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Artículo de método

Represión del crecimiento de la célula del mieloma múltiple en Vivo de nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT)-entregado Oligos antisentido MALAT1

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DOI:

10.3791/58598

⸱

13 de diciembre de 2018

 ,  , 
1Department of Cancer Biology, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Medical Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este manuscrito describe la síntesis de un nanotubo de carbono de pared simple (SWCNT)-conjugado MALAT1 gapmer antisentido DNA oligonucleotide (SWCNT-anti-MALAT1), que demuestra la entrega confiable de la SWCNT y el potente efecto terapéutico de anti-MALAT1 in vitro e in vivo. Métodos utilizados para la síntesis, modificación, verbal, y la inyección de SWCNT-anti-MALAT1 se describen.

Resumen

Los nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT) es un nuevo tipo de nanopartícula, que se ha utilizado para ofrecer a varios tipos de drogas en las células, como las proteínas, oligonucleótidos y drogas sintéticas de molécula pequeña. El SWCNT tiene dimensiones personalizables, una gran área superficial y flexible puede enlazar con las drogas a través de diferentes modificaciones en su superficie; por lo tanto, es un sistema ideal para el transporte de drogas en las células. Larga noncoding RNAs (lncRNAs) son un grupo de RNA codifica más de 200 nt, que no puede ser traducido a proteína, pero juega un papel importante en procesos biológicos y fisiopatológicos. Adenocarcinoma pulmón metástasis asociadas 1 (MALAT1) es un lncRNA altamente conservado. Se demostró que niveles más altos de MALAT1 están relacionados con el pronóstico de varios tipos de cáncer, como mieloma múltiple (MM). Hemos revelado que MALAT1 regula ADN reparación y muerte celular en MM; así, MALAT1 puede considerarse como una diana terapéutica para m. Sin embargo, la entrega eficiente de oligo antisentido para inhibir/caída MALAT1 en vivo sigue siendo un problema. En este estudio, nos modificar SWCNT con PEG-2000 conjugar un oligo de anti-MALAT1 a él, prueba de la entrega de este compuesto en vitro, inyectar por vía intravenosa en un modelo de ratón MM diseminado y observar una inhibición significativa de la progresión de MM, que indica SWCNT es una entrega ideal para anti-MALAT1 gapmer ADN.

Introducción

El SWCNT es un nuevo nanomaterial que puede ofrecer a varios tipos de drogas, como las proteínas, moléculas pequeñas y los ácidos nucleicos, estable y eficiente con tolerabilidad ideal y mínima toxicidad en la1 de la vitro y en vivo2. Un SWCNT funcionalizado tiene gran solubilidad en agua y biocompatibilidad, puede utilizarse como un servicio de transporte para moléculas más pequeñas y llevarlas para penetrar la membrana de la célula3,4,5.

lncRNAs son un grupo de RNA (> 200 nt) que se transcriben a mRNA de genoma, pero no puede ser traducido a proteínas. Cada vez más pruebas ha demostrado que lncRNAs participar en la regulación de la expresión de genes6 y participan en la iniciación y progresión de la mayoría de los tipos de cáncer, incluyendo MM7,8,9. MALAT1 es una transcripción codifica nuclear enriquecido 2 (NEAT2) y un altamente conservado lncRNA10. MALAT1 es reconocido inicialmente en metastásico de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) el cáncer11, pero ha sido sobre expresa en numerosos tumores5,12,13; es uno de los lncRNAs más altamente expresada y se correlaciona con un pronóstico pobre en MM8,14. El nivel de expresión de MALAT1 es significativamente mayor en pacientes con MM extramedular curso fatal en comparación con aquellos diagnosticados sólo como MM15.

En un estudio previo, hemos confirmado que oligos de anti-MALAT1 robusta conducen a daños en el ADN y la apoptosis en MM16 mediante el uso de oligonucleótidos de antisentido del ADN de gapmer a MALAT1 (anti-MALAT1) en células de MM. La DNA gapmer es compuesta de ADN antisentido y unida por 2'-OMe-RNAs, que podrían sugerirán el escote de la MALAT1 por la Rnasa H actividad una vez atado17. La eficiencia de la entrega en vivo de oligos antisentido todavía limita su uso clínico.

Para probar la entrega efecto de SWCNT para oligos de gapmer anti-MALAT1, el gapmer anti-MALAT1 ADN se conjuga a DSPE-PEG2000-amina funcionalizados SWCNT. SWCNT-anti-MALAT1 luego se inyecta por vía intravenosa en un modelo de ratón diseminada MM; se observa una inhibición notable después de cuatro tratamientos.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados previamente por la Cleveland Clinic IACUC (Comité de uso y cuidado de Animal institucional).

1. síntesis de NTCSPs funcionalizados

  1. Mezclar 5 mL de agua libre de nucleasa estéril en un vial de centelleo de vidrio (20 mL), 1 mg de NTCSPs y 5 mg de DSPE-PEG2000-amina. Sacúdalo bien para disolver todos los reactivos totalmente.
  2. Someter a ultrasonidos el frasco en un sonicador de baño de agua a un nivel de potencia de 40 W durante 1 hora a temperatura ambiente (RT, 20 min x 3, cambiar el agua cada 20 minutos para evitar el sobrecalentamiento). Luego, centrifugar a 24.000 x g durante 6 h y recoger la solución sobrenadante. Esta solución SWCNT funcional puede almacenarse a 4 ° C durante 2 meses.
  3. Añadir 1 mL de solución SWCNT de paso 1.2 a un dispositivo de filtro centrífugo de MWCO de 100 kDa, seguido de 4 mL de agua estéril libre de nucleasas. Centrifugar 10 min a 4.000 x g a temperatura ambiente para quitar extra DSPE-PEG2000-amina. Repetir la adición de 4 mL de agua y la centrifugación 5 x. Más de 0,5 mL de disolución SWCNT sobrante se quedarán en el filtro después de cada centrifugación.
  4. Medir la concentración de la solución SWCNT sobrante en el filtro utilizando un espectrómetro de UV/VIS en 808 nm después del último lavado. La concentración final es típicamente cerca de 50 mg/L (calculados según el método desarrollado por Kam et al.18).
    Nota: Asegúrese de que NTCSPs funcionalizados DSPE-PEG son solubles en agua tras el paso 1.4 y son estables en diferentes soluciones biológicas sin agregación visible después de algunas semanas.

2. Conjugación de Anti-MALAT1 Gapmer ADN flanqueado por 2'-O ARN modificado a SWCNT funcionalizado

  1. Añadir 0,5 mg de Sulfo-LC-SPDP en 450 μl de DSPE-PEG2000-amine functionalized SWCNT. Añadir 50 μl de PBS de x 10 y luego incubar por 2 h a TA.
  2. Para quitar extra Sulfo-LC-SPDP, añadir la reacción del paso 2.1 a un dispositivo de filtro centrífugo de MWCO de 100 kDa, seguida de 4 mL de agua libre de nucleasa. Centrifugar durante 10 min a 4.000 x g en RT. repetir la adición de 4 mL de agua y la centrifugación 5 x.
  3. Añadir 200 nM modificación de tiol anti-MALAT1-Cy3 gapmer ADN en 1,5 mL de solución comercial de TDT e incubar durante 90 min en RT. purificar el producto con una siesta-5 columna, siguiendo el protocolo del fabricante. Eluir el anti-MALAT1-Cy3 con 500 μl de esterilizado libre de nucleasa 1 x PBS.
    Nota: SWCNT funcionalizado puede almacenarse con TDT adicional, que podría unirse disulfuro formado durante el almacenamiento de la gapmer anti-MALAT1 de thiolated DNA. La TDT añadida puede eliminarse por aNAP-5 columna antes de la conjugación con SWCNT.
  4. Recoger la solución DSPE-PEG2000-amina SWCNT sulfo-LC-SPDP-tratados en el filtro y diluirlo en 500 μl de solución de anti-MALAT1-Cy3. Entonces, lo incube a 4 ° C por 24 h. El conjugado SWCNT-anti-MALAT1 puede almacenarse a 4 ° C durante 3 semanas. Siguiendo el mismo procedimiento, el SWCNT conjugado con oligo antisentido scramble puede ser sintetizado y utilizado como control de SWCNT.

3. cola inyección en la vena de SWCNT-Anti-MALAT1

  1. Generar un modelo de ratón diseminada MM.
    1. Para lograr los mejores resultados de la comparación, al azar organizar 14 NOD. CB17-Prkdcscid/J ratones (8 semanas) en grupos de control o ensayo (siete en cada grupo) con la misma proporción de hombres y mujeres.
    2. Limpiar el Banco de funcionamiento y esterilizar con alcohol al 70%.
    3. Use una lámpara de calefacción para calentar el ratón para ayudar a la cola de la vena para aparecer. Refrenar el ratón correctamente con un limitador de la inyección de cola.
    4. Inyectar las células 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry en 50 μl de PBS a través de la vena de la cola sin anestesia. Presione el sitio de la inyección con un algodón embebido en alcohol de 30 marca s. el ratón inyectado y volver a una jaula limpia.
  2. Iniciar el tratamiento el día 7 después de la inyección de células MM.1S.
    1. Inyectar 50 μl de PBS con SWCNT-anti-MALAT1 en la vena de la cola del ratón. Uso PBS con un control de SWCNT como control.
    2. Presione el sitio de la inyección con un algodón embebido en alcohol durante 30 s.
    3. Observar el sangrado local en la cola y el comportamiento general del ratón durante 1 min y volver a una jaula limpia. Observar los ratones todo inyectados otra vez antes de regresar a la jaula a la parrilla, para asegurarse de que las inyecciones son bien toleradas.
  3. Repetir la inyección cada 7 días hasta la finalización del experimento.
    1. Terminar el experimento cuando se degrada la salud general del ratón: Cuándo no comer o beber, la aparición de patas pálidas, sangrado subcutáneo, una dificultad para respirar, disminución de la actividad, una parálisis de las extremidades inferiores o una masa tangible en el se observa el abdomen.

4. evaluación de la progresión de la enfermedad

  1. Evaluar el estado general de los ratones cada día después de la inyección de células MM.1S-Luc-mCherry. Preste especial atención si los ratones desarrollan paraliza de extremidades inferiores.
  2. Evaluar el crecimiento del tumor usando un sistema en vivo de imagen 1 x semana, antes de la inyección de SWCNT-anti-MALAT1.
    1. Preparar el fresco 15 mg/mL D-Luciferin con PBS 1 x.
    2. Anestesiar los ratones con un vaporizador de isoflurano (3 – 5% para la inducción y 1 – 3% para el mantenimiento, dependiendo del estado de los ratones).
    3. Inyectar a 150 mg/kg D Luciferin en cada ratón por vía intraperitoneal, a 5 minutos antes de la proyección de imagen; entonces, imagen de los ratones en una posición propensa con un espectro de sistema de imagen.
    4. Recoger imágenes secuenciales de los ratones cada 2 minutos, hasta que se alcanza la saturación de la luminescencia. Ajustar el intervalo de tiempo según la absorción de D-Luciferin/señal.
  3. Utilizar CO2 para sacrificar a los ratones una vez que se llega a la terminación del experimento.
  4. Ya que este es un modelo diseminado MM, proceso de los ratones como sigue.
    1. Pesar el ratón antes de la disección.
    2. Recolección de sangre periférica desde el corazón para un ensayo de conteo sanguíneo completo (CSC) realizado por una máquina contadora de células de la sangre. Las cuentas de glóbulos blancos y glóbulos rojos, así como la proporción de linfocitos, que es los índices principales.
    3. Aislar el bazo y pésalo. Calcular el cociente del peso corporal del bazo; examinar > 0.5% como agrandamiento del bazo.
    4. Recoge los tejidos de la médula ósea, bazo, ganglios linfáticos, riñón y el tejido con metástasis visible.
    5. Recoger la columna si el ratón desarrolló una parálisis de las extremidades inferiores.
    6. Extracto de RNA y proteína de las muestras de médula ósea.
    7. Fijar todos los restantes tejidos en formalina.
    8. Para descalcificación, sumergir las muestras de hueso en solución de 0,25 M de EDTA (pH 8.0) durante 5 días después de 24 horas de fijación.
    9. Sumergir las muestras en alcohol al 75% para el almacenamiento a largo plazo.
  5. Comparar la intensidad de la señal de luciferasa en los mismos puntos de tiempo en dos grupos. De ambos grupos, registrar las fechas de sacrificio de cada ratón y calcular las curvas de supervivencia de los dos grupos con el software.
    Nota: Todos los procedimientos se resumen en la figura 1.

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Resultados

Para demostrar el efecto de inhibición de la gapmer anti-MALAT1 ADN en MM, había derribado de la expresión de MALAT1 y había usada en células H929 y MM.1S. Cuarenta y ocho horas más tarde, las células fueron recogidas para el análisis de la eficiencia de la precipitación y el estado de apoptosis en las células transfected con control DNA o anti-MALAT1 gapmer. resultados de qRT-PCR demostrados que anti-MALAT1 gapmer ADN derribado la expresión MALAT1 en H929 y MM.1S las células eficientemen...

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Discusión

La evidencia ha mostrado que lncRNAs participar en la regulación de numerosos procedimientos fisiológicos y patofisiológicos de cánceres, incluyendo el m7,8,9; tienen el potencial de ser objeto de tratamiento del cáncer, que puede ser realizado por oligonucleótidos antisentido20,21,22. La U.S. Food y Drug Administration (FDA) ha aprobad...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen el Instituto de Investigación Lerner proteómicos, genómicos y núcleos de proyección de imagen para su ayuda y apoyo. Financiación: Este trabajo fue apoyado financieramente por la subvención del NIH/NCI R00 CA172292 (a J.J.Z.) y fondos de puesta en marcha (a J.J.Z.) y la clínica y traslacional ciencia colaborativa (CTSC) de caso Western Reserve University base utilización piloto (a J.J.Z.). Este trabajo utilizó el microscopio confocal Leica SP8 que fue comprado con fondos de los institutos nacionales de salud SIG grant 1S10OD019972-01.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
SWCNTsMillipore-Sigma704113
DSPE-PEG2000-AmineAvanti Polar Lipids880128
sonicador de bañoVWR97043-992
Filtro centrífugo de 4 mLMillipore-SigmaZ740208-8EA
Thermo Fisher ScientificaccuSkan GO Espectrofotómetrode microplacascoeficiente de extinción de 0,0465 L/mg/cm a 808 nm
Sulfo-LC-SPDPProteoChemc1118
solución DTTMillipore-Sigma43815
columna NAP-5 GEHealthcare17-0853-01
sistema de imagen in vivoPerkinElmer
NOD. CB17-Prkdcscid/J ratonesCharles River lab250
Citómetro de flujoBecton Dickinso
LipofectamineInvitrogen11668019Lipofectamine2000
Suero fetal bovino (FBS)Invitrogen10437-028
RMPI-1640 medioInvitrogen11875-093
MALAT1-QF:sintetizado por IDT Empresa5'- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3'
MALAT1-QR:sintetizado por la empresa5'- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3'
GAPDH-QF:sintetizado por la empresa5'- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3'
GAPDH-QR:sintetizado por la empresa5'- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3'
PCR cuantitativa con la mezcla maestra SYBR Green PCRThermo Fisher ScientificA25780
RevertAid kit de síntesis de ADNc de primera posiciónThermo Fisher ScientificK1621
anti-MALAT1sintetizado por IDT Company5'-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T
*G*G*C*A*C*mC*mA*mG*mC*mA-3'
kit de ensayo de viabilidad celularPromega CorporationG7570CellTiter-GloKit de ensayo de viabilidad celular luminiscente
accuSkan GO Espectrofotómetro de microplaca UV/VisThermo Fisher
filtro centrífugoMillipore-SigmaUFC910008
SPSS softwareIBMversión 24.0
D-LuciferinMillipore-SigmaL9504
Espectrómetro UV/VIS IDT IDT IDT Scientific

Referencias

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