Desarrollo y aplicación angiográfica del conejo VX2 modelo de cáncer de hígado

Resumen

El objetivo de este artículo es proporcionar una cartilla para el desarrollo y uso del modelo de conejo de carcinoma VX2 para cáncer de hígado.

Resumen

El tumor VX2 de conejo es un animal modelo comúnmente utilizado para la investigación traslacional sobre carcinoma hepatocelular (HCC) en el campo de la radiología intervencionista. Este modelo emplea un anaplástico de células escamosas que se propaga fácilmente y confiablemente en el músculo esquelético de conejo de donantes para la eventual implantación cosecha y del allograft en el hígado de los receptores ingenuos. Este injerto tumor crece rápidamente dentro del hígado de conejos receptores en un tumor angiographically identificable, caracterizado por un núcleo necrótico rodeado por una cápsula de hypervascular viable. El tamaño físico de la anatomía del conejo es suficiente para facilitar la instrumentación vascular que permite la aplicación y prueba de diversas técnicas de intervención. A pesar de estos beneficios, existe una escasez de recursos técnicos para actuar como una referencia concreta para los investigadores que trabajan con el modelo. Adjunto, presentamos un esquema visual completa de los aspectos técnicos del desarrollo, crecimiento, propagación y utilización angiográfica del modelo de tumor VX2 conejo para uso de principiantes y experimentados investigadores por igual.

Introducción

El modelo de tumor VX2 conejo ha desempeñado un papel en oncología experimental desde su desarrollo en 1935^1,2. Este tumor es un inducido por virus anaplásico células escamosas caracterizado por hypervascularity, rápido crecimiento y fácil propagación en el músculo esquelético^3,4. Mientras que el modelo de tumor conejo VX2 se ha utilizado para investigar una multitud de cánceres^5,6,7,8; el enfoque de este trabajo es el cáncer de hígado⁹.

El propósito del método descrito es presentar un modelo para el cáncer primario del hígado o carcinoma hepatocelular (HCC), que puede ser utilizado por los radiólogos intervencionistas para la investigación traslacional. Puede ser utilizado para estudios farmacocinéticos, las investigaciones terapéuticas y método ablativo pruebas^{10,11,12,13,14,15}.

El método detallado en el presente documento proporciona varias ventajas sobre otros modelos en el mismo ámbito como modelos de roedores como ratas, ratones y las marmotas o modelos más grandes como primates¹⁶. Uno de los principales beneficios es el crecimiento del tumor rápido y fiable que permite a los investigadores a establecer una línea de tumor activo dentro de un mes del primer extremidades propagación¹⁷. Además, este tumor tiene visibilidad directa de sonográfica y una periferia de hypervascular que permite tratamientos locorregionales de transarterial y terapias ablativas. Finalmente y lo más importante, el tamaño de la vasculatura del conejo permite técnicamente fácil y factible utilización de instrumentación vascular¹⁸.

Protocolo

El siguiente protocolo sigue los requisitos y directrices establecidas por la Universidad de Illinois - Chicago. Fue revisado y aprobado por el local Comité de uso y cuidado institucional del Animal antes de la ejecución.

1. VX2 desarrollo del Tumor extremidades

1. Adquirir la línea de células de tumor VX2 el nacional cáncer Institute División de cáncer tratamiento diagnóstico y tratamiento de Tumor de la célula línea de repositorio.
   Nota: En este momento, el catálogo de orden puede encontrarse en el siguiente enlace: https://dtp.cancer.gov/repositories/.
2. Para preparar la suspensión de células para la inyección, coloque el medio congelado de muestra y metilcelulosa de VX2 en agua tibia hasta que hayan descongelado.
   1. Aspire 0.5\u20121 mL de la suspensión de células descongeladas y un volumen igual de medio de metilcelulosa descongelado en una jeringa de 5 mL.
      Nota: Puede ser útil para utilizar una aguja de G 21 o 22 para aspirar a la suspensión de células y una aguja de calibre más grande para aspirar el medio de metilcelulosa. Coloque las jeringas en hielo.
3. Preparar al donante de tumor extremidades conejo para la inoculación de la suspensión celular, a partir de sedación con acepromazina de 1 mg/kg y 0,02 mg/kg buprenorfina administrada por vía intramuscular. Afeitar el sitio de inoculación (extremidades) con cortauñas y limpio que es el afeitado con un agente basado en alcohol o yodo.
   Nota: Meloxicam puede administrarse en una dosis de 0,2 mg/kg por vía subcutánea para analgesia. Piel de conejo es difícil afeitarse. Se recomienda que el investigador realizar varias pasadas, primero centrado en compensación una mayor parte de la piel y luego presionando los clippers contra la piel y yendo contra el grano.
4. Coloque una aguja de 16 G a la jeringa de 5 mL que contiene la suspensión de células e inyectar 1 mL de la suspensión en el vientre de los músculos de extremidades del conejo donantes, aproximadamente 1 cm de profundidad. Asegúrese de proteger el nervio ciático en un surco palpable a lo largo del fémur.
   Nota: VX2 fresco con éxito inocula el 88% de los sujetos mientras que VX2 congelada y descongelada es solamente éxito 33% del tiempo¹⁹.
   PRECAUCIÓN: El tumor VX2 crecerá rápidamente. Efectos secundarios que se pueden observar como los progresos de tumor son: aumento de frecuencia respiratoria, letargo, disminución del estado de alerta o cambios de comportamiento (p. ej., agresividad inusual). En consecuencia, las recomendaciones son para vigilar de cerca los animales y plan para cosecha de tumor dentro de dos semanas después de la inoculación.

2. VX2 extremidades Tumor crecimiento y cosecha

Nota: Suponiendo que la inoculación exitosa, debe haber un palpable nódulos de tumor (3\u20124 cm) en el sitio de inyección dentro de 2 semanas. Generalmente, este nódulo será palpable aproximadamente 1 semana; sin embargo, es mejor dejar que el tumor crezca para permitir la colección de tejido suficiente. Por lo general, este nódulo será firme, indurada y elevada sobre el nivel del músculo. If

1. Palpe el área inoculada a las 2 semanas de la inoculación. Si no hay crecimiento del tumor se detecta en 2 semanas, realice el paso 1 nuevamente. Vea la figura 1.
   Nota: La presencia de tumor también puede ser evaluada mediante ecografía. Mientras que no ha habido ningún estudio para evaluar la diferencia en los parámetros de crecimiento tumoral cuando se propaga en stock congelado en comparación con la acción fresca, ha sido nuestra experiencia que el tumor stock congelado crece un poco más lento y va a ser detectable después de la acción fresca en parte. A pesar de todo, cualquiera de los métodos debe generar un tumor cosechable por 2 semanas.
2. Preparar al donante de tumor extremidades para la cosecha de tumor. Anestesiar al conejo con 45 mg/kg ketamina y 5 mg/kg xilacina. Eutanasia con una dosis intravenosa (IV) de sodio pentobarbital a 390 mg/kg.
3. Una vez que el conejo ha sido sacrificado, empezar a cosechar el tumor eliminando el tejido cutáneo y subcutáneo que cubre el nódulo del tumor con un bisturí con hoja de cualquier tamaño el investigador considere necesario. Vea la figura 2.
4. Una vez que el nódulo tumoral ha sido identificado dentro de los músculos de extremidades, quitar el tumor en bloque con márgenes amplios curvilíneas. Para ello, cortar los puntos de fijación tendinosa en los extremos proximales y distales del músculo y luego traza la hoja de bisturí a lo largo del hueso subyacente. Atraviesan al espécimen explanted exponer la cápsula tumoral y base necrótica. Vea la figura 3.
   Nota: El tumor VX2 tiene un núcleo altamente necrótico. Asegúrese de utilizar protección para los ojos y otros equipos de protección personal cuando se cosecha el tumor, ya que cualquier daño en la cápsula del tumor puede resultar en expulsión de alta presión de ruina necrótica.
5. Raspar suavemente el núcleo necrótico con un objeto romo (por ejemplo, fórceps, pinzas hemostáticas) para limpiar el tumor. Esto debería permitir mejor visualización de la cápsula del tumor y el punto de transición entre la cápsula y músculos circundantes. Vea la figura 4.
6. De esta muestra, cosechar varios pedazos de tumor de aproximadamente 1\u20122 mm³ y almacenarlos inmediatamente en una taza que contenga solución salina estéril temperatura.
   Nota: Estas muestras de tumor se utilizará para la posterior implantación intrahepática.
7. El tumor restante en una placa Petri estéril y bañarlo con el medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM). Si esta pieza se mantiene frío en hielo, puede preservarse para manejar hasta 2\u20123 h más tarde.

3. hígado Tumor implantación vía laparotomía

1. Preparar el conejo receptor para la laparotomía. Anestesiar el conejo receptor con 45 mg/kg ketamina y xilacina de 5 mg/kg para la inducción seguida de intubación y mantenimiento con 1% - 3% isoflurano como necesario. Cuando el conejo está anestesiado, afeitar el sitio quirúrgico con cortar el pelo. Limpiar la zona de incisión con triplicado lavado con solución de betadine, solución de etanol 70% y betadine scrub y cubra el abdomen de manera quirúrgica estéril.
2. Usando una hoja #15, iniciar la laparotomía haciendo una pequeña incisión del midline vertical hacia abajo a través de la piel del conejo a partir del proceso del xiphoid. Esto debe ser fácilmente palpated y tiende a ser aproximadamente del tamaño de un centavo americano. Vea la figura 5.
3. Reflejar la piel e identificar la linea alba. Esto debe ser una banda reflectante blanca de tejido viaja inferiorly en la línea media. Realice una disección Roma para atravesar el linea alba y exponer el peritoneo. Vea la figura 6.
   Nota: El peritoneo se identifica fácilmente ya que va ser sobrepuesta directamente el intestino, que puede verse en movimiento con la respiración.
   PRECAUCIÓN: El peritoneo tiende a ser adherente al intestino subyacente debido a la tensión superficial. Con trauma embotado a diseccionar la linea alba ayuda a disipar el riesgo de perforar el intestino subyacente.
4. Una vez que se expone el peritoneo, diseccionar cuidadosamente a través de él para entrar en la cavidad peritoneal. El hígado se puede identificar. Para navegar mejor por el espacio abdominal, extender la incisión de línea media 1\u20122 cm inferiorly a través de la piel, músculo y peritoneo.
   Nota: Ampliar la incisión del midline puede fácilmente y con seguridad hacer insertando con cuidado un hemostato curvo en el espacio peritoneal con la punta curvada hacia superficialmente hacia el peritoneo. Luego abrir la pinza un poco y use una hoja que lindo el tejido entre los dos brazos de la pinza.
5. Identificar el lóbulo izquierdo del hígado con el fin de seleccionar un sitio para la implantación del tumor. El lóbulo izquierdo es infero-lateral al medial lóbulo que se encuentra en la línea media.
6. Antes de dibujar el hígado fuera del espacio peritoneal, coloque un pedazo seco de gasa en el aspecto inferior de la incisión.
   Nota: La gasa proporcionará una superficie adherente para poner el hígado para evitar que se retraiga hacia el abdomen.
7. Cuidadosamente usando pinzas atraumáticas o un trozo de gasa húmeda sobre los dedos, dibujar el lóbulo izquierdo del hígado en el abdomen a través de la incisión y la pongo en la gasa seco colocada anteriormente. Vea la figura 7.
   PRECAUCIÓN: La cápsula hepática es sensible y fácilmente puede ruptura. Es fundamental para ser suave al manejar este órgano para evitar la hemorragia capsular, hematoma hepático o eventual Hemoperitoneo.
   Nota: Generalmente, el hígado se declararse visualmente al entrar en el espacio peritoneal; sin embargo, si se dilata el estómago del conejo, el hígado puede ser empujado cranially fuera de la vista. Si este es el caso, levante suavemente la pared abdominal usando una sonda Roma. En este escenario, el hígado tiende a adherirse al aspecto ventral del diafragma debido a la tensión superficial tan cuidadosamente separado el hígado con una sonda Roma y debe separar. Utilizar pinzas atraumáticas para extraer el hígado.
8. En este punto, preparar el tejido del tumor para la implantación y coloque un trozo de gasa húmeda sobre el hígado para protegerlo.
9. Seleccione una pieza de³ mm de 1\u20122 de tejido del tumor que se generó en el paso 2.6 para la implantación en el hígado. Vea la figura 8.
10. Usando una cuchilla #11, punción en el tejido del hígado en un ángulo de 45° haciendo un bolsillo profundo de 0,5 cm, teniendo cuidado de no para penetrar en el aspecto dorsal de la cápsula hepática. Deje la hoja en su lugar después de la punción. Consulte la figura 9.
11. Suavemente Levante la cuchilla en dirección ventral para crear un pequeño bolsillo en el lecho hepático. Tome el pedazo de tumor con unas pinzas, coloque la pieza de tumor en este bolsillo y retire la hoja.
    Nota: La cuchilla se puede quitar antes de insertar la pieza tumoral, sin embargo, sangrará el hígado y esto puede ocultar el sitio de punción, lo que es difícil de identificar.
    PRECAUCIÓN: Asegúrese de minimizar el contacto del tumor con cualquier otras estructuras para evitar la siembra tumoral no intencional. Esto puede también evitarse dejando de lado cualquier herramienta usada para ayudar con la implantación de luego.
12. En este punto, coloque un pedazo de hemostáticos, tales como la espuma del gel, sobre el bolsillo de tumor para promover la hemostasia y prevenir la eyección de la pieza tumoral.
13. Volver el hígado en el abdomen, una vez que se confirma la hemostasia.
14. Cerca de la pared abdominal con sutura de polidioxanona en una aguja cónica con un simple continuo de la puntada y cerrar la piel con 910 suturas de Poliglactina de 4-0 en una aguja de corte con puntada subcuticular continua de 3-0.
    PRECAUCIÓN: Al cerrar la pared abdominal, tenga cuidado para no dañar el epiplón u otras estructuras del intestino en un tiro de sutura.
    Nota: Mientras este tumor llevará por lo menos 2 semanas para ser definitivamente radiológicamente identificables, alcanza un tamaño de 1.5\u20122 cm de diámetro a 3 semanas de crecimiento. Tenga cuidado de no permitir que el tumor hepático a crecer más allá de semanas de 3.5\u20124 ya que el tumor forma un exophytic masa y agresivamente difundir localmente.

4. VX2 Preparación de suspensión de Tumor

1. Colocar un tamiz de 40 μm en la boca de un tubo de propileno cónico de 50 mL. El tumor de paso 2.7, utilizar una hoja #15 para raspar la superficie del tumor para recoger tumor viable y estos desechos en el colador.
2. Lave las raspaduras de tumor viable a través de un tamiz con DMEM y luego centrifugar el tubo de propileno a 1600 rpm por 8 minutos.
3. Después de que la centrífuga esté completa, quite el sobrenadante y deséchelo. Luego agregar metilcelulosa al bloque de celdas restantes en proporción volumétrica 1:1.
4. Inyectar la suspensión en un conejo de donantes extremidades siguiendo pasos 1.3\u20121.4. Coloque la suspensión restante en alícuotas de 1 mL en tubos criogénicos y congelar en nitrógeno líquido para su uso posterior.

5. angiográfico utilización del VX2 Tumor hígado

1. Preparar el conejo como se describe en el paso 3.1.
2. Palpe el surco femoral en la ingle. Cuando la ranura ha sido identificada, haga una incisión lineal de 2\u20123 cm a lo largo de la ranura. Vea la figura 10.
3. Con disección Roma, localizar y aislar el paquete femoral que contiene la vena femoral, arteria y nervio. Vea la figura 11.
4. Otra vez, realice una disección Roma para separar la arteria femoral del resto de las estructuras en el mismo paquete y aislar la arteria sobre un mango de bisturí. Vea la figura 12.
5. Con kit introductor de 3 franceses utilizan la técnica de Seldinger para acceder con una aguja. Introduzca una guía metálica y sacar la aguja para avanzar la vaina 3-francés en el recipiente. Vea la figura 13.
   PRECAUCIÓN: Evite el uso excesivo de la fuerza en el avance de la vaina 3-francés, ya que puede producir transección de la arteria femoral.
6. Bajo guía fluoroscópica y utilizando un catéter guía y agente de contraste de iohexol, seleccione el tronco celíaco — generalmente situado a nivel de T12 y luego haga avanzar el catéter en la arteria hepática izquierda vía el campo común hepático y adecuado hepática.
7. En este punto, administrar al agente de elección a través del catéter. Una vez que el agente se administra, retire el catéter.
8. Con sutura de seda 3-0, ligar la arteria femoral proximal y distal al punto de inserción de la vaina. Asegúrese de apretar el nudo proximal a la vaina como que se retira para evitar el sangrado.
9. Cerrar la incisión inguinal con 910 suturas de Poliglactina de 4-0 en una aguja de corte con una puntada subcuticular.
10. Mantener la recuperación animal cuidados y monitor postoperatoria estándar. Realizar eutanasia y necropsia según sea necesario utilizando las técnicas estándar.

Resultados

Cuando se observa en la figura 1, está claro que se amplía del quadricep del conejo. Además, varios pequeños nódulos discretos, típicamente la correlación con el crecimiento del tumor a través de la fascia, son visibles. A la palpación, la extremidad inyectada debe aparecer que la extremidad no. Si un investigador requiere más definitiva garantía de presencia de tumor, proyección de imagen de ultrasonido puede utilizarse para identificar el tumor en el múscul...

Discusión

El primer paso crítico en la metodología de tumor VX2 es propagación exitosa de un tumor en la extremidad trasera de un conejo donador. Se refieren al primer párrafo en la sección de "Resultados de representante" para más información sobre este paso.

El próximo paso crítico es asegurar que la cápsula del tumor viable se identifica correctamente. No sólo será necesario para la preparación de la suspensión de tumor, pero también es importante para la selección y generación de piezas de tumor hep...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
MethoCult (meticelulosa)	Stemcell Technologies	M3134
VX2 Línea celular	NCI	VX-2
5 mL Jeringa	BD	309646
16 g Aguja	BD	305197
22 g Aguja	BD	305155
cortapelos	Wahl	41870-0438
Espuma Caja Isotérmica	Mr. Box Online	10 x 10 x 4
Acepromazine	Henry Schein	003845
Buprenorfina	Par	42023-179-05
Meloxicam	Henry Schein	049755
Almohadillas de Alcohol	Covidien	5033
Ketamina	Henry Schein	056344
Xilacina	Akorn	59399-110-20
Pentobarbital (Fatal-Plus)	Vortech	9373
Placa de Petri estéril	Thermo Fisher	172931
DMEM	Gibco 11965092
solución salina	Baxter	2F7124
15 cuchillas	Steris	02-050-015
Mango de bisturí x 2	Steris	22-2381
Hemostático curvo	WPI	501288
pinza atraumática	Sklar	52-5077
Gasa	Medline	NON21430LF
11 hojas	Steris	02-050-011
Surgicel	Ethicon	1951
3-0 PDS / Cono	Ethicon	Z305H
4 - 0 Vicryl / Corte	Ethicon	J392H
40 μ Filtro m	BD	352340
Tubo cónico de 50 mL	Pipeta de plástico Thermo Fisher	339652
			Thomas
Scientific	Sorvall	75004240
tubos de 1,40 mL (rosca interna)	Micronic	MP32131-Z20
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