Captura e identificación de proteínas de unión a RNA usando Click química asistida por ARN-interactoma capturan (CARIC) estrategia

Rongbing Huang; Mengting Han; Liying Meng; Xing Chen

doi:10.3791/58580

Artículo de método

Captura e identificación de proteínas de unión a RNA usando Click química asistida por ARN-interactoma capturan (CARIC) estrategia

DOI:

10.3791/58580

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19 de octubre de 2018

Rongbing Huang^*¹^,² , Mengting Han^*¹^,² , Liying Meng¹^,³ , Xing Chen¹^,²^,³^,⁴^,⁵

¹College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking University, ²Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Peking University, ³Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Peking University, ⁴Synthetic and Functional Biomolecules Center, Peking University, ⁵Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, Peking University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Un protocolo detallado para la aplicación de la haga clic en ayuda de química RNA interactoma estrategia de captura (CARIC) para identificar proteínas de enlace de codificación de ambas y los RNAs se presenta.

Resumen

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Una completa identificación de proteínas de unión a RNA (restrictivas) es clave para entender la red de regulación postranscripcional en las células. Una estrategia ampliamente utilizada para la captura RBP explota la poliadenilación [poly(A)] de RNAs de destino, que ocurre sobre todo en eukaryotic mRNAs maduros, dejando la mayoría proteínas de non-poly(A) RNAs no identificados. Aquí describimos los procedimientos detallados de un método reciente denominado haga clic en ayuda de química RNA interactoma captura (CARIC), que permite la captura de todo el transcriptoma de poly(A) y non-poly(A) restrictivas combinando el etiquetado metabólico de RNAs en vivo UV Cross-linking y etiquetado bioorthogonal.

Introducción

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El genoma humano se transcribe en distintos tipos de codificación y noncoding RNAs (ncRNAs), incluyendo mRNAs, rRNAs y tRNAs, ARNs nucleares pequeños (snRNAs), RNAs nucleolares pequeño (ARNnop ' s) y largo no-codificación RNAs (lncRNAs)¹. La mayoría de estos RNAs posee ropa de prácticas comerciales restrictivas y funciona como ribonucleoproteína partículas (RNPs)². Por lo tanto, una identificación integral de prácticas comerciales restrictivas es un prerrequisito para la comprensión de la red reguladora entre RNAs y prácticas comerciales restrictivas, que está implicada en varias enfermedades humanas³

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Protocolo

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PRECAUCIÓN: Cuando sea aplicable, los reactivos usados deben comprar en forma de libre de Rnasa, o disuelto en libre de Rnasa, solventes (para la mayoría de los casos, en dietil pirocarbonato (DEPC)-agua tratada). Al manipular las muestras de RNA y reactivos libres de Rnasa, siempre use guantes y máscaras y cambiarlos frecuentemente para evitar la contaminación de la Rnasa.

1. preparación de lisado de etiquetado metabólico y las células reticuladas UV

Incorporación metabólica de UE y 4SU
1. Células HeLa de cultura en el medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS)....

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Resultados

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Se presentan los resultados representativos de pasos de control de calidad. Los resultados incluyen figuras de análisis en gel fluorescencia descrito en el paso 2.3.2 (figura 1), el análisis de western blot que se describe en el paso 4.1.3 (figura 2A) y el análisis de coloración de plata que se describe en el paso 4.2.2 (figura 2B). Las medidas de control de calidad son críticas para la optimización .......

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Discusión

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El mantenimiento de la integridad de RNA Feria es una de las claves del éxito experimentos CARIC. Con ligandos apropiados de Cu(I) y cuidado, degradación de RNA puede reducirse significativamente, aunque se observó degradación parcial. La sustitución de la UE y 4SU en muestras experimentales son 1.18% y 0,46%, respectivamente (datos no mostrados). Para RNAs intactos con una longitud de 2.000 nt, ~ 90% de los ARN contienen por lo menos un UE y uno 4SU. Para RNAs parcialmente degradados con una longitud de 1.000 nt, ~ 70% .......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo es apoyado por la nacional Ciencias naturales Fundación de China becas 91753206, 21425204 y 21521003 y por la nacional clave de investigación y proyecto de desarrollo 2016YFA0501500.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
HeLa	ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Thermo Fisher Scientific	11995065
FBS (Suero fetal bovino)	Thermo Fisher Scientific	10099141
Penicilina & Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122
UE (5-etiniluridina)	Wuhu Huaren Co.	CAS:69075-42-9
4SU (4-tiouridina)	Sigma Aldrich	T4509
10× PBS (solución salina tamponada con fosfato)	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Reticulante UV	UVP	CL-1000	Equipado con lámpara UV de 365 nm
DEPC (pirocarbonato de dietilo)	Sigma Aldrich	D5758	Para tratar el agua. ¡Altamente tóxico!
Tris· HCl, pH 7,5	Thermo Fisher Scientific	15567027
LiCl	Sigma Aldrich	62476
Nonidet P-40	Biodee	74385
Cóctel de inhibidores de proteasas sin EDTA	Thermo Fisher Scientific	88265	Un comprimido para 50 ml de tampón de lisis.
LDS (Dodecil sulfato de litio)	Sigma Aldrich	L9781
Tubo de ultrafiltración de 15 mL (corte de 10 kDa)	Millipore	UFC901024
tubo de ultrafiltración de 0,5 mL (corte de 10 kDa)	Millipore	UFC501096
Perlas magnéticas de estreptavidina	Thermo Fisher Scientific	88816
DMSO (sulfóxido de dimetilo)	Sigma Aldrich	41639
Azida-biotina	Click Chemistry Tools	AZ104
Sulfato de cobre (II)	Sigma Aldrich	C1297
THPTA [Tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina]	Sigma Aldrich	762342
Ascorbato de sodio	Sigma Aldrich	11140
Azide-Cy5	Click Chemistry Tools	AZ118
Tampón de muestra LDS (4 veces)	Thermo Fisher Scientific	NP0008
10% bis-Tris gel	Thermo Fisher Scientific	NP0301BOX
EDTA	Thermo Fisher Scientific	AM9260G
ARNasa A	Sigma Aldrich	R6513
SDS (Dodecil sulfato de sodio)	Thermo Fisher Scientific	15525017
NaCl	Sigma Aldrich	S3014
Brij-97 [Éter oleílico de polioxietileno (20)]	J& K	315442
Trietanolamina	Sigma Aldrich V900257
Estreptavidina agarosa	Thermo Fisher Scientific	20353
Urea	Sigma Aldrich	U5378
Sarkosyl (N-Lauroilsarcosina sal sódica)	Sigma Aldrich	61743
Biotina	Sigma Aldrich	B4501
Desoxicolato de sodio	Sigma Aldrich	30970
MaxQuant			Versión: 1.5.5.1

Referencias

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Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T.

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Metabolic Labeling UV Cross linking Bioorthogonal Tagging Streptavidin Agarose Beads Mass Spectrometry Western Blot Analysis In gel Fluorescence

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