Morfométricos de protocolo para la evaluación objetiva del comportamiento del blastocisto durante la vitrificación y el calentamiento pasos

Summary

Aquí presentamos un protocolo de Time-lapse morfométricos para seguir la intensidad de la contracción de blastocisto y re-expansión durante intervenciones previtrification y la recuperación post calentamiento. La aplicación del protocolo en vitro fecundación laboratorios con microscopios de lapso de tiempo es posible y se recomienda en el desarrollo de un método de vitrificación de blastocistos óptima.

Abstract

Este artículo describe el método no invasivo de blastocisto Morfometría basada en time-lapse microfotografía para el control preciso del volumen de un blastocisto cambiando durante las fases individuales antes y después de la vitrificación. El método puede ser útil en la búsqueda del momento más óptimo de la exposición de blastocisto a distintas concentraciones de crioprotectores, observando la contracción de blastocisto y re-expansión en diferentes pre- y post vitrificación fases. Con esta metodología, se puede optimizar el protocolo de vitrificación de blastocistos. Para una mejor demostración de la utilidad de este método morfométrico, se comparan dos protocolos de preparación de diferentes blastocisto para vitrificación; uno con el uso de un artificial blastocoel colapso y otro sin esta intervención antes de vitrificación. Los cambios en el volumen de blastocistos son seguidos por microfotografía Time-lapse y medidas por herramientas de software de edición de fotos. Las mediciones se toman cada 20 segundos en las fases previtrification y cada 5 minutos en el período post calentamiento. Los cambios de las dimensiones del blastocisto por unidad de tiempo se presentan gráficamente en diagramas unifilares. Los resultados muestran una fase de previtrification de largo equilibrado en el que el blastocisto intacto primero se contrae y luego rellena lentamente el blastocoel, entrar en vitrificación con un blastocoel llena de líquido. El blastocisto artificial derrumbado permanece en su etapa contraído a través de la fase de equilibrar todo. Durante la fase de vitrificación, también no cambia su volumen. Puesto que la morfometría de blastocisto muestra un volumen constante de los blastocistos artificialmente colapsados durante el paso de previtrification, parece que esta etapa podría ser más corta. El protocolo descrito proporciona muchos parámetros adicionales comparativos de comportamiento del blastocisto durante y después de la criopreservación sobre la base de la velocidad y la intensidad de los cambios de volumen, el número de contracciones del blastocoel parcial o total de blastocistos se derrumba y el tiempo para una re-expansión del blastocoel total o el tiempo de incubación.

Introduction

Criopreservación de embriones preimplantación humanos en vitro fecundación del programa de (FIV) es actualmente una práctica habitual en la mayoría de los laboratorios FIV. El embrión lento congelación método comenzó a utilizarse clínicamente en 1985, con la introducción de crioprotectores específicos y congeladores controlados por computadora, que permitió el enfriamiento controlado de embriones hasta-7 ° C, cuando la nucleación de hielo (siembra) fue inducida en el alrededor de crioprotectores medio¹. Por enfriamiento continuo, crecen los cristales de hielo, causando el hyperosmolality de la fracción líquida restante y, en consecuenc....

Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Comité Nacional de ética médica en 19 de abril de 2016 (Nº 0120-204/2016 – 2).

1. instalación del sistema de grabación de microscopio

1. Apague la placa calefactora del microscopio.
2. Antes de cualquier tratamiento, tomar una instantánea de un blastocisto bajo un microscopio invertido equipado con cámara. Recuerde tener en cuenta el aumento que se registró el blastocisto.

2. selección y Prepreparation de blastocistos para vitrificación

1. Seleccione solamente blastocistos día 5 o 6 día completamente ampliados para la criopreser....

Results

En una demostración, mostramos blastocisto morfodinámica en sólo una previtrification y una fase posterior calentamiento. Una diferencia de volumen de blastocisto en el final de la fase de equilibrio y el principio de recuperación en medio cultura demostrada la intensidad de la contracción del embrión, que es, de hecho, la intensidad de la preservación de embriones contra la cristalización de hielo.

Como se aprecia de la

Discussion

El protocolo para la observación de la morfodinámica del blastocisto durante y después de criopreservación puede también llevarse a cabo mediante el uso de instrumentos similares y herramientas de software de otros fabricantes. Sistemas Time-lapse para embriología permiten el monitoreo continuo del desarrollo embrionario. El propósito de este trabajo fue introducir la cuantificación del comportamiento del blastocisto durante la preparación de blastocistos para vitrificación y después de su calentamiento. Esto se realizó .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio invertido Eclipse TE2000-U	Nikon, Japón	/
Saturn 5 Laser System	Research Instruments, Origio, Dinamarca	/
Cámara digital DC1	Research Instruments, Origio, Dinamarca	/
Cámara digital DC2	Research Instruments, Origio, Dinamarca	/
Cronus 3.7	Research Instruments, Origio, Dinamarca	/	software de grabación de microscopio
Incubadora con aglutinante de 6% CO2, 5% O2	, Alemania	/
Microscopio Primo Vision	Vitrolife, Suecia	16600
Primo Vision Software de captura	Vitrolife, Suecia	16608	software de grabación time-lapse
Adobe Photoshop CS6 Software extendido	Adobe Systems Incorporated, EE. UU./		software de análisis de video
VirtualDub;	Avery Lee	/	software de edición de video
Microsoft Office Excell	Microsoft, EE. UU.	/	editor de hojas de cálculo
Plato de cultivo PrimoVision	Vitrolife, Suecia	16604
Medio G2-plus	Vitrolife, Suecia	10132	Medio de cultivo para embriones en estadio de blastocisto
Albúminas séricas humanas	Vitrolife, Suecia	10064
Aceite de parafina	Vitrolife, Suecia	10029
Medio de solución de equilibrio	Irvine Scientific, Irlanda	90131
Medio de solución de vitrificación	Irvine Scientific, Irlanda	90132
Medio de solución de descongelación	Irvine Scientific, Irlanda	90134
Medio de solución de dilución	Irvine Scientific, Irlanda	90135
Medio de solución de lavado	Irvine Scientific, Irlanda	90136
Pajitas de vitrificación HSV	CryoBio System, Francia	025246, 025249, 025250, 025248
Recipiente de nitrógeno líquido	/
criogénico Biosafe 120 MD β	Cryotherm, Alemania	229286
Tanque criogénico	Cryotherm, Alemania
Pinzas	/	/
Tijeras	/	/
Pippete para la manipulación de blastocistos	Gynetics, Bélgica	ID275/10	diámetro 275 µ m
Pipeta para la denudación de ovocitos	Vitromed, Alemania	V-DEN-135	diámetro 135 y micro; m
Pipettor EZ-Grip	Research Instruments	7-72-2802
Temporizador de intervalos digital Assistent	Glaswarenfabrik Karl Hecht	41977010
IBM SPSS Statistics 21	IBM, EE.UU./		software de análisis estadístico
Pelacables autoajustable	Knipex, Alemania	1262180