Method Article

Un método basado en el Micro-CT para caracterizar las lesiones y la localización de electrodos en cerebros de animales pequeños

DOI:

10.3791/58585

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November 8th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, 2Center for Brain Science, Harvard University, 3Department of Organismic and Evolutionary Biology, Harvard University, 4Institute of Science and Technology Austria

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo describe un método sencillo para preparar pequeños cerebros animales micro-CT en la proyección de imagen, en que las lesiones se pueden cuantificar y electrodos con alta precisión en el contexto de todo el cerebro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verificación de localización de lesión y electrodo tradicionalmente se realizan a través de la examinación histológica de rebanadas de cerebro manchada, un procedimiento desperdiciador de tiempo que requiere la estimación manual. Aquí, describimos un método simple y directo para cuantificar las lesiones y localización de los electrodos en el cerebro que es menos laborioso y produce resultados más detallados. Cerebro entero es teñida con tetróxido de osmio, incrustado en resina y fotografiada con un explorador micro-CT. Las exploraciones como resultado volúmenes digitales 3D de los cerebros con resoluciones y espesores de la sección virtual depende del tamaño de muestra (12 – 15 y 5 – 6 μm por voxel para rata y Pinzón de la cebra de cerebros, respectivamente). Lesiones superficiales y profundas pueden ser caracterizadas y solo tetrodos, arreglos de discos de tetrodo, lesiones electrolíticas, y sondas de silicio también pueden ser localizadas. Software libre y propietario permite experimentadores examinar el volumen de la muestra desde cualquier plano y el volumen del segmento manualmente o automáticamente. Debido a que este método genera volumen de todo el cerebro, lesiones y electrodos pueden cuantificarse en un grado mucho más alto que en los métodos actuales, que le ayudará a estandarizar las comparaciones dentro y a través de estudios.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurocientíficos han dependido de las lesiones durante mucho tiempo para entender la relación entre la función y ubicación en el cerebro. Por ejemplo, nuestra comprensión del hipocampo como indispensable para el aprendizaje y la memoria y de la corteza prefrontal como clave para el control de los impulsos era ambos productos de serendipidad lesiones en los seres humanos1,2. El uso de modelos animales, sin embargo, ha permitido neurocientíficos aprovechar el poder de las lesiones por ir más allá de serendipity, y la función de numerosas áreas del cerebro ha sido dilucidada a través de estudios sistemáticos de las relaciones estructura y función a través de las lesiones de3,4.

Para asignar correctamente la función a una estructura, sin embargo, estudios de lesión requieren procedimientos de cuantificación precisa, que es un área que ha sido. El estándar de oro actual para la cuantificación de las lesiones es a sección, montaje y cerebros de imagen con un microscopio de luz. Las rebanadas de la imagen luego se corresponden a las secciones más cercanas en un atlas, y las coordenadas aproximadas de las lesiones a través de temas se comunican indirectamente, a menudo mediante el uso de imágenes de cámara lúcida o ejemplo cortes histológicos3,4 ,5,6,7,8,9,10.

Más allá de la imprecisión de los procedimientos de cuantificación de lesión actual, estas técnicas son lentos y propensos al fracaso. Pequeños cambios en la rigidez cerebral, filo de cuchilla y temperatura puede conducir a secciones botched, deformadas o rotas. Secciones pueden también manchar irregularmente y mal ser reflejadas debido a las burbujas en el medio de montaje. Lo importante, al seccionamiento, el contexto tridimensional de la localización de la lesión en el cerebro se pierde, que precisa reconstrucción 3D de la lesión en el cerebro un reto.

Otra aplicación común para las lesiones ha sido determinar la ubicación de simple y múltiples grabaciones de electrodo en el cerebro. Al final de la sesión de grabación final, los investigadores inducen pequeñas lesiones electrolíticas en la punta del electrodo y procesan el cerebro histológico como hecho en un experimento convencional lesión del11. Esta técnica adolece de los mismo inconvenientes descritos anteriormente, con problemas adicionales ya que las lesiones electrolíticas son generalmente más grandes que los electrodos utilizados para hacerlos pero son generalmente bastante pequeñas que son difíciles de encontrar histológico. Cuando se insertan electrodos múltiples, como en el caso de una matriz de tetrodo, la verificación a través de lesiones electrolíticas es incluso más difícil. Una alternativa a las lesiones electrolíticas es el uso de un colorante en el electrodo para más tarde comprobar histológicamente12, pero esta técnica adolece de los mismos inconvenientes que vienen con la histología convencional.

Aquí, describimos a fondo un método recientemente descrito13 basado en técnicas de microscopía electrónica (EM) y rayos x de tinción la tomografía computada (micro-CT que cuantifica las lesiones y localiza más corriente de electrodos en cerebros de animales pequeños) métodos. Micro-CT es una técnica de imagen en la que se disparan rayos x en una muestra que gira 360° mientras un scintillator recoge los rayos x no se desvió por la muestra. El resultado es una reconstrucción 3D digital alta resolución de la muestra que puede ser visualizada en cualquier orientación y cuantificar precisamente. Muchas instituciones académicas tienen micro-CT escáneres, que están disponibles comercialmente.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todo el cuidado y manipulación experimental de animales fueron revisadas y aprobadas por la Comisión de uso y cuidado Animal institucional de Harvard. La perfusión que se describe aquí es específica para las ratas, pero el procedimiento es aplicable a los animales con cerebros más pequeños o similar tamaños.

1. perfusión

  1. Preparar 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Para una rata (edad: 0,5 – 1,5 años de edad, peso: 250 – 600 g), 800-1.000 mL debe ser suficiente. Usar 400 mL para perfusión el animal y un adicional 400 mL para diluir el fijador.
  2. Preparar el fijador consistente en 2% (w/v) paraformaldehido (PFA) y 2,5% (p/v) de glutaraldehído (GA) en PBS 1 x. Para una rata, 400 mL es suficiente. Ahorre 50 mL en un tubo cónico de 50 mL para la posterior fijación del cerebro después de la perfusión.
  3. Anestesiar la rata con 4 – 5% isoflurano gas (0,8 L/min O2 a 1,0 bar a 21 ° C) durante 15 minutos.
  4. Inyectar una dosis letal de pentobarbital sódico por vía intraperitoneal (180 mg/kg).
  5. Prueba para la pérdida de refleja en el animal mediante la realización de un examen reflejo del pellizco del dedo del pie. Esperar para comenzar la perfusión hasta que el animal ha perdido su respuesta refleja.
  6. Siga la descrita intracardial perfusión y cerebro extracción protocolo14 con las siguientes soluciones: inundar el animal con 400 mL de PBS 1 x a 125 mm Hg para quitar la sangre. Una vez que toda la sangre ha sido eliminada y reemplazado con 1 x PBS, comenzar inunda con 400 mL de una solución de 2% PDA y GA 2.5% disuelto en 1 x PBS a 125 mm Hg.
    Nota: Si el procedimiento se lleva a cabo en un animal que no es una rata, los componentes sólo importantes el procedimiento de perfusión son el uso de 1 x PBS y 2% PFA, GA de 2.5% en PBS 1 x. Los volúmenes de solución y la presión de perfusión pueden ajustarse según las especies.

2. posteriores a la fijación

  1. Colocar el cerebro extraído en 2% PFA, GA de 2.5% de 1 x PBS (solución mismo solía inundar el animal previamente). Asegúrese de que el volumen de la solución es al menos 10 veces el volumen del cerebro. Para las ratas, colocar el cerebro en un tubo cónico de 50 mL con 50 mL de solución. Almacenar la muestra en la fijación de 2 – 3 días, agitando ligeramente a 4 ° C.
    Nota: Si la muestra está en un tubo cónico de 50 mL, colocar horizontalmente en un agitador orbital asegurará los mejores resultados.
  2. Después de la muestra ha sido post fijó por mucho tiempo suficiente, lavar la muestra en agua ultrapura, agua doble destilada (ddH2O) y agua desionizada (diH2O) (véase Tabla de materiales) cuatro veces durante los siguientes períodos: 1, 1, 1 y 15 minutos.
    Nota: Para este protocolo, ddH2O diH2O y agua ultrapura debe ser intercambiable. Por simplicidad, ddH2O se utilizará para referirse a agua purificada en adelante.

3. tinción

PRECAUCIÓN: Para este paso, realizar todas las preparaciones solución bajo una campana durante el uso de guantes.

  1. Preparar al menos 10 veces el volumen del cerebro de la coloración de la solución. De cerebro de rata, preparar 50 mL 2% (w/v) de tetróxido de osmio (OsO4) en Dec2O mediante la combinación de 25 mL de solución 4% OsO4 y 25 mL de ddH2O.
    PRECAUCIÓN: tetróxido de osmio es volátil y puede provocar ceguera temporal y problemas respiratorios si no se maneja adecuadamente. Deseche todos los materiales que en contacto con el tetraóxido de osmio en un contenedor apropiado de peligro químico dentro de un contenedor secundario.
  2. Colocar el cerebro en un nuevo tubo cónico de 50 mL y añadir la solución de4 OsO. El cerebro debe empezar a dar vuelta a marrón como OsO4 reacciona con los lípidos en el tejido.
  3. Cierre el tubo y sellar bien con parafina (véase Tabla de materiales) de la película para asegurarse de que no gotea durante la incubación.
    Nota: El osmio es inestable y reacciona suavemente con el plástico del tubo, así sellando el tubo correctamente es muy importante. El tubo se puede envolver con papel de aluminio para mayor protección.
  4. Guarde el tubo sellado a 4 ° C, agitándolo ligeramente en un agitador orbital a 50 rpm durante 2 semanas. Coloque el tubo horizontalmente para garantizar la mejor mezcla. Asegúrese de que la muestra esté completamente sumergida en la solución agitando.
    Nota: Si el osmio no se permite que circule constantemente, que puede no completamente penetrar la muestra, para que la colocación horizontal de la coctelera es muy importante.

4. incrustación

  1. Después de que la muestra ha sido incubada en OsO4 durante 2 semanas, lávelo con ddH2O 5 veces a temperatura ambiente (RT) para las siguientes duraciones: 1, 1, 1, 15 y 60 min para eliminar el de OsO,4 en la muestra.
    Nota: Los intercambios múltiples, incluyendo el último intercambio de 60 min, son necesarios para permitir que el osmio en el sistema circulatorio difundir hacia fuera.
  2. Lavar la muestra con ddH2O 30 min a 4 ° C.
    Nota: Osmio puede continuar difundir fuera de la muestra, pero su cantidad debe ser mucho reducido del paso anterior.
  3. Deshidratar la muestra con etanol para infiltrarse en tiempo con la resina. Para deshidratar, reemplazar el ddH2O con 10 – 20 mL de las siguientes diluciones de etanol (para 30 min de cada uno a 4 ° C): 20% (v/v) de etanol y 80% (v/v) ddH2O; 50% (v/v) de etanol y 50% (v/v) ddH2O; etanol al 70% (v/v) y 30% (v/v) ddH2O; 90% (v/v) de etanol y 10% (v/v) ddH2O; etanol al 100%.
  4. Preparar las diluciones de resina acetona como se indica a continuación.
    1. Preparar 100 mL de resina para inclusión (véase Tabla de materiales) según las instrucciones del fabricante.
    2. Para hacer la resina 33% (v/v) - 67% solución de acetona, vierte 15 mL de resina en un tubo cónico de 50 mL y añadir 30 mL de acetona destilada vidrio 100%.
    3. El 50% (v/v) de la resina - 50% acetona, vierta 22,5 mL de resina en un tubo cónico de 50 mL y añadir 22,5 mL de acetona destilada vidrio 100%.
    4. El 67% (v/v) de la resina - 33% solución de acetona, Vierta 30 mL de resina en un tubo cónico de 50 mL y añadir 15 mL de acetona destilada vidrio 100%.
    5. Utilice los restantes 32,5 mL de resina como la primera solución de resina 100% abajo.
  5. Comenzar el proceso de infiltración de resina moviendo la muestra a través de 10-20 mL de las diluciones siguientes de acetona y la acetona/resina: acetona al 100% durante 30 min a 4 ° C; 100% acetona durante 30 min a 4 ° C; y 100% acetona durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
    Nota: El resto del proceso de infiltración llevará a cabo a TA.
  6. Sumergir la muestra en 33% (v/v) resina 67% acetona durante 3 horas a temperatura ambiente, luego acetona de resina - 50% 50% (v/v) durante 3 horas a temperatura ambiente, 67% (v/v) resina 33% acetona durante 3 horas a temperatura ambiente y 100% de resina de 12 h a TA.
  7. Hacer una hornada fresca 50 mL de resina siguiendo las instrucciones en la botella. Transferir la muestra al recipiente en que se curará (por ej., los moldes desechables se describe en la Tabla de materiales). Infusionar la muestra con resina 100% fresca durante 4 horas a TA.
    Nota: Si no se utiliza la resina fresca, hecha el día anterior que empezará a endurecerse prematuramente, y la muestra será difícil de manipular.
  8. Desgasificar la muestra en una estufa de vacío por 15 min a 45 ° C.
    Nota: Este paso le ayudará a eliminar las posibles burbujas de aire atrapado dentro de la muestra, pero es no esencial y no afectará la calidad de los datos.
  9. Por último, curar la muestra en un horno durante 48 h a 60 ° C.

5. micro-CT

  1. Una vez la muestra ha sido curada, desprenda el molde desechable y escanear con la máquina micro-CT.
    Nota: Dependiendo de la máquina utilizada, la configuración será diferente. Para el escáner utilizado por los autores mencionados en la Tabla de materiales, la configuración recomendada es 130 kV, MA 135 con un filtro de cobre de 0,1 mm y una fuente de molibdeno, una exposición de 1 segundo y un promedio de 4 fotogramas por proyección. Sin embargo, experimentadores deben calibrar el analizador individualmente, como muchos factores afectarán la configuración óptima durante una sesión en particular.
  2. Una vez terminado el escaneo, reconstruir la muestra con los parámetros recomendados para la combinación de software de escáner del experimentador en un ordenador con el software del escáner.
  3. Por último, visualizar y analizar el volumen digital reconstruido usando software del experimentador de la opción (véase Tabla de materiales por ejemplo).

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Results

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Tradicionalmente, cerebros son seccionados y manchados con el fin de cuantificar las lesiones y ubicar los electrodos, pero este método es propenso, mano de obra intensiva y por lo general requiere la estimación de los resultados. Preparando el cerebro entero para micro-CT en la proyección de imagen, se reduce la probabilidad de dañar las muestras características de interés se pueden analizar en el contexto de todo el cerebro y el método se presta a procesamiento en paralelo de muchas mue...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los siguientes son pasos críticos en el protocolo: en primer lugar, el uso de una combinación de PFA y GA a inundar el animal y posteriormente fijar después el cerebro fue fundamental para lograr la penetración constante de osmio completo del tejido. Aunque nos no probar esto explícitamente, una explicación plausible es que la fijación del PFA es reversible15, mientras que GA fijación no es reversible16,17. Porque una incubación de dos sem...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen Greg Lin y Arthur McClelland su experiencia con la máquina micro-CT, David Richmond y Hunter Elliott en la imagen y base de análisis de datos (IDAC) en Harvard Medical School para su Consejo de procesamiento de imágenes y William Liberti en Boston Universidad para proporcionar amablemente un cerebro del pinzón de la cebra. Este trabajo fue realizado en parte en el centro de sistemas de nanoescala (CNS), un miembro de la nacional nanotecnología coordinada infraestructura red (NNCI), que es apoyado por la National Science Foundation bajo premio NSF no. 1541959. CNS es una parte de la Universidad de Harvard. Este trabajo fue apoyado por el Richard y Susan Smith Family Foundation y IARPA (contrato #D16PC00002). S.B.E.W. fue apoyado por becas del programa de ciencia frontera humana (HFSP; LT000514/2014) y la Organización Europea de Biología Molecular (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. fue apoyado por la National Science Foundation (NSF) postgrado investigación beca programa (GRFP).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Paraformaldehído (PFA)Ciencias de la Microscopía Electrónica (EMS)157102% (c/v/) en 1X PBS
Glutaraldehído (GA)EMS162202,5% (c/v) GA en 1x PBS
OsO4EMS19190Trabajo en campana extractora
EtanolDecon LabsKoptec140, 190, 200
prueba AcetonaEMS10015Resina
Durcupan ACMSigma-Aldrich44610Componentes A, B, C y D, resina para incrustar
Moldes desechablesTed Pella27114sugerida
(agua ultrapura)Millipore SigmaQGARD00R1 (o purificador relacionado)Parafilm
sugerido (película de parafina)Millipore SigmaP7793Película de parafina sugerida
Escáner de micro-CTNikon Metrology Ltd., Tring, Reino UnidoX-Tek HMS ST 225Utilizado por los autores
Software para visualizar y analizar escaneos de micro-CT:
Volume GraphicsVG Studio MaxUtilizado por los autores
FEI / Thermo ScientificAvizoUtilizado por los autores
FEI / Thermo ScientificAmiraSimilar a Avizo
Mark Sutton & Russell GarwoodSpiersGratis, http://spiers-software.org/
Pixmeo SarlOsirix LiteGratis, https://www.osirix-viewer.com/
Código abiertoFIJIGratis, https://fiji.sc/
AdobePhotoshopBueno para analizar un corte a la vez
destilada en vidrio Agua milliQ

References

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