Aquí, se presenta un protocolo para el cribado rápido no destructivo de genotipos de algodón para la resistencia a los nematodos reniformes. El protocolo consiste en examinar visualmente las raíces de las plántulas de algodón infectadas por nematodos para determinar la respuesta a la infección. El brote vegetativo de cada planta se propaga para recuperar las plantas para la producción de semillas.
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Selección de genotipos de algodón para la resistencia de los nematodos reniformes
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Resumen
Resumen
Se necesita un protocolo de cribado rápido de nematodo reniforme no destructivo (Rotylenchulus reniformis) para el desarrollo de variedades de algodón resistente (Gossypium hirsutum) para mejorar el manejo del nematodo. La mayoría de los protocolos implican la extracción de nematodos o huevos vermiformes del sistema radicular de algodón o el suelo de maceta para determinar la densidad de población o la tasa de reproducción. Estos enfoques generalmente consumen mucho tiempo con un pequeño número de genotipos evaluados. Aquí se describe un enfoque alternativo en el que el sistema radicular se examina visualmente para detectar la infección por nematodos. El protocolo consiste en inocular la plántula de algodón 7 días después de la plantación con nematodos vermiformes y determinar el número de hembras unidas al sistema radicular 28 días después de la inoculación. Los datos se expresan como el número de hembras por gramo de peso fresco de la raíz para ajustar para la variación en el crecimiento de la raíz. El protocolo proporciona un método excelente para evaluar la resistencia huésped-planta asociada con la capacidad del nematodo para establecer un sitio de infección; sin embargo, no se evalúa la resistencia que dificulta la reproducción de nematodos. Al igual que con otros protocolos de cribado, la variación se observa comúnmente en la infección por nematodos entre genotipos individuales dentro y entre experimentos. Los datos se presentan para ilustrar el rango de variación observado mediante el protocolo. Para ajustar esta variación, los genotipos de control se incluyen en los experimentos. No obstante, el protocolo proporciona un método sencillo y rápido para evaluar la resistencia de la planta de host. El protocolo se ha utilizado con éxito para identificar las adhesiones resistentes de la G. arboreum germplasm recoger y evaluar poblaciones segregantes de más de 300 individuos para determinar la genética de la resistencia. También se desarrolló un método de propagación vegetativa para la recuperación de plantas para la cría de resistencia. Después de la eliminación del sistema radicular para la evaluación de nematodos, el brote vegetativo se replanta para permitir el desarrollo de un nuevo sistema radicular. Más del 95% de los brotes suelen desarrollar un nuevo sistema radicular con plantas que alcanzan la madurez.
Introducción
Rotylenchulus reniformis (Linford y Oliveira), comúnmente conocido como el nematodo reniforme, es una de las principales especies de nematodos parásitos presentes en los suelos del sureste de los Estados Unidos1,2,3. El nematodo es un semiendoparásito obligatorio y sedentario que requiere que unaplanta anfitriona complete su ciclo de vida 2,4. Los nematodos hembras preadultos vermiformes penetran en elsistema radicular del huésped para establecer un sitio de alimentación en la estela 2,3. A medida que el nematodo se alimenta y madura, la porción posterior que queda fuera de la raíz del huésped se hinchará tras la producción de óvulos, formando una forma renal característica (Figura1). Rotylenchulus reniformis es capaz de alimentarse del sistema radicular demás de 300 especies de plantas, incluyendo algodón 4. Algodón americano(Gossypium hirsutum L.) es ampliamente cultivado en el sureste de los Estados Unidos, pero la falta de R. las variedades resistentes a reniformis dificultan la gestión de nematodos2,3. Se han utilizado estrategias de gestión como el tratamiento y rotación de nematicidas con especies de cultivos no albergadores para reducir el suelo R. densidades de población de reniformis 5,6, pero las pérdidas de rendimiento de algodón de semilla pueden variar comúnmente de 1 a 5%2. Síntomas de R. infección por reniformis puede incluir retraso en las plantas, crecimiento de la raíz suprimido, deficiencias nutricionales, aborto de frutas, y retraso en la madurez2. Sin embargo, los síntomas pueden no ser evidentes debido a la uniformidad de los síntomas en todo el campo; por lo tanto, enfoques para evaluar R. se necesitan reniformis para identificar y desarrollar variedades resistentes de algodón americano (upland). Evaluación de R. resistencia a los reniformis en el algodón se considera difícil7, porque el sistema radicular infectado puede parecer normal a pesar de que la planta puede mostrar síntomas de infección8.
Se requiere un protocolo eficaz de detección de nematodos para la identificación de R. adhesiones resistentes a los reniformis de la colección de germoplasma de algodón y para la determinación de la genética de resistencia para estas adhesiones. Este protocolo ayudará en la transferencia de genes de resistencia al algodón americano (upland). Se han utilizado varios métodos de bioensayo para evaluar R. infección por reniformis en algodón8,9,10,11,12,13,14,15. En general, se han utilizado dos enfoques principales para la identificación de R. genotipos de algodón resistentes a los reniformis. El enfoque más utilizado consiste en extraer huevos y/o nematodos vermiformes de plantas infectadas o suelo8,11,12,14,15. La metodología general para este enfoque consiste en plantar semillas para los genotipos individuales del algodón en macetas separadas, permitiendo que las plántulas se desarrollen durante 7 a 14 días, inoculando las plántulas añadiendo una mezcla de etapas vermiformes de R. reniformis al suelo, y permitiendo que los nematodos infecten el sistema radicular durante 30 a 60 días. A continuación, los nematodos vermiformes y/o los huevos se extraen del sistema radicular infectado de cada planta o del suelo de maceta. A continuación, se determina el número de nematodos o huevos extraídos para estimar la densidad de población y la tasa de reproducción, que se comparan con los genotipos de control para identificar genotipos resistentes.
Un enfoque alternativo, como se describe aquí, implica examinar microscópicamente el sistema radicular de algodón que ha sido infectado con nematodos para determinar el número de nematodos femeninos parasitando las raíces10,16. Al igual que otros enfoques, los genotipos de algodón se plantan en macetas separadas y se inoculan con nematodos vermiformes aproximadamente 7 días después de la siembra. Dentro de los 30 días después de la inoculación, el sistema radicular se elimina de plantas individuales y el suelo se enjuaga de las raíces. A continuación, los nematodos unidos al sistema radicular están teñidos con colorante alimentario rojo17,y las raíces se examinan microscópicamente para determinar el número de sitios de infección con genotipos de algodón resistentes (identificados en función del número de nematodos por gramo de raíz) en comparación con un control susceptible16. Este segundo enfoque tiene la ventaja de aumentar el rendimiento al reducir el número de días necesarios para la evaluación y aumentar el número de genotipos individuales evaluados en un solo experimento. Las metodologías de cribado que evalúan la densidad de población o la tasa de reproducción suelen llevar más tiempo que las basadas en observaciones visuales de los signos de infección7. Sin embargo, una limitación de este enfoque es que no se evalúa la resistencia huésped-planta que dificulta la reproducción de nematodos determinada por la producción de óvulos13.
Protocolos de cribado para R. resistencia a los reniformis a menudo destruyen el sistema radicular durante la evaluación7 e implican el brote vegetativo que se desecha. Para superar esta limitación, se ha desarrollado un método de propagación vegetativa que permite la recuperación de plantas para la producción de semillas18. Después de la eliminación del sistema radicular para la evaluación de nematodos, el brote vegetativo se planta en el suelo de maceta para permitir que el sistema radicular vuelva a crecer. Este método tiene amplias aplicaciones para la mayoría de R. protocolos de cribado de reniformis. Un método simple y rápido de propagación vegetativa es de importancia crítica para la cría R. reniformis variedades de algodón americano (upland) resistentes, donde la recuperación de la progenie es necesaria para avanzar genotipos resistentes a la próxima generación.
Se presenta un protocolo para el cribado a gran escala de genotipos de algodón para la resistencia al nematodos reniforme. El objetivo es desarrollar un método de cribado no destructivo simple y rápido para evaluar las poblaciones de cría de algodón en busca de resistencia a los nematodos con el fin de ayudar en la cría de variedades resistentes de algodón americano (upland). Con este protocolo, los datos se obtienen normalmente en un plazo de 35 días, con más de 300 genotipos evaluados en un solo experimento. Se presentan datos para genotipos resistentes y susceptibles para ilustrar la variación comúnmente observada utilizando estos métodos.
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Protocolo
1. Mantenimiento de una fuente de R. reniformis Inóculo
- Llenar las ollas de arcilla de terracota (15 cm de diámetro, 13,5 cm de altura) con una mezcla pasteurizada al vapor de 1 parte de arena arenosa y arena de 2 partes. Plantar una variedad de tomate susceptible (Solanum lycopersicon) en cada olla y colocar las ollas en un invernadero.
NOTA: Se pueden utilizar otras variedades vegetales susceptibles como el algodón en lugar del tomate. - Inocular las plantas de tomate con nematodos reniformato vermiformes (ver paso 3.3). Mantener las plantas en el invernadero a una temperatura de aproximadamente 28 oC.
2. Plantación de genotipos de algodón para R. reniformis Evaluación de la resistencia
- Preparar el suelo combinando arena fina de 2 partes con loam arenoso de 1 parte recogido del campo.
- Pasteurizar al vapor la mezcla del suelo para asegurarse de que el suelo está libre de nematodos y patógenos vegetales transmitidos por el suelo.
- Añadir la mezcla de suelo a las macetas de plástico cónico (4 cm de diámetro, 21 cm de altura). Antes de llenar las ollas, coloque una bola de algodón en la parte inferior de la olla para evitar la pérdida de suelo. Llenar parcialmente las macetas con tierra aproximadamente a 2 cm de la parte superior.
- Preparar una estaca de plástico para cada maceta para designar el genotipo a plantar.
- Semillas vegetales de los genotipos de algodón seleccionados para su evaluación.
- Plantar una sola semilla en cada maceta para la evaluación de las poblaciones segregadoras, en la que cada semilla representa un genotipo único.
- En el caso de las variedades de algodón o las adhesiones al germoplasma, plantar de 2 a 3 semillas en una sola olla para asegurar la germinación de al menos una planta con las otras plántulas retiradas de las macetas antes de la inoculación de nematodos.
Nota: Alternativamente, las semillas se pueden germinar durante 24 a 72 h antes de la siembra para minimizar el número de macetas con semillas no viables.
- Semillas vegetales de genotipos de control resistentes y susceptibles seleccionados.
Nota: Los genotipos de control se replican de 5 a 10 veces para evaluar las variaciones naturales inherentes a la metodología de cribado. - Llene las ollas con tierra adicional para cubrir la semilla en cada olla.
- Coloque las macetas en la cámara de crecimiento. Mantener una temperatura constante de 28oC, una temperatura ambiente del aire, para la cámara de crecimiento. Proporcionar iluminación artificial con una mezcla de lámparas fluorescentes e incandescentes con un fotoperiodo de 16 h.
- Coloque los emisores de agua en cada olla y rietre las ollas dos veces al día utilizando un sistema de riego automático. Ajuste el sistema de riego para suministrar agua adicional a medida que la planta crece.
3. Inoculación de nematodos de plantas de algodón y preparación de muestras de raíz
- Extraer nematodos reniformes vermiformes mantenidos en plantas de tomate susceptibles (ver paso 1) utilizando metodologías de elutriación19 y flotación centrífuga20 el día antes de la inoculación. Conservar los nematodos extraídos a 4oC.
NOTA: La extracción21 del embudo de Baermann es un método alternativo para la extracción de nematodos. - Determinar el número de nematodos extraídos contando el número de nematodos en una submuestra de 100 l y preparar una suspensión de 1.000 nematodos/ml en agua del grifo para inoculaciones.
- Inocular las plántulas de algodón 7 d después de la plantación con la suspensión de nematodo. Crear una pequeña depresión en el suelo junto a la planta, y pipetear 1 ml de la suspensión de nematodos reniformes en la depresión.
- Retire las plantas de las macetas 28 d después de la inoculación para la evaluación de nematodos.
NOTA: En esta etapa, las plantas miden aproximadamente 15 cm de altura con 4 a 6 hojas completamente expandidas.- Retire la mayoría de las hojas completamente expandidas de las plantas usando tijeras antes de retirar las plantas de las macetas.
- Para eliminar las plantas de las macetas, apriete la olla y deslice el suelo hacia fuera en la mano.
- Retire suavemente el suelo de las raíces agitando el sistema radicular en agua del grifo en un recipiente de 10 L. Enjuague brevemente el sistema radicular en un recipiente con agua limpia del grifo.
- Retire el sistema radicular de la planta aproximadamente 1 cm por debajo de la línea del suelo utilizando tijeras.
- Coloque el sistema radicular en un recipiente de muestra desechable de plástico de 120 ml, no estéril, junto con la estaca de plástico de la olla utilizada para la identificación.
NOTA: Se procesan varias muestras antes de continuar con el paso 3.7. Continúe con el paso 4 para la propagación vegetativa del brote de la planta. - Preparar una solución del 12,5% (v/v) de colorante de alimentos rojos17 en agua del grifo para manchar los nematodos unidos al sistema radicular.
- Añadir aproximadamente 30 ml de la solución para colorear alimentos rojos a la muestra de raíz en el recipiente de la muestra para cubrir completamente el sistema radicular.
- Coloque el recipiente de la muestra en un horno microondas y caliente la muestra de raíz hasta que la solución de tinción comience a hervir. Retire la muestra del horno microondas y deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente.
- Decantar la solución de colorante de alimentos rojos de la muestra de raíz y añadir aproximadamente 100 ml de agua del grifo al recipiente de la muestra para eliminar el exceso de manchas. Coloque la cubierta en el recipiente de la muestra y guárdela en un refrigerador a 4 oC. Continúe con el paso 5 para la evaluación de la infección radicular.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí antes de continuar con el paso 5.
4. Propagación Vegetativa para Recuperar Plantas para la Producción de Semillas
- Coloque una bola de algodón en la parte inferior de una olla de plástico cónico (ver paso 2.3) y llene parcialmente la olla con un medio de maceta de musgo de turba. A continuación, coloque el brote vegetativo en la olla y agregue firmemente los medios de maceta para llenar la olla. Coloque una nueva estaca de plástico etiquetada en cada maceta para designar el genotipo de algodón.
- Coloque la bandeja de macetas en un recipiente de plástico (73,6 cm de largo x 45,7 cm de ancho x 15,2 cm de alto) con agua y regar brevemente las plantas para humedecer los medios de maceta. Colocar las macetas en una cámara de crecimiento con una temperatura constante de 28 oC utilizando un fotoperiodo de 16 h. Agregue agua adicional al recipiente de plástico según sea necesario para mantener la humedad del suelo.
- Trasplantar las plantas a macetas más grandes para la producción de semillas después de aproximadamente 30 d. Llenar parcialmente una olla de plástico de 6 L con medios de maceta (ver paso 4.1), retirar la planta de la olla pequeña, colocar la planta en la olla de 6 L, y agregar firmemente medios de maceta para llenar la olla.
- Coloque las plantas en un invernadero y agregue agua para humedecer los medios de maceta. Mantener la temperatura en el invernadero a aproximadamente 28 oC (no se requiere iluminación artificial).
- Plantas de agua a mano según sea necesario durante aproximadamente 30 d.
- Cuando aproximadamente el 75% de las plantas requieren riego diario, las plantas de agua diariamente utilizan dotan a un sistema de riego automático. Ajuste el sistema de riego automático al agua con más frecuencia según sea necesario para el crecimiento de la planta.
- Añadir aproximadamente 10 g de un fertilizante de liberación lenta a cada maceta antes del inicio de la iniciación floral.
- Cosecha de plantas en la madurez y procesa las muestras de semillas de algodón para obtener semillas para su posterior evaluación.
- Para cosechar semillas de algodón, retire el algodón de las bolas abiertas de la planta a mano y colóquelo en una bolsa de papel etiquetada. Las semillas se unen a las fibras de algodón, que se eliminan en los siguientes pasos.
- Retire las fibras de pelusa de las muestras de semillas utilizando una ginebra de laboratorio de 10 sierras.
- Retire las fibras de pelusa de las muestras de semillas utilizando ácido sulfúrico concentrado. Neutralice las muestras de semillas en una solución de carbonato sódico del 15% (v/v), enjuague las muestras con agua del grifo y seque las muestras en un secador de aire forzado.
- Coloque las muestras de semillas en sobres etiquetados para su almacenamiento.
5. Evaluación de R. reniformis Infección de raíz
- Retire la muestra de raíz del recipiente de la muestra y cuente el número de nematodos hembras conectados al sistema radicular utilizando un estereomicroscopio (aumento 20X).
NOTA: Sólo los nematodos reniformes femeninos son capaces de infectar las raíces de las plantas. - Coloque el sistema radicular sobre las toallas de papel durante aproximadamente 10 minutos para eliminar el exceso de humedad. Pesar el sistema radicular para determinar el peso fresco de la raíz.
- Introduzca el recuento de nematodos y los nuevos datos de peso de raíz en un programa de hoja de cálculo de computadora y calcule el número de mujeres por gramo de raíz.
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Resultados
La infección por Rotylenchulus reniformis del sistema radicular para dos variedades se presenta en la Figura1. Relativamente menos nematodos reniformes femeninos son capaces de establecer un sitio de alimentación para el genotipo de algodón resistente en comparación con el genotipo susceptible. La variación en el crecimiento de la raíz es común entre las adhesiones, como se ilustra en la Figura2. Esta variación medida po...
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Discusión
Se requiere un protocolo de cribado eficaz para 1) la identificación de R. genotipos de algodón resistentes a reniformis para evaluar la genética de la resistencia y 2) la cría de variedades resistentes. La mayoría de los protocolos evalúan R. densidades de población de reniformis o tasas de reproducción mediante la extracción de nematodos o huevos vermiformes del sistema radicular de algodón o suelo de maceta8,11,
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, Servicio de Investigación Agrícola. La mención de nombres comerciales y productos comerciales en este artículo es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendaciones o endosos por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. USDA es un proveedor y empleador de igualdad de oportunidades. Los autores no tienen conflicto de intereses que declarar. Kristi Jordan prestó asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ray Leach Cone-tainer | Stuewe and Sons Inc. | SC10U | |
| Stuewe and Sons Inc. | RL98 | ||
| Arena | varias | ||
| Bolas de algodón | varias | ||
| Pilón Etiquetas de plantas de 4 pulgadas (4 en L x 5/8 en W) | Placas de pilón | L-4-W | Cualquier marca o proveedor es aceptable. |
| Contenedores de muestras de 4 onzas | Fisher Scientific | 16-320-731 | Se acepta cualquier marca o proveedor. |
| Colorante alimentario rojo | McCormick & Co., Inc. | ||
| Puntas de pipeta de 1 mL | varios | ||
| recipientes de 10 L | varios | cubos económicos funcionan bien. | |
| Macetas de 6 L | Nursery Supplies Inc. | Poly-Tainer-Can No2A | Cualquier marca o proveedor es aceptable. Se pueden utilizar macetas de diferentes tamaños |
| Medios para macetas | Sun Gro Horticulture | Metro-Mix 360 | Se acepta cualquier marca o proveedor. |
| Fertilizante | Everris NA Inc. | Osmocote Plus | Cualquier marca o proveedor es aceptable. |
| Contenedor de plástico (73,6 cm de largo x 45,7 cm de ancho x 15,2 cm de profundidad) | Rubbermaid | 3O29 | Cualquier marca o proveedor es aceptable. |
Referencias
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