ICP0 sufre translocación nuclear-a-citoplásmico durante la infección de HSV-1. No se conoce el mecanismo molecular de este evento. Aquí describimos el uso de microscopio confocal como una herramienta para cuantificar el movimiento ICP0 infección por HSV-1, que establece las bases para el análisis cuantitativo de desplazamiento ICP0 en futuros estudios mecanicistas.
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Artículo de método
Análisis temporal de la translocación Nuclear-a-citoplásmico de una proteína del Virus 1 del Herpes simple por inmunofluorescencia microscopia Confocal
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Resumen
Resumen
Proteína de la célula infectada 0 (ICP0) del virus del herpes simple 1 (HSV-1) es una proteína principios inmediata que contiene una anillo tipo E3 ubiquitina ligasa. Es responsable de la degradación proteasomal de factores restrictivos de host y la activación de genes virales subsecuentes. ICP0 contiene una secuencia canónica de localización nuclear (NLS). Entra en el núcleo inmediatamente después de la síntesis de novo y ejecuta sus funciones de defensa del huésped contra principalmente en el núcleo. Sin embargo, más adelante en la infección, ICP0 se encuentra exclusivamente en el citoplasma, lo que sugiere la ocurrencia de un desplazamiento nuclear-a-citoplásmico durante la infección de HSV-1. Probablemente ICP0 desplazamiento permite ICP0 modular sus funciones según sus localizaciones subcelulares en fases diferentes de la infección. Con el fin de delinear la función biológica y mecanismo regulador de translocación nuclear-a-citoplásmico ICP0, modificamos un método de microscopia inmunofluorescente para supervisar tráfico ICP0 durante la infección de HSV-1. Este protocolo trata de coloración inmunofluorescente, microscopio confocal imagen y nuclear vs distribución citoplásmica análisis. El objetivo de este protocolo es adaptar las imágenes confocales estado estacionario en un curso de tiempo en una documentación cuantitativa del movimiento ICP0 durante la infección lítica. Proponemos que este método se puede generalizar para analizar cuantitativamente nuclear vs localización citoplásmica de otras proteínas virales o celulares sin la participación de tecnología de imagen vivo.
Introducción
Virus del herpes simple 1 (HSV-1) causa una amplia gama de leves a graves enfermedades herpéticas incluyendo herpes labial, herpes genital, encefalitis y queratitis stromal. Una vez infectado, el virus establece una infección latente de por vida en las neuronas de los ganglios. Ocasionalmente, el virus puede reactivarse por varios motivos como la fiebre, el estrés y la supresión inmune1, conduce a la infección por herpes recurrente. Proteína de la célula infectada 0 (ICP0) es un regulador viral clave crucial para lítica y latente la infección HSV-1. Transactivates virus aguas abajo genes por medio de contrarrestar el host intrínseca/in....
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Protocolo
1. célula siembra y la infección del Virus
- A 20 – 24 h antes de la infección del virus de la semilla 5 x 104 células de fibroblastos de pulmón embrionario humano (HEL) o de otras células para examinar en un portaobjetos escalonadas 11 mm 4 pozos en medio de cultivo (de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10% bovino fetal suero (FBS)). Incube las células a 37 ° C con 5% dióxido de carbono (CO2).
Nota: Cada bien debe tener confluencia de células de 70-80% en el momento de la infección. - Al día siguiente, retire el medio de crecimiento e infectar las células con virus en medio 199 en un rango de 4 – 10 UFP/....
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Resultados
Para entender la base molecular y funciones biológicas de la ICP0 se trata durante la infección de HSV-1, utilizamos un método de microscopia inmunofluorescente para analizar distribución subcelular ICP0 en fases diferentes de la infección. La figura 1 muestra las células representativas con distintivo ICP0 localización conforme avanza la infección. Para cuantificar la translocación nuclear-a-citoplásmico de ICP0, analizamos ICP0 distribución en relación con .......
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Discusión
Este protocolo se ha utilizado para el estudio de la translocación nuclear-a-citoplásmico de ICP0 HSV-1. ICP0 sufre tráfico subcelular durante la infección por HSV-1 (figura 1). Probablemente, ICP0 interactúa con diversas vías de la célula para llevar a cabo diferentes funciones en diferentes lugares. Esto permite ICP0 a la consonancia fina sus múltiples funciones en el tira y afloja con el huésped humano13. Sin embargo, cómo ICP0 coordina las múltiples funciones de u.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos el apoyo financiero de una subvención del NIH (RO1AI118992) concedida a Haidong Gu. Agradecemos a la instalación de microscopía, la proyección de imagen y base de recursos de citometría (MICR) en Wayne State University para soporte técnico.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| /fuertes> | |||
| fibroblastos de pulmón embrionario humano (células HEL) | Dr. Thomas E. Shenk (Universidad de Princeton) | células HEL se cultivaron en DMEM suplementadas con un 10% de | |
| FBS HSV-1 viral (cepa F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| medio< fuerte> | |||
| Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Suero Fetal Bovino (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10x) | Gibco | 11825-015 | |
| Reactivos | |||
| 4- pozo 11 mm corredera escalonada | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-NEGRO | |
| 16% Solución de paraformaldehído (con v/v) Libre de metanol | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Reactivos Fisher | BP151-1C0 | |
| Suero bovino Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Suero de caballo | Sigma | H1270 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu laboratorio | ||
| NaCl | Biorreactivo | de Fisher BP358-212 | |
| KH2PO4 | Biorreactivo de Fisher | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Tampón de bloqueo (PBS con 1% de BSA y 5% de suero de caballo) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 anticuerpo | . Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-IgG monoclonal de ratón | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-cabra anti-conejo | Igg invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-cabra anti-ratón IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Medio de mouting con DAPI | Laboratorios vectoriales | H-1200 | |
| Pipeta Pasteur | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Esmalte de uñas | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscopio | Leica SP8 | ||
| Confocal Software | Leica LAS X Conjunto | ||
| Software Excel Microsoft | Excel | ||
| HERAcell 150i Incubadora CO2 | Thermo Scientific | Código de pedido 51026282 |
Referencias
- Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Arvin, A., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. Fields' Virology. Knipe, D. M. , 6th Edition, Li....
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Reimpresiones y permisos
