Visualización de la migración celular tangencial en el Tectum óptico de Chick en desarrollo

Summary

Describimos los métodos de etiquetado fluorescente tangencial migrar las células por electroporación y para Time-lapse de imágenes del movimiento celular marcada en una cultura de plano-montaje para visualizar migración celular comportamiento en El tectum óptico de chick en desarrollo .

Abstract

Proyección de imagen de Time-lapse es un método poderoso para analizar el comportamiento de células migratorias. Después de etiquetado fluorescente de la célula, el movimiento de las células marcadas en la cultura puede grabarse bajo microscopia video. Para el análisis de migración de la célula en el cerebro en desarrollo, sector cultura se utiliza comúnmente para observar la migración de la célula paralela a la sección de corte, como la migración de la célula radial. Sin embargo, la información limitada puede obtenerse desde el método de cultura rebanada para analizar la migración de la célula perpendicular a la sección de corte, como migración tangencial. Aquí, presentamos los protocolos para Time-lapse de imágenes para visualizar la migración de la célula tangencial en El tectum óptico de chick en vías de desarrollo. Una combinación de etiquetado celular por electroporación de ovo y una cultura de plano-montaje posterior en la inserción de la cultura de célula permite la detección de movimiento de migración celular en el plano horizontal. Además, nuestro método facilita la detección de comportamiento de células individuales y la acción colectiva de un grupo de células a largo plazo. Potencialmente, este método puede aplicarse para detectar el cambio secuencial de la etiqueta fluorescente micro-estructura, incluyendo la elongación axonal en el desplazamiento de tejido o células neuronal en el tejido no neural.

Introduction

El estudio de la migración de la célula ha sido avanzando con la técnica de avance de la proyección de imagen vivo. Después de etiquetado fluorescente de la célula, el movimiento temporal de células marcadas en una placa de cultivo o en vivo puede grabarse bajo microscopia video. En el estudio del desarrollo neuronal, se han analizado los cambios morfológicos de migración de las células o alarga axones usando proyección de imagen de Time-lapse. Para la proyección de imagen efectiva, es esencial aplicar un método adecuado para la preparación de tejido y etiquetado fluorescente de la célula, basado en el propósito del experimento y el análisis. Para el análisis....

Protocol

1. Electroporación de Ovo

1. Preparar el ADN del plásmido de expresión etiquetado fluorescente en alta concentración. Aislar ADN de 200 mL de cultivo bacteriano por el método de lisis alcalina mediante columnas de intercambio según protocolo del fabricante (Tabla de materiales). Mezcla pCAGGS-EGFP y pCAGGS-mCherryNuc a una concentración final de 4 μg/μl cada una.
   Nota: Purificación de DNA de plásmido libre de endotoxina puede ser preferido para la electroporación.
2. Incubar huevos de gallina fértiles horizontalmente en 38 ° C en 70% de humedad relativa.
3. Después de 2,5 días, eliminar 5 mL de albúmina (clara de huevo....

Results

La figura 2 muestra la migración tangencial superficial visualizada en una cultura de plano-montaje en un tiempo transcurrido (0, 9, 18, 27 h) después del inicio de la grabación. Película 1 es una película de lapso de tiempo de 10 min-intervalos durante un periodo de 28 h y 50 min. El marco está seleccionado para centrarse en la migración de las células de la etiqueta esquina inferior izquierda del cuadro al espacio sin etiqu.......

Discussion

El protocolo descrito anteriormente está optimizado para detectar la migración celular en capas superficiales^6,8. Es aplicable para la detección de capa media migración arroyos (película 5)^6,7, cambiando el momento de la electroporación (E5.5 a E4.5) y el inicio de la cultura y la proyección de imagen (E7.0 a E6.0).

El procedimiento presentado.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF	MACHEREY-NAGEL	740422.5	de purificación de ADN plasmídico libre de endotoxinas
jeringa de 20 ml	TERUMO	SS-20ESZ
aguja de calibre 18	TERUMO	NN-1838R
Fast Green	Wako	061-00031
100x penicilina y estreptomicina	Gibco	15140-122
tubo capilar de vidrio	Narishige	G-1
inserto de cultivo celular	Millipore	Millicell CM-ORG
laminina	SIGMA	L2020	recubrimiento de inserto de cultivo
poly-L-Lysine	Peptide Institute	3075	recubrimiento de inserto de cultivo
plato con fondo de vidrio	Matsunami	D11130H
Opti-MEM	Gibco	31985-070 medio de	cultivo
F12	Gibco	11765-054	medio de cultivo
suero fetal bovino	Gibco	12483	medio de cultivo
suero para pollitos	Gibco	16110082	medio de cultivo
10xHBSS	Gibco	14065-056
bisturí microquirúrgico	Cooperación en especialidades quirúrgicas	72-1501
Nombre	Company	Número de catálogo	>Comentarios
Equipo curvadas fuertes >
	COMO UNO	No.11
procesador de micropipetas	SUTTER INSTRUMENT	P97/FIV
pinza electrodo BEX		LF646P3x3
generador de impulsos	BEX	CUY21EX	electroporador
fluorescencia microscopio estereoscópico	Leica	MZ16F
microscopio de fluorescencia invertida	Olympus	IX81
controlador	de gas	de temperatura Tokken MIGM/OL-2
Unidad confocal láser