Morfométricos de protocolo para la evaluación objetiva del comportamiento del blastocisto durante la vitrificación y el calentamiento pasos

Summary

Aquí presentamos un protocolo de Time-lapse morfométricos para seguir la intensidad de la contracción de blastocisto y re-expansión durante intervenciones previtrification y la recuperación post calentamiento. La aplicación del protocolo en vitro fecundación laboratorios con microscopios de lapso de tiempo es posible y se recomienda en el desarrollo de un método de vitrificación de blastocistos óptima.

Abstract

Este artículo describe el método no invasivo de blastocisto Morfometría basada en time-lapse microfotografía para el control preciso del volumen de un blastocisto cambiando durante las fases individuales antes y después de la vitrificación. El método puede ser útil en la búsqueda del momento más óptimo de la exposición de blastocisto a distintas concentraciones de crioprotectores, observando la contracción de blastocisto y re-expansión en diferentes pre- y post vitrificación fases. Con esta metodología, se puede optimizar el protocolo de vitrificación de blastocistos. Para una mejor demostración de la utilidad de este método morfométrico, se comparan dos protocolos de preparación de diferentes blastocisto para vitrificación; uno con el uso de un artificial blastocoel colapso y otro sin esta intervención antes de vitrificación. Los cambios en el volumen de blastocistos son seguidos por microfotografía Time-lapse y medidas por herramientas de software de edición de fotos. Las mediciones se toman cada 20 segundos en las fases previtrification y cada 5 minutos en el período post calentamiento. Los cambios de las dimensiones del blastocisto por unidad de tiempo se presentan gráficamente en diagramas unifilares. Los resultados muestran una fase de previtrification de largo equilibrado en el que el blastocisto intacto primero se contrae y luego rellena lentamente el blastocoel, entrar en vitrificación con un blastocoel llena de líquido. El blastocisto artificial derrumbado permanece en su etapa contraído a través de la fase de equilibrar todo. Durante la fase de vitrificación, también no cambia su volumen. Puesto que la morfometría de blastocisto muestra un volumen constante de los blastocistos artificialmente colapsados durante el paso de previtrification, parece que esta etapa podría ser más corta. El protocolo descrito proporciona muchos parámetros adicionales comparativos de comportamiento del blastocisto durante y después de la criopreservación sobre la base de la velocidad y la intensidad de los cambios de volumen, el número de contracciones del blastocoel parcial o total de blastocistos se derrumba y el tiempo para una re-expansión del blastocoel total o el tiempo de incubación.

Introduction

Criopreservación de embriones preimplantación humanos en vitro fecundación del programa de (FIV) es actualmente una práctica habitual en la mayoría de los laboratorios FIV. El embrión lento congelación método comenzó a utilizarse clínicamente en 1985, con la introducción de crioprotectores específicos y congeladores controlados por computadora, que permitió el enfriamiento controlado de embriones hasta-7 ° C, cuando la nucleación de hielo (siembra) fue inducida en el alrededor de crioprotectores medio¹. Por enfriamiento continuo, crecen los cristales de hielo, causando el hyperosmolality de la fracción líquida restante y, en consecuencia, la deshidratación y contracción de las células embrionarias. A-30 ° C o -80 ° C, los embriones se le hundió en el nitrógeno líquido para un almacenaje más largo. Sólo por cryomicroscopes especialmente adaptados, que ayudó a mejorar los protocolos de criopreservación²se pudo observar lo que sucedía con los embriones u ovocitos durante el enfriamiento. La congelación de blastocistos, un volumen más alto y más etapa embrionaria contiene líquido, dio los resultados clínicos menos prometedoras en aquellos días³.

Los avances en la criopreservación del blastocisto era la introducción del método de vitrificación, en el que la deshidratación de las células tuvo lugar antes de enfriamiento mediante el uso de altas concentraciones de crioprotectores⁴. La eliminación del fluido del blastocoel antes de vitrificación se logra también haciendo una apertura mecánica entre dos de las células trophectoderm⁵. Aunque la tasa de supervivencia inmediata blastocisto después de la vitrificación y el calentamiento es por encima de 90% y el siguiente resultado clínico la transferencia de blastocitos vitrificados/calentados en la cavidad uterina es casi comparable a los resultados después de la transferencia de frescos embriones, este método de criopreservación no ha sido aún estandarizada^6,7. Protocolos de vitrificación varían según el tipo y la concentración de crioprotectores, (b) el número de pasos de previtrification, (c) la duración de cada paso, (d) el uso de un artificial blastocoel que se derrumban antes de vitrificación o no, (e). colapso de métodos, (f) la expansión del blastocisto etapa y (g) la temperatura de equilibrio/vitrificación en que los embriones deben ser vitrificados⁸. Desde crioprotectores pueden ser tóxicos para las células, el tiempo de exposición de blastocisto a estas soluciones tiene que ser definidas. Sin embargo, algunos fabricantes de medios de criopreservación que protocolos muy flexibles.

El interés de los científicos generalmente se centra en el estudio de la capacidad de re-expansión del blastocisto con el objetivo de buscar nuevos biomarcadores con un mejor pronóstico de implantación^6,9,10. Cómo blastocistos humanos deshidratan en distintas etapas de la adición de crioprotectores antes de vitrificación y que pasa con blastocistos después de la vitrificación y el calentamiento, cuando crioprotectores han de ser eliminados de las células, y cómo los blastocistos rehidratar y volver a expandir después de calentamiento, no bien descrito ni entendido. El desarrollo de una metodología para el objetivo y cuantificado seguimiento de comportamiento del blastocisto durante los pasos de criopreservación diferentes es, pues, razón de ser.

Con microscopios de Time-lapse de diversos fabricantes, ahora es posible monitorear el comportamiento del blastocisto en pre y post vitrificación fases. Mediante la inclusión de herramientas informáticas adicionales, también se pueden realizar mediciones de su tamaño (morfometría). Medición de la disminución o aumento de tamaño del embrión en un momento dado, es posible objetivar la evaluación de la morfodinámica de embriones durante la deshidratación y rehidratación.

Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Comité Nacional de ética médica en 19 de abril de 2016 (Nº 0120-204/2016 – 2).

1. instalación del sistema de grabación de microscopio

1. Apague la placa calefactora del microscopio.
2. Antes de cualquier tratamiento, tomar una instantánea de un blastocisto bajo un microscopio invertido equipado con cámara. Recuerde tener en cuenta el aumento que se registró el blastocisto.

2. selección y Prepreparation de blastocistos para vitrificación

1. Seleccione solamente blastocistos día 5 o 6 día completamente ampliados para la criopreservación con al menos unos (ICM) masa celular interna de las células y cohesivo trophectoderm.
2. Para blastocistos laser-tratado con una atelectasia blastocoel, tema un blastocisto a un pulso de láser corto (0,4 - 0,7 ms) con un diámetro de agujero desde 4.3 hasta 9,4 μm, dirigida tangencialmente en la zona pelúcida y en una Unión de dos células adyacentes trophectodermal. Permita que el blastocisto al colapso total o parcialmente durante 5 minutos.
3. Para blastocistos sin tratar con un intacto blastocoel, no realizar ningún tratamiento especial antes de vitrificación.
   Nota: Estos blastocistos se consideran intactas.

3. preparación de crioprotector y una placa de Petri para la fase de equilibrio

1. Pipeta de pithe uso de denudación del ovocito (diámetro 135 μm) llenar asépticamente medios equilibrar (medio tamponado con HEPES M-199 7,5% DMSO, 7.5% glicol de etileno, 20% DSS) en los orificios de la zona del microdroplet de un plato de Petri de 9 bien diseñado especialmente para grabación y Time-lapse microscopia.
   Nota: Denudación de ovocitos es un proceso de eliminación de células del cúmulo que rodean al ovocito. El uso de una pipeta de denudación de ovocitos ayudarán a evitar la creación de burbujas de aire.
2. Sobreponer el área microdroplet con 30 μl de medio equilibrado.

4. transferencia de blastocisto en la solución de equilibrado

1. Sumerja un blastocisto intacto o tratados con láser en el medio de equilibrar a la parte inferior de la zona del microdroplet del microdroplet plato por 10 min a temperatura ambiente (fase de equilibrio).
2. Iniciar una cuenta atrás de 10 minutos cuando el blastocisto se transfiere al medio equilibrado.

5. grabación del blastocisto en la fase de equilibrio

1. Transferir el plato microdroplet con el blastocisto a un microscopio equipado con cámara. Utilice el mismo aumento previamente para tomar una instantánea del mismo blastocisto. Posición del microdroplet plato para que el blastocisto se coloca aproximadamente en el centro de la grabación.
2. Iniciar la grabación con el microscopio, software de grabación. Tenga en cuenta el tiempo de cuenta regresiva en la que se inicia la grabación.
   Nota: Ver resultados representativos de las grabaciones de un intacto (figura 1, Video 1) y un blastocisto colapsado (figura 2, Video 2) durante la exposición de 10 minutos a una solución de equilibrio.

6. vitrificación del blastocisto

1. Distribuir asépticamente una gota de 50 μl de solución de vitrificación (medio tamponado con HEPES M-199 con 15% DMSO etilenglicol 15%, 20% DSS, sacarosa 0.5m) en una placa Petri 2 minutos antes de que termine la cuenta regresiva.
2. Detener la grabación cuando la cuenta regresiva de 10 minutos termina y transferir rápidamente el blastocisto a la solución de vitrificación para 30 s a temperatura ambiente.
3. Pipetee suavemente el blastocisto al menos 1 x dentro de la solución de vitrificación.
4. Use una vitrificación paja para cargar el blastocisto. Cargar, sello y hundir la vitrificación paja en nitrógeno líquido (LN) en los 80 s, no exceda de 110 s después de la exposición inicial a la solución de vitrificación.

7. video edición del blastocisto registrado durante la fase de equilibrio

1. Importar un archivo de vídeo grabado en el software de edición de vídeo.
2. Mueva el control deslizante de línea de tiempo a 20 s. Nota el número de fotograma en este momento.
   Nota: Este número se utilizará para diezmar fotogramas de video innecesarios. Sólo Marcos cada 20 s se utilizará.
3. Haga clic en la ficha vídeo , luego fotogramas.... Con conversión de frecuencia de cuadro, compruebe el campo de diezmar por e introduzca el número de marco previamente conocido. Confirmar haciendo clic en Aceptar. Haga clic en archivo → exportar → secuencia de imágenes.
4. Seleccione JPEG como formato de salida, configurar el directorio para sostener la secuencia guardada de imágenes y haga clic en Aceptar.
   Nota: Esto creará un directorio con hasta 30 imágenes del blastocisto grabado en secuencia durante la fase de equilibrio de la vitrificación.

8. medidas de superficie transversal del blastocisto de imágenes creadas durante la fase de equilibrio

1. Abra el software de análisis de vídeo. Haga clic en la pestaña de la ventana y seleccione línea de tiempo.
2. En el panel Línea de tiempo, haga clic en el signo de la tira de película y elija Agregar medios de comunicación... para agregar una imagen del blastocisto antes de la fase de equilibrio de la vitrificación y antes de la intervención láser, si hubo alguno.
   Nota: Esta imagen muestra el blastocisto en su estado más expandido y su área transversal servirá como una referencia.
3. Agregue la secuencia de imágenes del blastocisto correspondiente generado previamente con software de edición de video (de la fase de equilibrio de la vitrificación).
4. Ir a imagen → análisis → Seleccionar puntos de datos → Custom para abrir la ventana de Seleccionar puntos de datos .
5. Deseleccionar todos los puntos de datos, luego seleccionar sólo el área y confirme haciendo clic en Aceptar.
6. Mueva el control deslizante de la línea de tiempo en la ventana de línea de tiempo a la primera imagen.
7. Haga clic en la pestaña ventana y escoge herramientas.
   Nota: Esto activará el panel de herramientas en el lado izquierdo.
8. Elija la herramienta Selección rápida.
9. Colocar el marcador de la herramienta dentro del blastocisto para tocar el borde del blastocisto. El blastocisto del esquema colocando el marcador de la herramienta en el borde exterior del blastocisto, haciendo clic y manteniendo pulsado el botón izquierdo del ratón y arrastre el marcador de la herramienta a lo largo del borde exterior del blastocisto hasta el área transversal del blastocisto todo seleccionado.
   Nota: Zona pelúcida no es una parte de la medición, por lo que debe ser excluido (figura 5).
10. En la ventana línea de tiempo, haga clic en el Registro de medición y pulse el botón de Registro de mediciones .
    Nota: Esto grabará el área seleccionada.
11. Volver a la línea de tiempo, haga clic en la imagen y elija deseleccionar.
12. Mueva el control deslizante de la línea de tiempo a la siguiente imagen y haz clic en la ficha correspondiente debajo de ella.
13. Esquema del blastocisto en la nueva imagen con la herramienta de selección rápida. Repita la medición.
14. Repita este procedimiento (pasos 8,9-8.13) imagen por imagen hasta áreas de sección transversal de todas las imágenes son medidas y registradas.
15. Al final, ir al registro de las mediciones, seleccionar todas las medidas en la variable de la zona y exportarlos en un archivo .txt.
    Nota: Las unidades de la superficie transversal son píxeles cuadrados.

9. editar el archivo de datos con áreas transversales de blastocisto grabados de imágenes creada durante la fase de equilibrio

1. Transferir los datos de áreas transversales de blastocisto grabado desde el archivo txt en un editor de hoja de cálculo.
2. Utilice el primer área de sección transversal valor como valor de referencia 1 y expreso (transform) todos los valores a ser una fracción de ese valor de referencia.
3. Crear una nueva variable Area_r y pegar los valores de área de transcodificación (excepto el valor de referencia) debajo de él.
4. Junto a la variable Area_r, cree una variable de tiempo y agregar valor en el primer tiempo.
   Nota: El primer valor de tiempo representa el tiempo que pasó desde el momento en que el blastocisto fue expuesto a la solución de equilibrio para el inicio de la grabación con un microscopio equipado con cámara.
5. Calcular cada valor de tiempo consecutivos próximo mediante la adición de 20 s en el valor de tiempo anterior.
   Nota: Este es el intervalo de tiempo utilizado en diezmar fotogramas de video innecesarios creados durante la grabación.

10. calentamiento del blastocisto

1. Preparar los medios para el calentamiento.
   1. Un día antes de calentar el blastocisto, dispensar asépticamente tres gotas de 150 μL de medio de recuperación en un plato de 4 pozos. Además, dispensar asépticamente medio de recuperación en un plato de 9 pozos microdroplet diseñado especialmente para Time-lapse microscopía y grabación. El medio de recuperación de la cubierta con aceite de parafina y preincubate a 37 ° C con 6% CO₂ y de 5% O₂.
      Nota: Medio de recuperación es un medio de cultivo de embriones en fase de blastocisto con agregado albúmina sérica humana (HSA). La HSA en el medio de recuperación debe ser de 12 mg/mL. Para llenar los agujeros en el plato de 9 pozos, utilice una pipeta de denudación de ovocitos para evitar la creación de burbujas de aire, luego superponer el área microdroplet con 30 μl de medio de recuperación.
   2. En el día del calentamiento el blastocisto, asépticamente dispensar 500 μl de solución (TS) en un solo pozo de un plato de 4 pozos de descongelación y deje que se caliente a 37 ° C en una incubadora sin CO₂.
   3. A temperatura ambiente, dispensar asépticamente una gota de 50 μl de solución de dilución (DS) y dos gotas de 50 μl de solución (WS) de lavado en una placa Petri estéril. Cubrir el DS y el WS1 WS2 gotas con aceite de parafina.
      Nota: En lugar de un plato de Petri, un plato de 4 pozos puede también utilizarse.
2. Caliente el blastocisto.
   1. Identificar la paja de VHS con los blastocistos vitrificados a ser retiradas de los almacenes de LN y transferir rápidamente la paja a un depósito portátil lleno de LN en preparación para el procedimiento de calentamiento.
   2. Levantar la paja con pinzas, lo suficiente como para exponer la barra de manejo de color. Utilice un pelacables autoajustable para cortar la paja a la altura de la barra de manejo de color.
   3. Agarrar la barra de dirección y extraer de la paja con un movimiento rápido pero controlado y sumergirse inmediatamente la espátula curvada de la barra de dirección en los 37 ° C TS.
   4. Agitar suavemente la barra de dirección para separar el blastocisto y dejarlo para un total de 1 minuto en TS.
   5. A temperatura ambiente, transferir el blastocisto consecutivamente a DS y WS1 WS2 durante 4 minutos en cada medio.
   6. Después del procedimiento de calentamiento, el blastocisto de transferencia a un plato de 4 pozos con medio de recuperación y lavarlo en todos tres gotas transfiriendo suavemente.
      Nota: El lavado se realiza en aproximadamente 1 minuto.
   7. Transferencia de blastocisto al Time-lapse bien 9 plato con medio de recuperación. Coloque el plato 9-bien en una cámara de lapso de tiempo en una incubadora (a 37 ° C con 6% CO₂ y de 5% O₂).
      Nota: Procedimiento de calentamiento Thre, que continúa con la colocación el plato 9-bien en una cámara de lapso de tiempo en una incubadora, dura aproximadamente 17 minutos.

11. Time-lapse grabación de la Re-expansión del blastocisto durante la recuperación post-calentamiento

1. Ejecute el software de grabación Time-lapse.
2. Elegir una cámara de grabación.
3. Pulse el botón Live mode .
4. Coloque el cursor del ratón sobre la imagen y use el botón de scroll para verla. Haga clic y mantenga pulsado el botón izquierdo del ratón y mueva el cursor para colocar el pozo con el blastocisto en medio de la pantalla.
5. En enfoque, utilice las flechas verdes de arriba-abajo para enfocar el plano de grabación del blastocisto. Intensidad de la luz, establecer la intensidad de la luz.
6. Haga clic en el botón parámetros de microscopio para establecer el tiempo de exposición y Gamma.
7. Pulse cerrar modo live.
8. Pulse el botón iniciar proyecto de introducir los datos de proyecto, seleccione el tipo de plato de cultura (3 x 3 o 4 x 4) y desmarcar todas las posiciones excepto la que se registrará.
9. Establezca la regulación de la captura para tomar una foto cada 5 minutos.
10. Iniciar la grabación pulsando el botón aprobar . Registrar por lo menos 150 min.
11. Detener la grabación presionando el botón de detener el proyecto .
    Nota: Vea los resultados representativos de la grabación de un intacto (figura 3) y un blastocisto colapsado (figura 4) durante el período de recuperación post calentamiento.

12. video edición del blastocisto grabado durante el Re-expansión post calentamiento

1. Ir a la carpeta del proyecto y ubicar imágenes grabadas que son aproximadamente 80 KB de tamaño.
2. Crear otra carpeta y transferir estas imágenes en él. Cambiar el nombre de las imágenes de números según el tiempo creado. Importarlos en el software como una secuencia de imágenes de la edición de vídeo.
3. Ir a la pestaña de vídeo → filtro → Add y seleccione filtro transformación nula .
4. Haga clic en el botón de recortar a la derecha y recortar la imagen, dejando visible sólo en el campo con el blastocisto grabado. Confirme con OK y OKotra vez.
5. Haga clic en archivo → exportar → secuencia de imágenes. Seleccione JPEG como formato de salida, configurar el directorio para sostener la secuencia guardada de imágenes y haga clic en Aceptar.
   Nota: Esto crea imágenes (recortadas) tamaño preparados para más medidas en el software de análisis de vídeo.

13. configuración de una escala de medición de Software de vídeo análisis para las imágenes creadas con el Software de grabación Time-lapse

1. Ejecute el analizador del software de grabación Time-lapse.
2. Abre el proyecto con el blastocisto grabado.
3. Haga clic en el botón analizar en el campo con el blastocisto grabado.
   Nota: Se abrirá una nueva ventana de análisis. Haga clic en el botón de la medida para mostrar la herramienta de medición.
4. Utilice la herramienta de medición para medir la anchura de la imagen entera.
5. Haga clic en la imagen y guardarla. En las propiedades, compruebe el ancho de la imagen en píxeles.
6. Dividir la anchura real de la imagen con el ancho en píxeles.
   Nota: Este calcula la longitud real de un solo pixel en esta imagen.
7. Ejecute el software de análisis de vídeo.
8. Haga clic en la pestaña de la ventana y seleccione línea de tiempo.
9. En el panel Línea de tiempo, haga clic en el signo de la tira de película y elija Agregar medios de comunicación... para agregar la secuencia de imágenes del blastocisto a expansión post caliente.
10. Haga clic en imagen → análisis → Configurar escala de medida → Custom para abrir la ventana de escala de medida. Para la longitud de píxel, escriba 1; para la longitud lógica, introduzca la longitud real previamente calculada de un píxel (Paso 13,6); para unidades lógicas, escriba μm. guardar el preset.

14. medición del área transversal del blastocisto de imágenes creadas durante el cálido después de Re-expansión

1. Una vez que la escala de medición es conjunto y la secuencia de imagen importados, medir áreas transversales de blastocisto al igual como se describe en el paso 8, con la única diferencia es que las áreas transversales medidas en estas mediciones tienen unidades en μm² .

15. editar el archivo de datos con áreas transversales de blastocisto grabados de imágenes creadas durante el cálido después de Re-expansión

1. Transferir los datos de áreas transversales de blastocisto grabado desde el archivo txt en un editor de hoja de cálculo.
2. Cree una variable de tiempo junto a la variable de área y agregar valor en el primer tiempo.
   Nota: en este caso, el primer valor de tiempo se establece a 0 minutos, que es el inicio de la grabación Time-lapse. Cada valor de tiempo consecutivos próximo se calcula agregando 5 minutos al valor anterior en el tiempo. Cinco minutos es el intervalo de tiempo utilizado entre dos consecutivas grabaciones time-lapse.

16. creación de un diagrama de línea

1. Importar el archivo de datos de hoja de cálculo en el software de análisis estadístico para la creación de un diagrama de tiempo de los cambios de área de sección transversal del blastocisto durante la fase de equilibrio de la vitrificación o re-expansión posterior calentamiento.

Results

En una demostración, mostramos blastocisto morfodinámica en sólo una previtrification y una fase posterior calentamiento. Una diferencia de volumen de blastocisto en el final de la fase de equilibrio y el principio de recuperación en medio cultura demostrada la intensidad de la contracción del embrión, que es, de hecho, la intensidad de la preservación de embriones contra la cristalización de hielo.

Como se aprecia de la

Discussion

El protocolo para la observación de la morfodinámica del blastocisto durante y después de criopreservación puede también llevarse a cabo mediante el uso de instrumentos similares y herramientas de software de otros fabricantes. Sistemas Time-lapse para embriología permiten el monitoreo continuo del desarrollo embrionario. El propósito de este trabajo fue introducir la cuantificación del comportamiento del blastocisto durante la preparación de blastocistos para vitrificación y después de su calentamiento. Esto se realizó ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio invertido Eclipse TE2000-U	Nikon, Japón	/
Saturn 5 Laser System	Research Instruments, Origio, Dinamarca	/
Cámara digital DC1	Research Instruments, Origio, Dinamarca	/
Cámara digital DC2	Research Instruments, Origio, Dinamarca	/
Cronus 3.7	Research Instruments, Origio, Dinamarca	/	software de grabación de microscopio
Incubadora con aglutinante de 6% CO2, 5% O2	, Alemania	/
Microscopio Primo Vision	Vitrolife, Suecia	16600
Primo Vision Software de captura	Vitrolife, Suecia	16608	software de grabación time-lapse
Adobe Photoshop CS6 Software extendido	Adobe Systems Incorporated, EE. UU./		software de análisis de video
VirtualDub;	Avery Lee	/	software de edición de video
Microsoft Office Excell	Microsoft, EE. UU.	/	editor de hojas de cálculo
Plato de cultivo PrimoVision	Vitrolife, Suecia	16604
Medio G2-plus	Vitrolife, Suecia	10132	Medio de cultivo para embriones en estadio de blastocisto
Albúminas séricas humanas	Vitrolife, Suecia	10064
Aceite de parafina	Vitrolife, Suecia	10029
Medio de solución de equilibrio	Irvine Scientific, Irlanda	90131
Medio de solución de vitrificación	Irvine Scientific, Irlanda	90132
Medio de solución de descongelación	Irvine Scientific, Irlanda	90134
Medio de solución de dilución	Irvine Scientific, Irlanda	90135
Medio de solución de lavado	Irvine Scientific, Irlanda	90136
Pajitas de vitrificación HSV	CryoBio System, Francia	025246, 025249, 025250, 025248
Recipiente de nitrógeno líquido	/
criogénico Biosafe 120 MD β	Cryotherm, Alemania	229286
Tanque criogénico	Cryotherm, Alemania
Pinzas	/	/
Tijeras	/	/
Pippete para la manipulación de blastocistos	Gynetics, Bélgica	ID275/10	diámetro 275 µ m
Pipeta para la denudación de ovocitos	Vitromed, Alemania	V-DEN-135	diámetro 135 y micro; m
Pipettor EZ-Grip	Research Instruments	7-72-2802
Temporizador de intervalos digital Assistent	Glaswarenfabrik Karl Hecht	41977010
IBM SPSS Statistics 21	IBM, EE.UU./		software de análisis estadístico
Pelacables autoajustable	Knipex, Alemania	1262180