Artículo de método
Aquí se describe un método de fotoblanqueo para reducir la autofluorescencia de las cianobacterias. Después de photobleaching, microscopia óptica estocástica de la reconstrucción se utiliza para obtener imágenes de resolución súper tridimensional del anillo de FtsZ cianobacterias.
Microscopía de superresolución ha sido ampliamente utilizado para el estudio de las interacciones entre proteínas y estructuras subcelulares en muchos organismos. En organismos fotosintéticos, sin embargo, la resolución lateral de proyección de imagen de súper-resolución es sólo de ~ 100 nm. La baja resolución es principalmente debido al fondo de la autofluorescencia alta de células fotosintéticas causados por rayos láser de alta intensidad que se requieren para la proyección de imagen de súper-resolución, tales como microscopía óptica estocástica de la reconstrucción (tormenta). Aquí, describimos un asistida por photobleaching tormenta método desarrollado recientemente para la proyección de imagen la picocyanobacterium Marina Prochlorococcus. Después de photobleaching, el autofluorescence de Prochlorococcus es reducido por lo que la tormenta se puede realizar con una resolución lateral de ~ 10 nm. Usando este método, adquiere la organización en vivo tridimensional (3D) de la proteína FtsZ y caracterizar cuatro diferentes morfologías de anillo de FtsZ durante el ciclo celular de Prochlorococcus. El método que se describe aquí puede adoptarse para la proyección de imagen de súper-resolución de otros organismos fotosintéticos.
Microscopías de super-resolución pueden romper el límite de difracción de la luz y proporcionan imágenes en resoluciones de la secundario-difracción (< 200 nm). Han sido ampliamente utilizados en muchos organismos para estudiar la localización de proteínas y estructuras subcelulares. Grandes súper resolución microscopia métodos incluyen microscopía de iluminación estructurada (SIM), estimuló la microscopia de agotamiento de la emisión (STED), tormenta y microscopía de localización fotoactivado (PALM). Los mecanismos y aplicaciones de estos súper-resolución microscopios han sido revisaron en otra parte1,2.
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1. preparación y fijación de la muestra
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TORMENTA alcanza proyección de imagen de súper-resolución activando fotoconmutables individuales fluoróforos estocástico. Se registra la ubicación de cada fluoróforo y una súper resolución de imagen se construye entonces basado en estos puntos4. Por lo tanto, la precisión de la localización del fluoróforo es importante para la reconstrucción de imagen de la estupendo-resolución. Los espectros de absorción de Prochlorococcus pico en 447 nm y 680 nmy Pro.......
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En este protocolo, se describe un procedimiento para reducir significativamente la autofluorescencia de la cianobacteria Prochlorococcus (figura 3) y, luego, immunostain las proteínas en las células, que nos permitieron utilizar tormenta para estudiar la FtsZ 3D morfologías de anillo en Prochlorococcus (figura 4). Este protocolo puede adoptarse para la proyección de imagen de súper-resolución de otros organismos fotosintéticos.
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Los autores no tienen nada que revelar.
Los autores agradecen Daiying Xu por su asistencia y comentarios sobre el manuscrito. Este estudio es apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (número de proyecto 41476147) y el Consejo de becas de investigación de la región administrativa especial Hong Kong, China (números de proyecto 689813 y 16103414).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Partículas de poliestireno | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 y micro; m |
| Cubreobjetos | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Espesor Nº 1 |
| Etanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Hidrobromuro de poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70.000-150.000 |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Solución de glutaraldehído, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Sal disódica, 2-hidratos | oro biotecnología | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Suero de cabra | Sigma | G9023 | |
| anti- Anabaena Anticuerpo FtsZ | Agrisera | AS07217 | |
| Cabra anti-Conejo IgG (H+L) Anticuerpo secundario de adsorción cruzada | Life Technologies | A-21039 | conjugado con Alexa Fluor 750 |
| D-Glucosa Anhidra | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ácido Ascórbico | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Metil Viológeno | Sigma-Aldrich | ||
| Ciclooctatetraeno | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| glucosa oxidasa | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalasa | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Fuente | 250 W | ||
| Microscopio STORM | Microscopio | NBI | |
| Rohdea | Software NBI | SRiS 3.0 | para la adquisición de imágenes |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | para la corrección de la deriva |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
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