Aquí, presentamos un protocolo para generar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y operar NETQUANT, una opción de software totalmente automática para la cuantificación de NETs en imágenes de inmunofluorescencia.
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Artículo de método
Cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT
En este artículo
Resumen
Resumen
Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) son estructuras antimicrobianas similares a la web que consisten en proteínas antimicrobianas derivadas del ADN y del gránulo. La microscopía de inmunofluorescencia y los métodos de cuantificación basados en imágenes siguen siendo herramientas importantes para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos. Sin embargo, existen limitaciones clave en los métodos basados en la inmunofluorescencia que actualmente están disponibles para cuantificar los NET. Los métodos manuales de cuantificación de NET basada en imágenes suelen ser subjetivos, propensos a errores y tediosos para los usuarios, especialmente los usuarios no experimentados. Además, las opciones de software disponibles actualmente para la cuantificación son semiautomáticas o requieren capacitación antes de la operación. Aquí, demostramos la implementación de un método automatizado de cuantificación de imágenes basado en inmunofluorescencia para evaluar la formación NET denominada NETQUANT. El software es fácil de usar y tiene una interfaz gráfica de usuario (GUI) fácil de usar. Considera parámetros biológicamente relevantes como un aumento en la superficie y la relación de proteína de marcador DNA:NET, y la deformación nuclear para definir la formación de NET. Además, esta herramienta se construye como una aplicación de libre disposición, y permite la cuantificación y el análisis de la resolución de una sola celda.
Introducción
Los neutrófilos son mediadores cruciales de las respuestas de defensa innatas del huésped contra una amplia variedad de patógenos microbianos1. Ejecutan sus funciones antimicrobianas liberando sus gránulos que contienen una amplia gama de proteínas antimicrobianas2,produciendo especies reactivas de oxígeno (ROS) e hipoclorito1,y a través de fagocitosis3. Además, Brinkmann et al. 4 describió las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) como un mecanismo novedoso por el cual los neutrófilos atrapan y eliminan los patógenos invasores. Desde ....
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Protocolo
El comité de ética de la Universidad de Lund aprobó la recolección de sangre venosa de voluntarios sanos de acuerdo con la Declaración de Helsinki (2013/728). Todos los voluntarios proporcionaron su consentimiento informado por escrito.
1. Aislamiento de neutrófilos de sangre periférica usando Centrifugación Density-Gradient
- Recoger sangre venosa humana en tubos que contienen heparina y permitir que los tubos alcancen la temperatura ambiente.
Nota: Se requiere un mínimo de 16 ml de sangre de un donante sano para producir un pellet de células suficientemente grande. - Mezclar la sangre con un volumen de 2% de dextran en ....
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Resultados
5 x 105 neutrófilos/ml fueron sembrados sobre los cubreobjetos colocados en una placa de 12 pocillos y estimulados con PMA de 20 nM o sin estimular durante 150 min. Las muestras se teñían entonces utilizando anticuerpos primarios anti-humanos neutrófilos elastasa, anticuerpos conjugados secundarios con fluoróforo anticonejo de cabra y DAPI - un tinte fluorescentemente etiquetado que mancha el ADN (Ver la Tabla de Materiales para más detalles). A continuación, s.......
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Discusión
La formación NET es una adición relativamente reciente al diverso armamentario de neutrófilos4 y ha habido una notable oleada de interés para estudiar la implicación de los NETs en una amplia gama de áreas de investigación5,7,14,15. La adquisición de imágenes mediante microscopía de inmunofluorescencia y la cuantificación posterior basada en imágenes es un método ampliam.......
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Divulgaciones
TM y PN tienen una patente pendiente relacionada con los algoritmos utilizados en NETQUANT.
Agradecimientos
El trabajo fue financiado por la Fundación Crafoord (TM y PN), la beca sueca de investigación gubernamental (PN, TM), el Consejo de Investigación Sueco (PN) y la Fundación Groschinsky (TM, PN).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BD Vacutainer Tubos de plástico heparinizados | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 con L-Glutamina | Gibco | 11835-030 | |
| Matraces cónicos de 50 ml | Sarstedt | 62.547.004 | |
| Matraces cónicos de 15 ml | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Tejido de 12 pocillos placas de cultivo | Falcon | 10626491 | |
| #1 Cubreobjetos 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Portaobjetos de vidrio | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Elastasa primaria antihumana | DAKO DAKO | conejo 1373, inmunización | |
| Fluoróforo secundario conjugado anti-conejo de cabra Life | technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Reactivo antidecoloración con tecnologías DAPI | Life | P36930 | Medio de montaje |
| Suero de cabra | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Microscopio de epifluorescencia | Nikon | ||
| Andor Zyla | |||
| Plan Apochromat 20x, 40x | objetivos Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Sistema operativo | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Sistema operativo | |
| MATLAB | Mathworks |
Referencias
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Nordenfelt, P., Tapper, H.
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Reimpresiones y permisos
