Ingeniería de genoma CRISPR Cas9 basado en generar modelos de Jurkat reportero para infección por VIH-1 con los sitios seleccionados integración Proviral

Resumen

Presentamos un flujo de trabajo de ingeniería de genoma por la generación de nuevos modelos in vitro para la infección por VIH-1 que recapitular integración proviral en sitios genómicos. Ataques contra reporteros derivados del VIH es facilitada por la manipulación del genoma mediada por Cas9 CRISPR, site-specific. Cuentan con protocolos detallados unicelular clon generación, detección y verificación dirigida a corregir.

Resumen

Virus de inmunodeficiencia humana (VIH) se integra su ADN proviral en el genoma celular de host en sitios recurrentes y puntos calientes genómicas no-al azar. Aquí presentamos un protocolo detallado para la generación de nuevos modelos in vitro para la infección por el VIH con los sitios de integración genómica solicitadas usando tecnología ingeniería CRISPR Cas9 basado en genoma. Con este método, una secuencia de reportero de elección puede integrarse en un locus genómico específico, solicitado, reflejando sitios clínicamente relevantes de la integración.

En el protocolo, el diseño de un reportero derivados del VIH y la elección de una secuencia Diana de sitio y gRNA se describen. Un vector apuntado con armas de homología se construye y transfected en las células de Jurkat T. La secuencia del reportero está dirigida al sitio genómico seleccionado por recombinación homóloga facilitado por una rotura de doble cadena mediaron Cas9 en el sitio de destino. Sola célula clones generadas y proyectadas para apuntar eventos por citometría de flujo y PCR. Clones seleccionados se expanden, y orientación correcta se verifica mediante PCR, secuenciación y borrar meridional. Se analizan los potenciales eventos fuera del objetivo de la ingeniería del genoma mediada por Cas9 CRISPR.

Mediante el uso de este protocolo, sistemas de cultivo celular novela puede generarse la infección por VIH modelo en sitios clínicamente relevantes de la integración. Aunque la generación de clones de unicelular y verificación de integración de secuencia correcto periodista son desperdiciador de tiempo, las líneas clonales que son herramientas poderosas para analizar funcionalmente la elección del sitio de integración proviral.

Introducción

Integración del ADN proviral en el genoma del anfitrión a la infección es un paso crítico en el ciclo vital del virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Tras la integración, el VIH persiste mediante el establecimiento de latencia en subconjuntos de células T CD4 + duraderos como células de memoria T CD4 +. Integración del VIH parece ser no-al azar^1,2. Un número de hotspots genomic ADN proviral integrado recurrentemente se ha detectado en varios estudios a través de la secuenciación de los sitios de integración en los individuos infectados agudo y crónico^2,3<....

Protocolo

1. segmentación estrategia de genoma ingeniería y orientación diseño vectorial (tv)

Nota: El primer paso de la ingeniería del genoma implica selección y generación de las herramientas necesarias para mediado de Cas9 CRISPR apuntar. Selección de un lugar del sitio de integración genómica, elección del tipo de célula para apuntar y el diseño de un reportero derivados del VIH para la integración deben preceder a este paso. Este protocolo describe la focalización de un reportero mínimo VIH-LTR_tdTomato_BGH-PA en las células de Jurkat blanco. Un diagrama de flujo del flujo de trabajo para CRISPR Cas9 basado en targeting, generació....

Resultados

En este experimento representativo hemos elegido a un reportero de VIH-1-derivado mínimo que consta de un litro, tdTomato codificación secuencia y secuencia señal de polyA para dos loci en el intrón 5 BACH2 gen¹⁷. Los loci para apuntar al blanco fueron escogidos según la proximidad a sitios de integración recurrente publicado encontrado en diversos estudios sobre las células T primarias de pacientes VIH-infectados^2,

Discusión

Aquí, describimos un protocolo para generar modelos de reportero de VIH-1-derivadas de Jurkat con sitios de integración proviral elegido aplicar ingeniería CRISPR Cas9 basado en genoma.

Varios puntos del protocolo requieren especial atención durante la fase de planificación. En primer lugar, el lugar geométrico de a debería ser elegido cuidadosamente, como algunos loci podrían ser más fáciles al destino que otros (por ejemplo,, dependiendo del estado de la cromatina de la región y el .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9	Addgene	42230	vector para la expresión de SpCas9 y gRNA
pMK	GeneArt		vector de expresión de mamíferos para la clonación de
cDNA3.1	Invitrogen	V79020	vector de expresión de mamíferos para la clonación
BbsI	New England Biolabs	R0539S	enzima de restricción
NEBuilder Hifi DNA Kit de clonación de ensamblaje	New England Biolabs	E5520S	Kit de clonación de ensamblaje utilizado para la generación de vectores
objetivo Sistema de PCR de precisión TaqPlus	Agilent Technologies	600210	con actividad de corrección utilizada para la amplificación de brazos de homología (paso 1.2.2.2), verificación del sitio de integración y secuencia reportera (paso 3.3.3 y 3.3.5), generación de sonda genómica para Southern blot (paso 3.4.1.5) y análisis de eventos fuera del objetivo (Paso 3.5.4)
Placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos (parte inferior redonda)	TPP	92097	para la placa de dilución
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad	New England Biolabs	M0530 L	polimerasa utilizada para la detección de eventos de focalización (paso 2.4.2) y generación de sonda específica para Southern blot (paso 3.4.1.4)
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D9170	dimetilsulfóxido como PCR aditivo
Solución de cloruro de magnesio (MgCl2) Solución de	MgCl2 de	England Biolabs
Mezcla de solución de desoxinucleótidos (dNTP)	N0447S	New England Biolabs	con 10 mM de cada nt para reacciones de PCR
5PRIME HotMasterMix	5PRIME	2200400	lista para usar utilizada para el cribado de PCR (paso 3.2.11)
QIAamp DNA blood mini kit	Qiagen	51106	kit de aislamiento y purificación de ADN
QIAquick PCR Kit de purificación	Qiagen	28106	PCR kit de purificación
RPMI 1640 sin glutamina	Lonza	BE12-167F medio de	cultivo celular
Suero fetal bovino Sudáfrica Charge	PAN Biotech	P123002	suplemento
de medio de cultivo celularL-glutamina	Biochrom	K 0282	suplemento de medio de cultivo celular
Penicilina/Estreptomicina 10.000 U/mL/ 10.000 µ g/mL	Biochrom	A 2212	suplemento de medio de cultivo celular
Gibco Opti-MEM Medios de suero reducidos	Thermo Fisher Scientific	31985062	medio de cultivo celular con concentración sérica reducida optimizado para la transfección
TransIT-Jurkat	Mirus Bio	MIR2125	reactivo de transfección
forbol 12-miristato 13-acetato	Sigma-Aldrich	P8139-1MG	cultivo celular reactivo
Ionomicina	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	reactivo de cultivo celular
Unidad de filtro accionada por jeringa, membrana PES, 0,22 y micro; m	Millex	SLGP033RB	unidad de filtrado para filtración estéril
Incubadora Heracell 150i	Thermo Fisher	51026280	incubadora de cultivo
de tejidos Amershan Hybond-N+	GE Healthcare	RPN1520B	membrana de nylon cargada positivamente para transferencia de ADN y ARN
Stratalinker 1800	Stratagene	400072	reticulante UV
High Prime	Kit	11585592001	para el marcaje de ADN con dCTP radiactivo utilizando oligonucleótidos aleatorios como cebadores ilustrar
microcolumnas ProbeQuant G-50 GE	Healthcare	28-9034-08	de centrifugación de cromatografía para la purificación de ADN marcado

ADN polimerasa Placas de cultivo de tejidos ADN New como solución de sub2/sub como aditivo para PCR de Scientific de Roche las columnas