Este manuscrito describe la síntesis de un nanotubo de carbono de pared simple (SWCNT)-conjugado MALAT1 gapmer antisentido DNA oligonucleotide (SWCNT-anti-MALAT1), que demuestra la entrega confiable de la SWCNT y el potente efecto terapéutico de anti-MALAT1 in vitro e in vivo. Métodos utilizados para la síntesis, modificación, verbal, y la inyección de SWCNT-anti-MALAT1 se describen.
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Artículo de método
Represión del crecimiento de la célula del mieloma múltiple en Vivo de nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT)-entregado Oligos antisentido MALAT1
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Resumen
Resumen
Los nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT) es un nuevo tipo de nanopartícula, que se ha utilizado para ofrecer a varios tipos de drogas en las células, como las proteínas, oligonucleótidos y drogas sintéticas de molécula pequeña. El SWCNT tiene dimensiones personalizables, una gran área superficial y flexible puede enlazar con las drogas a través de diferentes modificaciones en su superficie; por lo tanto, es un sistema ideal para el transporte de drogas en las células. Larga noncoding RNAs (lncRNAs) son un grupo de RNA codifica más de 200 nt, que no puede ser traducido a proteína, pero juega un papel importante en procesos biológicos y fisiopatológicos. Adenocarcinoma pulmón metástasis asociadas 1 (MALAT1) es un lncRNA altamente conservado. Se demostró que niveles más altos de MALAT1 están relacionados con el pronóstico de varios tipos de cáncer, como mieloma múltiple (MM). Hemos revelado que MALAT1 regula ADN reparación y muerte celular en MM; así, MALAT1 puede considerarse como una diana terapéutica para m. Sin embargo, la entrega eficiente de oligo antisentido para inhibir/caída MALAT1 en vivo sigue siendo un problema. En este estudio, nos modificar SWCNT con PEG-2000 conjugar un oligo de anti-MALAT1 a él, prueba de la entrega de este compuesto en vitro, inyectar por vía intravenosa en un modelo de ratón MM diseminado y observar una inhibición significativa de la progresión de MM, que indica SWCNT es una entrega ideal para anti-MALAT1 gapmer ADN.
Introducción
El SWCNT es un nuevo nanomaterial que puede ofrecer a varios tipos de drogas, como las proteínas, moléculas pequeñas y los ácidos nucleicos, estable y eficiente con tolerabilidad ideal y mínima toxicidad en la1 de la vitro y en vivo2. Un SWCNT funcionalizado tiene gran solubilidad en agua y biocompatibilidad, puede utilizarse como un servicio de transporte para moléculas más pequeñas y llevarlas para penetrar la membrana de la célula3,4,5.
lncRNAs son un grupo de RNA (> 200 nt) que se transcriben a mR....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales fueron aprobados previamente por la Cleveland Clinic IACUC (Comité de uso y cuidado de Animal institucional).
1. síntesis de NTCSPs funcionalizados
- Mezclar 5 mL de agua libre de nucleasa estéril en un vial de centelleo de vidrio (20 mL), 1 mg de NTCSPs y 5 mg de DSPE-PEG2000-amina. Sacúdalo bien para disolver todos los reactivos totalmente.
- Someter a ultrasonidos el frasco en un sonicador de baño de agua a un nivel de potencia de 40 W durante 1 hora a temperatura ambiente (RT, 20 min x 3, cambiar el agua cada 20 minutos para evitar el sobrecalentamiento). Luego, centrifugar a 24.000 x ....
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Resultados
Para demostrar el efecto de inhibición de la gapmer anti-MALAT1 ADN en MM, había derribado de la expresión de MALAT1 y había usada en células H929 y MM.1S. Cuarenta y ocho horas más tarde, las células fueron recogidas para el análisis de la eficiencia de la precipitación y el estado de apoptosis en las células transfected con control DNA o anti-MALAT1 gapmer. resultados de qRT-PCR demostrados que anti-MALAT1 gapmer ADN derribado la expresión MALAT1 en H929 y MM.1S las células eficientemen.......
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Discusión
La evidencia ha mostrado que lncRNAs participar en la regulación de numerosos procedimientos fisiológicos y patofisiológicos de cánceres, incluyendo el m7,8,9; tienen el potencial de ser objeto de tratamiento del cáncer, que puede ser realizado por oligonucleótidos antisentido20,21,22. La U.S. Food y Drug Administration (FDA) ha aprobad.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen el Instituto de Investigación Lerner proteómicos, genómicos y núcleos de proyección de imagen para su ayuda y apoyo. Financiación: Este trabajo fue apoyado financieramente por la subvención del NIH/NCI R00 CA172292 (a J.J.Z.) y fondos de puesta en marcha (a J.J.Z.) y la clínica y traslacional ciencia colaborativa (CTSC) de caso Western Reserve University base utilización piloto (a J.J.Z.). Este trabajo utilizó el microscopio confocal Leica SP8 que fue comprado con fondos de los institutos nacionales de salud SIG grant 1S10OD019972-01.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| sonicador de baño | VWR | 97043-992 | |
| Filtro centrífugo de 4 mL | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO Espectrofotómetro | de microplacascoeficiente de extinción de 0,0465 L/mg/cm a 808 nm | |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| solución DTT | Millipore-Sigma | 43815 | |
| columna NAP-5 GE | Healthcare | 17-0853-01 | |
| sistema de imagen in vivo | PerkinElmer | ||
| NOD. CB17-Prkdcscid/J ratones | Charles River lab | 250 | |
| Citómetro de flujo | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Suero fetal bovino (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medio | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | sintetizado por IDT Empresa | 5'- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3' | |
| MALAT1-QR: | sintetizado por la empresa | 5'- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3' | |
| GAPDH-QF: | sintetizado por la empresa | 5'- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3' | |
| GAPDH-QR: | sintetizado por la empresa | 5'- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3' | |
| PCR cuantitativa con la mezcla maestra SYBR Green PCR | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid kit de síntesis de ADNc de primera posición | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | sintetizado por IDT Company | 5'-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*mC*mA*mG*mC*mA-3' | |
| kit de ensayo de viabilidad celular | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloKit de ensayo de viabilidad celular luminiscente |
| accuSkan GO Espectrofotómetro de microplaca UV/Vis | Thermo Fisher | ||
| filtro centrífugo | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS software | IBM | versión 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
Referencias
- Jiang, X., et al. RNase non-sensitive and endocytosis independent siRNA delivery system: delivery of siRNA into tumor cells and high efficiency induction of apoptosis. Nanoscale. 5 (16), 7256-7264 (2013).
- Murakami, T., et al.
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Reimpresiones y permisos
