilizando el software confocal. La población de células infectadas por HSV-1 se tabularon en las fases de la infección y se analizaron las tendencias de movimiento ICP0, bajo diferentes tratamientos bioquímicos12. Aquí describimos el protocolo detallado desplazamiento de documentos ICP0 en infección por HSV-1. Proponemos que este método puede ser adoptado como un método general para el estudio de la translocación citoplásmico nuclear vs otras proteínas virales o celulares, que puede servir como alternativa al vivo la proyección de imagen cuando la técnica de imagen vivo es inaplicable debido a problemas tales como etiquetado método, intensidad de la señal o abundancia de la proteína.

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Protocolo

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1. célula siembra y la infección del Virus

  1. A 20 – 24 h antes de la infección del virus de la semilla 5 x 104 células de fibroblastos de pulmón embrionario humano (HEL) o de otras células para examinar en un portaobjetos escalonadas 11 mm 4 pozos en medio de cultivo (de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10% bovino fetal suero (FBS)). Incube las células a 37 ° C con 5% dióxido de carbono (CO2).
    Nota: Cada bien debe tener confluencia de células de 70-80% en el momento de la infección.
  2. Al día siguiente, retire el medio de crecimiento e infectar las células con virus en medio 199 en un rango de 4 – 10 UFP/célula. Incube las células infectadas por virus por 1 h a 37 ° C. Seguir agitando la diapositiva durante el período de incubación.
  3. Después de la incubación de 1 h, quite medio 199 y complementar con medio de cultivo.
    Nota: Pueden añadirse fármacos que interfieren con las fases diferentes de la infección en este paso o antes de la absorción viral.
  4. Incube las células infectadas por el virus a 37 ° C con 5% CO2 para varias longitudes de periodo de infección.

2. fijación y permeabilización

  1. Adecuado de la infección, rápidamente lavar las células infectadas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 3 veces y añadir 200 μL de paraformaldehído al 4% recién preparado en PBS. Incubar las células con paraformaldehido para 8 – 10 min a temperatura ambiente para fijar las células en cada pozo.
  2. Paraformaldehido de aspirar y lavar los pocillos con 200 μL de PBS por 3 veces. Aspire completamente PBS después del lavado 3rd .
  3. Añada 100 μL de surfactante no iónico 0,2% a cada pocillo para permeabilizar las células durante 5 – 10 minutos.
  4. El tensioactivo no-iónico de aspirar y lavar los pocillos con 200 μL de PBS por 3 veces.

3. coloración inmunofluorescente

  1. Totalmente Aspire PBS y añadir 200 μL de solución amortiguadora de bloqueo (1% de albúmina sérica bovina (BSA) y 5% de suero equino en PBS) en cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 1 h o a 4 ° C durante la noche.
  2. Añadir determinado experimentalmente concentración de anticuerpo primario (conejo anticuerpos policlonales anti-ICP012) en solución amortiguadora de bloqueo e incubar anticuerpo primario a temperatura ambiente durante 2 h o a 4 ° C durante la noche.
  3. Lavar con solución amortiguadora de bloqueo 3 veces con 10 minutos de incubación. Añadir anticuerpo secundario de cabra 594 Alexa conjugado anti-conejo (diluida en solución amortiguadora de bloqueo 1: 400) e incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 1 h. Luego lavar los portaobjetos 3 veces con solución amortiguadora de bloqueo en el intervalo de 10 minutos.
  4. Finalmente Lave lo portaobjetos una vez con PBS para eliminar residuos de BSA y suero de caballo.
  5. Añada una gota de medio de montaje antifade con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para montar la corredera y sellar con cubreobjetos usando esmalte de uñas transparente.

4. confocal imagen

  1. Con un microscopio confocal, fijó la longitud de onda 590-650 nm para Alexa 594 y 410-520 nm para DAPI. Seleccionar formato de imagen en 1024 x 1024 y línea media de 8 para adquirir imágenes de alta resolución.
  2. Analizar cada pozo en la diapositiva 4 pozos microscopio confocal. Adquisición de imágenes representativas de la célula bajo el objetivo X 100, como se muestra en la figura 1 y figura 2.
  3. Para contar el gran número de células, tomar imágenes de campos consecutivos bajo el objetivo de X 40.
    Nota: Requieren 5 a 10 imágenes para acumular las células infectadas más de 200 de cada momento de cada infección.
  4. En cada experimento, tomar fotos con parámetros constantes confocales para toda necesidad de las muestras a comparar.

5. Análisis Nuclear vs distribución citoplásmica

  1. Proyecto abierto con el software de aplicación confocal. Seleccione una imagen de que las células necesitan ser tabulados para nuclear vs distribución citoplásmica de ICP0.
  2. Haga clic en la ficha "Cantidad" del menú superior y seleccionar "ordenar ROIs" del menú herramientas.
  3. Trace una línea longitudinal a través de la célula para ser analizadas por seleccionar "Dibujar línea" del menú superior.
    Nota: Histograma aparecerá mostrando la intensidad de fluorescencia a lo largo de la línea para ICP0 y DAPI. En el histograma, línea azul representa los píxeles DAPI y marca el límite del núcleo mientras que la línea roja representa ICP0 píxeles.
  4. Basado en la tinción de fondo, establecer un umbral constante de intensidad ICP0 analizar distribución subcelular ICP0 en cada experimento.
    1. Como se ejemplifica en figura 2, si el rojo señal en promedio está por debajo del umbral de la región nuclear pero es por encima del umbral más allá del límite azul, categorizar la señal rojo como predominante se encuentra en el citoplasma.
    2. Si la señal roja está por encima del umbral a lo largo del núcleo y más allá del límite de la señal azul, grupo la señal roja como núcleo más localización citoplásmica.
    3. Si la señal roja está por encima del umbral en el núcleo pero en promedio está por debajo de ella fuera de los límites de la señal azul, grupo la señal roja como localización nuclear.
  5. Tabular las células infectadas más de 200 de cada muestra en el tiempo de infección diferentes y parcela en gráfico de barras para ilustrar ICP0 movimiento según el tiempo (figura 3).

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Resultados

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Para entender la base molecular y funciones biológicas de la ICP0 se trata durante la infección de HSV-1, utilizamos un método de microscopia inmunofluorescente para analizar distribución subcelular ICP0 en fases diferentes de la infección. La figura 1 muestra las células representativas con distintivo ICP0 localización conforme avanza la infección. Para cuantificar la translocación nuclear-a-citoplásmico de ICP0, analizamos ICP0 distribución en relación con ...

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Discusión

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Este protocolo se ha utilizado para el estudio de la translocación nuclear-a-citoplásmico de ICP0 HSV-1. ICP0 sufre tráfico subcelular durante la infección por HSV-1 (figura 1). Probablemente, ICP0 interactúa con diversas vías de la célula para llevar a cabo diferentes funciones en diferentes lugares. Esto permite ICP0 a la consonancia fina sus múltiples funciones en el tira y afloja con el huésped humano13. Sin embargo, cómo ICP0 coordina las múltiples funciones de u...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos el apoyo financiero de una subvención del NIH (RO1AI118992) concedida a Haidong Gu. Agradecemos a la instalación de microscopía, la proyección de imagen y base de recursos de citometría (MICR) en Wayne State University para soporte técnico.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
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fibroblastos de pulmón embrionario humano (células HEL)Dr. Thomas E. Shenk (Universidad de Princeton)células HEL se cultivaron en DMEM suplementadas con un 10% de
FBS HSV-1 viral (cepa F)Dr. Bernard Roizman Lab
medio< fuerte>
Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM)Invitrogen  11965-092
Suero Fetal Bovino (FBS)SigmaF0926-500ml
Medium-199 (10x)Gibco11825-015
Reactivos
4- pozo 11 mm corredera escalonadaCel-Line/Thermofisher Scientific  30-149H-NEGRO
16% Solución de paraformaldehído (con v/v) Libre de metanolThermo Scientific28908
Triton X-100Reactivos FisherBP151-1C0
Suero bovino Abumin (BSA)CalbiochemCAS 9048-46-8
Suero de caballoSigmaH1270
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)Dr. Haidong Gu laboratorio
NaCl           Biorreactivode Fisher BP358-212
KH2PO4                       Biorreactivo de FisherBP362-500
KCl                         Fisher Scientific BP366-500
Na2HPO4                         Fisher BioreagentBP332-500
Tampón de bloqueo (PBS con 1% de BSA y 5% de suero de caballo)Dr. Haidong Gu lab
Rabiit Anti-ICP0 anticuerpo. Haidong Gu lab
PML (PG-M3)-IgG monoclonal de ratónsanta Cruz BiotechnologySC-966
Alexa Fluor 594-cabra anti-conejoIgg invitrogenA11012
Alexa Fluor 488-cabra anti-ratón IgGinvitrogenA11001
Vectashield Medio de mouting con DAPILaboratorios vectorialesH-1200
Pipeta PasteurFisher Brand13-678-20D
Esmalte de uñasSally Hansen
Equipment
Confocal MicroscopioLeica SP8
Confocal SoftwareLeica LAS X Conjunto
Software Excel MicrosoftExcel
HERAcell 150i Incubadora CO2Thermo ScientificCódigo de pedido 51026282
Las Drde aplicaciones

Referencias

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