Un protocolo detallado para la aplicación de la haga clic en ayuda de química RNA interactoma estrategia de captura (CARIC) para identificar proteínas de enlace de codificación de ambas y los RNAs se presenta.
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Artículo de método
Captura e identificación de proteínas de unión a RNA usando Click química asistida por ARN-interactoma capturan (CARIC) estrategia
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Resumen
Resumen
Una completa identificación de proteínas de unión a RNA (restrictivas) es clave para entender la red de regulación postranscripcional en las células. Una estrategia ampliamente utilizada para la captura RBP explota la poliadenilación [poly(A)] de RNAs de destino, que ocurre sobre todo en eukaryotic mRNAs maduros, dejando la mayoría proteínas de non-poly(A) RNAs no identificados. Aquí describimos los procedimientos detallados de un método reciente denominado haga clic en ayuda de química RNA interactoma captura (CARIC), que permite la captura de todo el transcriptoma de poly(A) y non-poly(A) restrictivas combinando el etiquetado metabólico de RNAs en vivo UV Cross-linking y etiquetado bioorthogonal.
Introducción
El genoma humano se transcribe en distintos tipos de codificación y noncoding RNAs (ncRNAs), incluyendo mRNAs, rRNAs y tRNAs, ARNs nucleares pequeños (snRNAs), RNAs nucleolares pequeño (ARNnop ' s) y largo no-codificación RNAs (lncRNAs)1. La mayoría de estos RNAs posee ropa de prácticas comerciales restrictivas y funciona como ribonucleoproteína partículas (RNPs)2. Por lo tanto, una identificación integral de prácticas comerciales restrictivas es un prerrequisito para la comprensión de la red reguladora entre RNAs y prácticas comerciales restrictivas, que está implicada en varias enfermedades humanas3
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Protocolo
PRECAUCIÓN: Cuando sea aplicable, los reactivos usados deben comprar en forma de libre de Rnasa, o disuelto en libre de Rnasa, solventes (para la mayoría de los casos, en dietil pirocarbonato (DEPC)-agua tratada). Al manipular las muestras de RNA y reactivos libres de Rnasa, siempre use guantes y máscaras y cambiarlos frecuentemente para evitar la contaminación de la Rnasa.
1. preparación de lisado de etiquetado metabólico y las células reticuladas UV
-
Incorporación metabólica de UE y 4SU
- Células HeLa de cultura en el medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS)....
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Resultados
Se presentan los resultados representativos de pasos de control de calidad. Los resultados incluyen figuras de análisis en gel fluorescencia descrito en el paso 2.3.2 (figura 1), el análisis de western blot que se describe en el paso 4.1.3 (figura 2A) y el análisis de coloración de plata que se describe en el paso 4.2.2 (figura 2B). Las medidas de control de calidad son críticas para la optimización .......
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Discusión
El mantenimiento de la integridad de RNA Feria es una de las claves del éxito experimentos CARIC. Con ligandos apropiados de Cu(I) y cuidado, degradación de RNA puede reducirse significativamente, aunque se observó degradación parcial. La sustitución de la UE y 4SU en muestras experimentales son 1.18% y 0,46%, respectivamente (datos no mostrados). Para RNAs intactos con una longitud de 2.000 nt, ~ 90% de los ARN contienen por lo menos un UE y uno 4SU. Para RNAs parcialmente degradados con una longitud de 1.000 nt, ~ 70% .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo es apoyado por la nacional Ciencias naturales Fundación de China becas 91753206, 21425204 y 21521003 y por la nacional clave de investigación y proyecto de desarrollo 2016YFA0501500.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| HeLa | ATCC | ||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| FBS (Suero fetal bovino) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Penicilina & Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| UE (5-etiniluridina) | Wuhu Huaren Co. | CAS:69075-42-9 | |
| 4SU (4-tiouridina) | Sigma Aldrich | T4509 | |
| 10× PBS (solución salina tamponada con fosfato) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Reticulante UV | UVP | CL-1000 | Equipado con lámpara UV de 365 nm |
| DEPC (pirocarbonato de dietilo) | Sigma Aldrich | D5758 | Para tratar el agua. ¡Altamente tóxico! |
| Tris· HCl, pH 7,5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | 62476 | |
| Nonidet P-40 | Biodee | 74385 | |
| Cóctel de inhibidores de proteasas sin EDTA | Thermo Fisher Scientific | 88265 | Un comprimido para 50 ml de tampón de lisis. |
| LDS (Dodecil sulfato de litio) | Sigma Aldrich | L9781 | |
| Tubo de ultrafiltración de 15 mL (corte de 10 kDa) | Millipore | UFC901024 | |
| tubo de ultrafiltración de 0,5 mL (corte de 10 kDa) | Millipore | UFC501096 | |
| Perlas magnéticas de estreptavidina | Thermo Fisher Scientific | 88816 | |
| DMSO (sulfóxido de dimetilo) | Sigma Aldrich | 41639 | |
| Azida-biotina | Click Chemistry Tools | AZ104 | |
| Sulfato de cobre (II) | Sigma Aldrich | C1297 | |
| THPTA [Tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina] | Sigma Aldrich | 762342 | |
| Ascorbato de sodio | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Azide-Cy5 | Click Chemistry Tools | AZ118 | |
| Tampón de muestra LDS (4 veces) | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| 10% bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0301BOX | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| ARNasa A | Sigma Aldrich | R6513 | |
| SDS (Dodecil sulfato de sodio) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Brij-97 [Éter oleílico de polioxietileno (20)] | J& K | 315442 | |
| Trietanolamina | Sigma Aldrich V900257 | ||
| Estreptavidina agarosa | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Sarkosyl (N-Lauroilsarcosina sal sódica) | Sigma Aldrich | 61743 | |
| Biotina | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Desoxicolato de sodio | Sigma Aldrich | 30970 | |
| MaxQuant | Versión: 1.5.5.1 |
Referencias
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
- Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T.
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Reimpresiones y permisos
