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Uso de sistemas robóticos para procesar e integrar colónicas murinas muestras para análisis histológicos

DOI:

10.3791/58654

January 7th, 2019

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 2/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:

Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

to:

Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

Summary

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Falta de estandarización para el procesamiento de tejido murino reduce la calidad del análisis histopatológico murino en comparación con los especímenes humanos. Aquí, presentamos un protocolo para realizar el examen histopatológico de tejidos colon inflamados y uninflamed murinos para demostrar la viabilidad de sistemas robóticos que se utilizan habitualmente para el tratamiento y la inclusión de muestras humanas.

Abstract

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La comprensión de enfermedades humanas se ha ampliado considerablemente gracias al estudio de modelos animales. Sin embargo, la evaluación histopatológica de modelos experimentales debe ser tan riguroso como el que aplica para muestras humanas. De hecho, extraer conclusiones fiables y precisas críticamente está influenciada por la calidad de la preparación de la sección de tejido. Aquí, describimos un protocolo para el análisis histopatológico de los tejidos murinos que implementa varios pasos automatizados durante el procedimiento, desde la preparación inicial para la inclusión en parafina de las muestras murinas. La reducción de variables metodológicas mediante la estandarización de protocolo riguroso de procedimientos automatizados contribuye al aumento de la fiabilidad global del análisis patológico murino. Específicamente, este protocolo describe la utilización de tratamiento automatizado e incorporar sistemas robóticos, utilizado habitualmente para el proceso de tejido y la inclusión en parafina de muestras humanas, para procesar a muestras murinas de inflamación intestinal. Concluimos que la fiabilidad de la examinación histopatológica de los tejidos murinos se aumentó significativamente con la introducción de técnicas estandarizadas y automatizadas.

Introduction

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En las últimas décadas, se han desarrollado varios modelos experimentales para diseccionar los mecanismos patogénicos que conducen a enfermedades humanas1,2. Para evaluar la severidad de una enfermedad, los investigadores deben evaluar el efecto de un tratamiento y estudiar las variaciones citológicas e histológicas arquitectónicas o la cantidad de inflamación3. Para realizar en los modelos experimentales, son necesarios los análisis histopatológicos detallados, a menudo comparando muestras murino y humano4,5.

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Protocol

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Procedimientos animales fueron aprobados por el Ministerio de salud (auth. 127/15, 27/13) y siguieron las pautas de cuidado de los animales del Instituto Europeo de Oncología IACUC (Comité de uso y cuidado Animal institucional)

1. crónica Colitis inducción administración de DSS repetitivas

  1. Independiente edad y sexo igualada ratones en 2 grupos (DSS tratamiento vs control H2O, al menos 5 hermanos de camada de ratones por grupo experimental).
  2. Administrar 2.5% DSS (40 kDa) en el agua potable para 7 días para el grupo de tratamiento y agua para el grupo de control.
    Nota: Este modelo induce una ....

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Results

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La colitis crónica experimental inducida por la administración repetida de DSS en el agua potable es un modelo murino de inflamación intestinal muy parecidas a la humana EII8,9. La figura 1 describe los efectos del tratamiento de DSS, incluyendo colon acortar (figura 1A), un parámetro utilizado para anotar la presencia de la inflamación inducida por DSS y colon expresión .......

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Discussion

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Utilizamos diferentes pasos automatizados durante la preparación de tejidos murinos para análisis histopatológico. Este protocolo tiene como objetivo brindar consejos técnicos para aumentar la reproducibilidad y la estandarización de todo el proceso, mejorando así la calidad de la evaluación histopatológica definitiva. Implementamos instrumentos automatizados y métodos para la preparación y fijación de los tejidos, habitualmente utilizados en las instalaciones de base de patología para el estudio de especímenes humanos.<.......

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Agradecemos al Departamento de patología del IRCCS Policlinico Hospital, Milan para el soporte técnico y la facilidad de Animal de IEO para asistencia en la ganadería.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Etanol absoluto anhidroCarlo Erba414605 reactivo
ETOH absolutoReactivo Honeywell02860-1L
Sulfato de aluminio y potasioSIGMAA6435
Azul de anilinaSIGMAreactivo415049
carbol FucsinaSIGMAC4165reactivo
CD11b (clon M1/70)TONBO biosciences35-0112-U100anticuerpo
CD20 IHC (clon SA275A11)Biolegend150403anticuerpo
CD3 (17A2)TONBO biosciences35-0032-U100anticuerpo
CD4 (GK1.5)BD Biosciences552051anticuerpo
CD45.2 (clon 104)BioLegend109837anticuerpo
CD8 (53-6.7)BD Biociencias553031anticuerpo
Tampón de citrato pH 6 10xReactivo SIGMAC9999
DabVector LaboratoriesReactivoSK-4100
DPBS 1xReactivo MicrogemL0615-500DSS
TdB ConsultancyDB001reactivo
EDTASIGMAE9884reactivo
EnVision Flex Reactivo bloqueante de peroxidasaCompreso DAKOen GV80011-2
Sustrato EnVision FlexCompreso DAKOen GV80011-2
Compresión EnVision Flex/HRPDAKOen GV80011-2
EnVision Flex+ Rat LinkerCompreso DAKOen GV80011-2
ReactivoEosin VWR1.09844
F4/80 (clon BM8)Anticuerpo BioLegend123108
FormalinaPanReac2.529.311.215reactivo
ácido acético glacialSIGMA71251
reactivo Cabra-anti-rata-HRPAnticuerpoAgilent DAKOP0448
HematoxilinaReactivo DIAPATHC0303
LEICA Microtomo rotativo (RM2255)LeicaRM2255equipo
Ly6g (clon 1A8)BD Biosciences551459anticuerpo
Óxido de mercurio IIReactivo203793 SIGMA
Agente de compensación Omnis ClearifyDAKOReactivo CACLEGAL
Omnis EnVision Flex TRSReactivo DAKOGV80011-2
Orange GSIGMAO3756
ParafinaReactivo Sakura7052
Equipos PelorisLEICA
PercollSIGMAP4937reactivo
RPMI 1640 sin L-GlutaminaMicrogemReactivo L0501-500
STS020EquiposLeica
Tissue-Teck Paraform Cassette seccionableEquipo
Tissue-Tek Embedder de parafina automatizadoEquipo Sakura
XilenoJ.T.Baker8080.1000reactivo
de SAKURA 7022

References

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  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
  2. Olivier, A. K., et al. Gen....

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Robotic Tissue ProcessingMurine Sample EmbeddingHistological Analysis ProtocolAutomated Paraffin EmbeddingColonic Murine TissueIntestinal Inflammation ModelH E Staining ValidationImmunohistochemical StainingTissue Cassette PreparationAutomated Processor Operation

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