Locus coeruleus es un pequeño grupo de neuronas implicadas en una variedad de procesos fisiológicos. Aquí, describimos un protocolo para preparar secciones de cerebro de ratón para estudios de proteínas y metales en este núcleo.
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Artículo de método
Localización del Locus Coeruleus en el cerebro de ratón
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Resumen
Resumen
El locus coeruleus (LC) es un importante centro de norepinefrina produciendo neuronas que modulan varias funciones fisiológicas. Anormalidades estructurales o funcionales de LC afectan varias regiones del cerebro incluyendo la corteza, hipocampo y cerebelo y pueden contribuir a la depresión, trastorno bipolar, ansiedad, así como la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Estos trastornos a menudo se asocian a misbalance metal, pero el papel de los metales en LC se entiende solamente parcialmente. Estudios morfológicos y funcionales de LC son necesarios para comprender mejor las patologías humanas y la contribución de metales. Los ratones son un modelo experimental utilizado, pero el ratón LC es pequeño (~0.3 mm de diámetro) y difíciles de identificar para un no experto. Aquí, describimos un protocolo de inmunohistoquímica-base paso a paso para localizar la LC en el cerebro de ratón. Dopamina-β-hidroxilasa (DBH) y alternativamente, la tirosina hidroxilasa (TH), ambas enzimas altamente expresadas en la LC, se utilizan como marcadores inmunohistoquímicos en rebanadas de cerebro. Secciones adyacentes a las secciones que contiene la LC pueden utilizarse para su posterior análisis, incluyendo histología para estudios morfológicos, pruebas metabólicas, así como la proyección de imagen de metal por microscopía de fluorescencia de rayos x (XFM).
Introducción
El locus coeruleus (LC) es una región importante en el médula oblonga y un sitio importante de producción de norepinefrina (NE)1. La LC envía proyecciones a lo largo de los2 del cerebro a la corteza, el hipocampo y el cerebelo3 y regula procesos fisiológicos importantes, incluyendo el ritmo circadiano4,5, atención y memoria6, tensión de7,8de procesos cognitivos y emoción9,10. Disfunción de la LC ha sido implica....
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Protocolo
Estudios de los animales fue aprobado por la Johns Hopkins University Animal cuidado y número de protocolo de uso (ACUC) M017M385.
1. cerebro de corte
- Para inmovilizar, anestesiar ratones por la aplicación del 3% de isoflurano.
- Remoje una bola de algodón con gotas de isoflurano y colocar en un tubo de microcentrífuga de 15 mL. Colocar la nariz del animal en el tubo y deje que se inhale el isoflurano. Compruebe que la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta a la pizca del dedo del pie.
- Colocar el animal sobre su espalda e inmovilizar por fijar sus extremidades hacia abajo con un alfiler ....
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Resultados
Cambios en la homeostasis de metales (tales como Cu, Fe, Zn y Mn) a menudo se observan en trastornos neurológicos, incluyendo cambios en la LC34,35. Así, determinar los niveles de metales en el cerebro es necesario para la comprensión de los mecanismos de la enfermedad. Las secciones de la cerebral generadas utilizando el protocolo descrito pueden utilizarse para cuantificar los niveles de Cu y otros metales en la LC y compararlos.......
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Discusión
Orientar adecuadamente la muestra es un paso crucial en el presente Protocolo. Porque estamos usando características anatómicas de la superficie dorsal del cerebro para localizar LC (límite entre cerebelo y colículo inferior), es importante alinear correctamente las secciones. Esto requiere cuidado en fijar adecuadamente el cerebro en la matriz de máquina de cortar de cerebro de ratón. Recomendamos cortar ~ 500 μm más tejido anterior y posterior al LC para evitar la falta del núcleo. El error más común es cortar seccione.......
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Agradecimientos
Agradecemos a Abigael Muchenditsi para el mantenimiento de la colonia de ratón. Uso de la fuente de fotones avanzado en el Laboratorio Nacional Argonne fue apoyado por el Departamento de energía de Estados Unidos, oficina de ciencia, oficina de energía ciencias básicas, con el número de contrato: DE-AC02-06CH11357. Agradecemos a Olga Antipova y Dr. Stefan Vogt para soporte a usuarios y asistencia en la fuente avanzada de fotones. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de salud beca 2R01GM101502 a SL.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Matriz cortadora de cerebro de ratón adulto | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Anticuerpo secundario anti-conejo, Alexa Fluor 488 (fuente - burro) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Portaobjetos de vidrio cargados | Genesee | 29-107 | |
| Microscopio confocal | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Cuchillas de corte Cryostat | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Scissors Mini, 9,5 cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Anticuerpo de dopamina y beta;-hidroxilasa (DBH) - producción propia (fuente - conejo) | B. Eipper | - | |
| Anticuerpo de dopamina y beta;-hidroxilasa (DBH) - disponible comercialmente (fuente - conejo) | Señalización celular | 8586 | |
| Tubos Falcon, 50ml | EE. UU. Scientific | 339652 | |
| Forano (isofluorano) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Pinzas Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Hardset Medios de montaje | EM sciences | 17984-24 | |
| Microscopio | Pascal | LSM 5 | |
| placas multipocillo, 24 pocillos | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Temperatura óptima de corte compuesto (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
| Paraformaldehído (PFA)/formalina 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Moldes de inclusión desechables Peel-A-Way | Polysciences Inc. | 18646A | |
| lápices | |||
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| Hojas de afeitar Amazon | ASIN: | ||
| Espátulas | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T | pines Office Depot | 344615 | |
| El cerebro del ratón en coordenadas estereotáxicas, Paxinos y Franklin, 3ª Edición | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (para preparar PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| Anticuerpo de tirosina hidroxilasa (TH) (fuente - conejo) | EMD Millipore | AB152 | |
| Película delgada de ultralene para XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
| Microscopio fluorescente de campo amplio | Zeiss | Axio Zoom.V16 |
Referencias
- Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).
- Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J.
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 4/08/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain. An author affiliation was updated.
The affiliation for Evan Maxey was updated from:
Department of Neuroscience, Johns Hopkins University
to:
X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory
