Planta de crecimiento y transformación mediada por Agrobacterium de baño Floral de la Extremophyte Schrenkiella parvula

Resumen

Transformación mediada por Agrobacterium utilizando un método de inmersión floral puede ser empleado con éxito para crear líneas transgénicas estables del modelo extremophyte Schrenkiella parvula. Presentamos un protocolo modificado de eso para Arabidopsis thaliana, teniendo en cuenta los hábitos de crecimiento diferentes y características fisiológicas de la extremophyte.

Resumen

Schrenkiella parvula es un extremophyte adaptado a varios abiótico, incluyendo múltiples tensiones de la toxicidad de iones. A pesar de recursos genómicos de alta calidad disponibles para el estudio de cómo las plantas se adaptan a ambiente destaca, su valor como un modelo de genómica funcional y la herramienta ha sido limitada por la falta de un sistema de transformación posible. En este protocolo, informe cómo generar transgénicos estable S. parvula líneas utilizando un método de inmersión floral mediada por Agrobacterium. Modificamos el protocolo de transformación utilizado para a. thaliana para tener en cuenta las características únicas de S. parvula, como un hábito de floración indeterminada y un contenido alto de cera epicuticular en las hojas. Brevemente, las semillas de S. parvula se estratificaron a 4 ° C durante cinco días antes de la siembra. Las plantas fueron cultivadas en un fotoperiodo de luz 14 h y 10 h oscuro y una 130 μmol m^-2s^-1 intensidad de la luz, a 22 ° C a 24 ° C. Ocho a nueve semanas de edad las plantas con inflorescencias múltiples fueron seleccionado para la transformación. Estas inflorescencias se sumergieron en una solución de infiltración de Agrobacterium tumefaciens GV3101 llevan el plásmido pMP90RK . Se realizaron dos rondas de flor de inmersión con un intervalo de tres a cuatro semanas para aumentar la eficiencia de transformación. Las semillas de T1 fueron recogidas y secadas durante cuatro semanas en un recipiente con desecante antes de germinación a pantalla para candidato transforma líneas. Resistencia a la BASTA fue utilizada para plantas de T1. Pulveriza la solución BASTA tres veces con un intervalo de tres días a partir de dos semanas de edad las plantas reducir falsos positivos. Se realizó una prueba de gota BASTA de sobrevivir las plantas individuales para identificar transformantes positivo verdadero. La eficiencia de transformación fue 0,033%, obtención de plantas transgénicas de 3 a 4 por 10.000 semillas T1 propagadas.

Introducción

En este protocolo, se describen el crecimiento y establecimiento de líneas transgénicas estables para el modelo extremophyte Schrenkiella parvula. La disponibilidad de un sistema eficiente de transformación es una característica distintiva de cualquier modelo genético. Plantas que prosperan en ambientes extremos, que se refiere como extremophytes, proporcionan un recurso crítico para la comprensión de adaptaciones de la planta al estrés ambiental. Schrenkiella parvula (anteriormente Thellungiella parvula y Eutrema parvulum) es una modelo extremophyte, con la expansión de recursos genómicos^1,

Protocolo

1. crecimiento de la planta

1. Esterilización de las semillas (opcional)
   1. Preparar la lejía de 50% en agua destilada doble (ddH₂O) con 1 o 2 gotas de un detergente no iónico (véase Tabla de materiales) en un tubo de 50 mL. Invertir el tubo varias veces para mezclar la solución.
      Nota: Es preferible llevar a cabo la esterilización de las semillas en un flujo laminar con una superficie esterilizada UV durante 15 minutos.
   2. Añadir la solución de lejía a ~ 100-200 semillas S. parvula en un tubo de 1,5 mL. Mezcle bien y deje el tubo durante 5 minutos.
   3. Quitar el clo....

Resultados

Hemos desarrollado un protocolo de transformación que permite recolección de semillas de T₀ a 150 días, utilizando un método de inmersión floral modificado de la de a. thaliana. La figura 1 muestra un resumen de la línea de tiempo y S. parvula plantas que representan la etapa óptima para ejecutar la transformación a través de floral dip. Se seleccionaron S. parvula plantas con 70 –80 flores en inflorescencias múltiples a .......

Discusión

El estado fisiológico de la planta influye significativamente en la eficiencia de transformación²⁵. El uso de plantas sanas y vigorosas para la transformación es un requisito clave para la exitosa transformación en S. parvula. Agua o luz plantas tendrán menos flores en comparación con las plantas saludables ideales para la transformación (figura 1, panel central). Parvula de S. puede crecer en una intensidad de luz inferior a 130 μmol m^-2 .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agar	VWR International, Radnor, PA	90000-762	Bacto Agar Soldificante, BD Diagnostics
Vitaminas B5	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G1019	Gamborg' s Desecante de solución vitamínica
	W A Drierita Hammond, Xenia, OH	22005	Malla indicadora de DRIERITA 6
Vector de destino para la transformación de plantas	Vector TAIR	:6531113857	pKGWFS7
Cubeta de electroporación	USA Scientific	9104-5050	Cubeta de electroporación, tapa redonda, espacio de 0,2 cm
Electroporator	BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA	1652100	MicroPulser Electroporator
Perlas de fertilizante	Osmocote Garden, Marysville, OH	N/A	Osmocote Smart-Release Plant Food  Flor & Kit
extracción de gel	iNtRON Biotechnology, Boston, MA	17289	MEGAquick-spin Kit de purificación de ADN de fragmentos totales
Gentamicin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G1914-5G	Sulfato de gentamicina
Herbicida glufosinato de amonio (11,3%) (BASTA)	Bayer environmental science, Montvale, N	/A	FINALE herbicida
Kanamycin	VWR International, Radnor, PA	200004-444	Monosulfato de kanamicina
MES	Bioworld, Dublín, OH	41320024-2	MES, sal MS ácida libre
	MP Biomedicals, Santa Anna, CA	092621822	Mezcla de sales basales basales modificadas de Hoagland
N6-bencilaminopurina (BA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B3274	Solución de 6-benzilaminopurina
NaCl	Sigma-Alrich	S7653	Cloruro de sodio
Detergente no iónico	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	9005-64-5	TWEEN 20
Kit de aislamiento de plásmidos	Zymo Research, Irvine, CA	D4036	Kits de plásmidos Zyppy Kit
mezcla de enzimas recombinasas	Life Technology	11791-020	Gateway LR Clonasa II Mezcla de enzimas
Rifampicina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	R3501-1G	Rifampicina, polvo, ≥ 97% (HPLC)
Incubadora de agitación	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA	SHKE4450	MaxQ 4450 Agitadores orbitales de sobremesa
Mezcla de tierra	Sun Gro	SUN239223328CFLP	Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix
Spectinomycin	VWR International, Radnor, PA	IC15206705
Tubos cónicos estériles de 50 ml	USA Scientific, Ocala, FL	1500-1811	50 mL tubos cónicos con tapón de rosca, copolímero, gradillas,
sacarosa	VWR International, Radnor, PA	57-50-1	Sacarosa, solución de
surfactante	Semillas de Lehle, Round Rock, TX	VIS-02	Silwet L-77
Kit de clonación a base de topoisomerasa	Life Technologies, Carlsbad, CA	K240020	Kit de clonación pENTR/D-TOPO, con One Shot TOP10 Químicamente Competente E. coli
Triptona	VWR International, Radnor, PA	90000-282	BD Bacto Tryptone, BD Biosciences
Extracto de levadura	VWR International, Radnor, PA	90000-722	Extracto de levadura BD Bacto, BD Biosciences

de vegetal de estéril ACS