Uso de sistemas robóticos para procesar e integrar colónicas murinas muestras para análisis histológicos

Summary

Falta de estandarización para el procesamiento de tejido murino reduce la calidad del análisis histopatológico murino en comparación con los especímenes humanos. Aquí, presentamos un protocolo para realizar el examen histopatológico de tejidos colon inflamados y uninflamed murinos para demostrar la viabilidad de sistemas robóticos que se utilizan habitualmente para el tratamiento y la inclusión de muestras humanas.

Abstract

La comprensión de enfermedades humanas se ha ampliado considerablemente gracias al estudio de modelos animales. Sin embargo, la evaluación histopatológica de modelos experimentales debe ser tan riguroso como el que aplica para muestras humanas. De hecho, extraer conclusiones fiables y precisas críticamente está influenciada por la calidad de la preparación de la sección de tejido. Aquí, describimos un protocolo para el análisis histopatológico de los tejidos murinos que implementa varios pasos automatizados durante el procedimiento, desde la preparación inicial para la inclusión en parafina de las muestras murinas. La reducción de variables metodológicas mediante la estandarización de protocolo riguroso de procedimientos automatizados contribuye al aumento de la fiabilidad global del análisis patológico murino. Específicamente, este protocolo describe la utilización de tratamiento automatizado e incorporar sistemas robóticos, utilizado habitualmente para el proceso de tejido y la inclusión en parafina de muestras humanas, para procesar a muestras murinas de inflamación intestinal. Concluimos que la fiabilidad de la examinación histopatológica de los tejidos murinos se aumentó significativamente con la introducción de técnicas estandarizadas y automatizadas.

Introduction

En las últimas décadas, se han desarrollado varios modelos experimentales para diseccionar los mecanismos patogénicos que conducen a enfermedades humanas^1,2. Para evaluar la severidad de una enfermedad, los investigadores deben evaluar el efecto de un tratamiento y estudiar las variaciones citológicas e histológicas arquitectónicas o la cantidad de inflamación³. Para realizar en los modelos experimentales, son necesarios los análisis histopatológicos detallados, a menudo comparando muestras murino y humano^4,5.

Además, muestras humanas comúnmente son procesadas y anotó por las instalaciones del núcleo de histopatología y patólogos experimentados humanos a través de estandardizado métodos y criterios histopatológicos. Por el contrario, tejidos murinos son generalmente fijos, incrustados y analizados por los investigadores con experiencia limitada de protocolos histopatológicos. La calidad y fiabilidad de la examinación histopatológica comienza con la preparación de las secciones de tejido de alta calidad. Varios factores contribuyen críticamente al aumento o disminución de la calidad de definitiva, incluyendo fijación, macroscópica seccionamiento, procesamiento, de parafina inclusión, inclusión de las muestras^6,7.

Todos estos pasajes que implican manipulación de la muestra están sujetos a errores manuales, incluyendo la inclusión manual de las muestras y, en menor medida, microtomo manual corte y tinción. En la actualidad, todo el proceso de preparación de tejido murino para la evaluación histológica se basa en protocolos manual y protocolos que varían de laboratorio a laboratorio. El objetivo de este estudio es implementar protocolos estandarizados automatizados para reducir errores y variabilidad en la examinación histopatológica murina.

A nuestro conocimiento, Describimos aquí los primeros protocolos de tejido completamente automatizado de procesamiento y embebido para la evaluación histológica de los tejidos murinos; Estos se utilizan habitualmente en las unidades de patología para el análisis de muestras humanas. Como un ejemplo práctico de la viabilidad del método, un modelo murino de inflamación intestinal ha sido analizado, es decir,, el modelo de colitis crónica causada por la administración repetida de sulfato de sodio de dextrano (DSS) en el agua potable^{8 ,9}. Este ajuste experimental de cerca se asemeja a humano inflamatoria intestinal (EII) las enfermedades¹⁰ puesto que animales tratados con DSS exhiben signos de inflamación intestinal, por ejemplo, pérdida de peso, heces sueltas o diarrea y acortamiento del colon, así como fibrosis ^8,9,11. Como observado en pacientes humanos con enfermedad inflamatoria intestinal, tratamiento de DSS genera un curso de la enfermedad compleja. En este contexto, elaboradas evaluaciones histológicas están obligadas a entender la profunda alteración de la arquitectura del tejido. Así, la aplicación de los protocolos descritos para aumentar la calidad de preparación de la muestra podría beneficiarse los investigadores basándose en la interpretación de histológicos y análisis immunohistochemical para la configuración experimental murino. Modelos experimentales murinos de enfermedades humanas que implican alteraciones de la arquitectura del tejido, la presencia de infiltrado de tejido celular o inflamación de diferentes tejidos y órganos (intestino, cerebro, hígado, piel) puede utilizar el aumento de la calidad de la preparación de muestras para examen histopatológico.

Protocol

Procedimientos animales fueron aprobados por el Ministerio de salud (auth. 127/15, 27/13) y siguieron las pautas de cuidado de los animales del Instituto Europeo de Oncología IACUC (Comité de uso y cuidado Animal institucional)

1. crónica Colitis inducción administración de DSS repetitivas

1. Independiente edad y sexo igualada ratones en 2 grupos (DSS tratamiento vs control H₂O, al menos 5 hermanos de camada de ratones por grupo experimental).
2. Administrar 2.5% DSS (40 kDa) en el agua potable para 7 días para el grupo de tratamiento y agua para el grupo de control.
   Nota: Este modelo induce una inflamación intestinal crónica transmural del⁹.
3. Después de 7 días, interrumpir el tratamiento de la DSS y dar agua a ambos grupos durante 14 días. Repita este proceso 3 veces.
   Nota: La administración repetitiva de DSS induce alteraciones de la mucosa colónica muy parecidas a la humana enfermedad inflamatoria intestinal, es decir, fibrosis⁹.
4. Ratones según los procedimientos autorizados por la IACUC institucional, es decir,, de sacrificio por inhalación de CO₂ .
5. Abrir el ratón abdomen y peritoneo con bisturí.
   Nota: Esterilidad se recomienda pero no estrictamente necesarios.
6. Separar el colon del intestino con fórceps y pinzas. Suprimir los puntos con pinzas y pinzas.
   Nota: Medida de la longitud del colon (figura 1A) es un método para determinar si la colitis se produjo en ratones tratados con DSS.
7. Enjuague el colon en una placa Petri con 10 mL de frío 1 x solución salina buffer fosfato (PBS) y presione suavemente para eliminar materia fecal.

2. fijación de tejidos murino

1. Sumerja cada muestra de colon murino en 10 mL de 10% neutro tamponado con formalina (NBF) a TA (temperatura ambiente).
   Nota: Esterilidad se recomienda pero no estrictamente necesarios.
2. Fijar el tejido durante 18 – 24 h a TA.

3. dos puntos de seccionamiento y preparación de tejido

1. Saque los tejidos fijos el contenedor NBF con pinzas pequeñas y ponerlas en una placa Petri. Poner el colon en una placa de trabajo seccionamiento con pinzas pequeñas.
2. Corte de dos puntos en fragmentos (0,2 cm y longitudes de 0.3 cm) con un bisturí estéril. Esta longitud de fragmento es óptima para no exceder el espesor de la cinta.
3. Recoger segmento colon uno con pinzas pequeñas (figura 2A). Inserte el segmento colon una en uno de plástico que sobresalen puntas de la parafina orientada encajadura del cassette con pequeñas pinzas (figura 2B).
4. Repetir la operación (3.2 – 3.3) con un segmentos de colon 3 adicional por cassette. Evitar insertar los segmentos adyacentes puntas salientes, para minimizar la acumulación de los tejidos
5. Cierre firmemente la cinta presionando cuidadosamente los cuatro bordes (figura 2). Evite apretar el tejido para evitar daños en los tejidos.
6. Inserte la rejilla en un bastidor de soporte plástico. La estructura de soporte para identificar la muestra de la etiqueta. Repita para cada muestra biológica.

4. procesamiento de tejido

1. Encienda el procesador automatizado pulsando el botón de encendido (Figura 3A, 3B).
2. Caliente durante 1 h para derretir la cera de parafina. Espere hasta que el instrumento confirma que la parafina se derrita totalmente, observando la presencia del icono dedicado (figura 3).
3. Inserte cada cassette orientada (contiene a las muestras de tejido) manualmente en el cesto metal proporcionado por el procesador automatizado (figura 3D). Coloque verticalmente los cassettes de guarnición cerca de uno a otro para optimizar la ocupación de la cesta.
4. Cerca de la canasta de metal (figura 3E).
5. Abra la tapa de la retorta (figura 3F). La réplica es el lugar donde se inserta el cesto en la máquina. Inserte la cesta en el alojamiento dedicado del procesador (figura 3). Cierre la tapa de la retorta (figura 3 H).
6. Utilice la pantalla táctil en el equipo del instrumento para definir el protocolo de trabajo (figura 3I). Elegir la secuencia de soluciones, tiempo y temperatura a implementarse según el esquema previsto en la tabla 1.
7. Asignar el protocolo para ejecutarse en la réplica que contiene la cesta haciendo clic en el icono de PC dedicado (figura 3J). Iniciar el protocolo haciendo clic en el Botón de inicio (figura 3 L).
8. Espere hasta que el instrumento confirma el final del Protocolo, mediante la observación de la presencia del icono dedicado y escuchando el tono de alarma de la máquina.
9. Abra la tapa de la réplica. Retire la cesta del procesador (figura 3 M).

5. tejido incrustar

1. Encienda el embedder automática presionando el botón de encendido (Figura 4A).
2. Caliente durante 1 h para derretir la cera de parafina. Espere hasta que el instrumento confirma que la parafina se derrita totalmente mediante la observación de la temperatura del baño de parafina indicada por el termómetro interno del instrumento.
3. Transferir manualmente todos los cassettes procesados de la canasta del procesador a la rejilla embebido. Cada rack puede contener hasta 32 casetes. (Figura 4B, 4C).
4. Abra la tapa principal embedder (figura 4, 4D, 4E).
5. Utilice la pantalla táctil del equipo de instrumentos para indicar que la robótica sistema que un rack está siendo insertado (figura 4F).
6. Abra la tapa de la caja de entrada (figura 4). Inserte la rejilla en la caja de entrada. Cada embebido puede contener hasta 4 estantes simultáneamente (figura 4 H, 4I). Cierre la tapa de entrada (figura 4J).
7. Utilice la pantalla táctil en la computadora de instrumento para iniciar el procedimiento de inclusión, según la tabla 2 (figura 4 K).
   Nota: Cada rack de 32 casetes tiene 45 minutos para empotrar.
8. Espere hasta que el instrumento confirma el final del Protocolo, mediante la observación de la presencia del icono dedicado (figura 4 L).
9. Retire también la parrilla de salida (figura 4 M). Cierre la tapa principal embedder.
10. Retire los bloques incrustados (contiene las redes de orientación) de la rejilla. La transferencia de los bloques integrados en una caja de cartón de almacenamiento.

6. micrómetro de seccionamiento

1. Encienda la placa de enfriamiento del microtomo. Temperatura entre -8 y -10 ° C.
2. Encender el baño de agua termostático del microtomo, que contiene 2 L de agua destilada. Fijar la temperatura del baño María entre 42 – 45 ° C.
3. Lugar la parafina había incrustado bloques en la placa de enfriamiento. Espere al menos 5 minutos para permitir que los bloques se enfríe.
4. Tome un bloque de la placa de enfriamiento y colóquelo en el soporte del bloque micrótomo.
5. Establecer el micrótomo grueso a 10 μm. Ajuste del bloque del corte cortando 6 veces en 10 μm de grosor.
6. Cambiar el ajuste de espesor del microtoma de 10 μm a 3 μm. corte 3 μm sección de hematoxilina y eosina (H & E) tinción.
7. Recoge la sección de 3 μm con un cepillo pequeño. Poner la sección de 3 μm en el baño de agua, puesta con cuidado sobre la superficie del agua para reducir las arrugas del tejido. Recoge la sección del tejido desde el baño de agua termostáticamente controlada sobre un portaobjetos de vidrio solo.
   1. Si es necesario, cortar secciones adicionales.
8. Etiquetar el portaobjetos de cristal por escrito la identificación de la muestra.
9. Poner los portaobjetos en un horno de 37 ° C durante al menos 10 minutos.
10. Poner laminas de vidrio racks para análisis inmediato o en cajas de almacenamiento.

7. hematoxilina y eosina (H & E)

1. Encienda el stainer automatizado pulsando el botón de encendido. Permite la inicialización del brazo robótico, observando el cambio de la barra de carga en la pantalla del instrumento.
2. Inserte las diapositivas de cristal en el rack de stainer, introduciendo verticalmente hasta 30 diapositivas.
3. Etiqueta de la rejilla con la etiqueta de plástico apropiado radio frecuencia identificación (RFID). Etiquetado RFID es un sistema que identifica el protocolo de tinción correcta cargado en la computadora de stainer.
4. Inserte la rejilla en el filtro. Deje que el ordenador automáticamente la carga y empezar el protocolo de tinción según el reconocimiento de la etiqueta de RFID.
   Nota: El protocolo para la tinción de H & E se describe en tabla 3.

8. la coloración de Immunohistochemical

1. Realizar inmunohistoquímica y Mallory trichrome de tinción como se describió anteriormente⁷.

Results

La colitis crónica experimental inducida por la administración repetida de DSS en el agua potable es un modelo murino de inflamación intestinal muy parecidas a la humana EII^8,9. La figura 1 describe los efectos del tratamiento de DSS, incluyendo colon acortar (figura 1A), un parámetro utilizado para anotar la presencia de la inflamación inducida por DSS y colon expresión ...

Discussion

Utilizamos diferentes pasos automatizados durante la preparación de tejidos murinos para análisis histopatológico. Este protocolo tiene como objetivo brindar consejos técnicos para aumentar la reproducibilidad y la estandarización de todo el proceso, mejorando así la calidad de la evaluación histopatológica definitiva. Implementamos instrumentos automatizados y métodos para la preparación y fijación de los tejidos, habitualmente utilizados en las instalaciones de base de patología para el estudio de especímenes humanos.<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etanol absoluto anhidro	Carlo Erba		414605 reactivo
ETOH absoluto	Reactivo Honeywell	02860-1L
Sulfato de aluminio y potasio	SIGMA	A6435
Azul de anilina	SIGMA	reactivo	415049
carbol Fucsina	SIGMA	C4165	reactivo
CD11b (clon M1/70)	TONBO biosciences	35-0112-U100	anticuerpo
CD20 IHC (clon SA275A11)	Biolegend	150403	anticuerpo
CD3 (17A2)	TONBO biosciences	35-0032-U100	anticuerpo
CD4 (GK1.5)	BD Biosciences	552051	anticuerpo
CD45.2 (clon 104)	BioLegend	109837	anticuerpo
CD8 (53-6.7)	BD Biociencias	553031	anticuerpo
Tampón de citrato pH 6 10x	Reactivo SIGMA	C9999
Dab	Vector Laboratories	Reactivo	SK-4100
DPBS 1x	Reactivo Microgem	L0615-500	DSS
	TdB Consultancy	DB001	reactivo
EDTA	SIGMA	E9884	reactivo
EnVision Flex Reactivo bloqueante de peroxidasa	Compreso DAKO		en GV80011-2
Sustrato EnVision Flex	Compreso DAKO		en GV80011-2
Compresión EnVision Flex/HRP	DAKO		en GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker	Compreso DAKO		en GV80011-2
Reactivo	Eosin VWR	1.09844
F4/80 (clon BM8)	Anticuerpo BioLegend	123108
Formalina	PanReac	2.529.311.215	reactivo
ácido acético glacial	SIGMA	71251
reactivo Cabra-anti-rata-HRP	Anticuerpo	Agilent DAKO	P0448
Hematoxilina	Reactivo DIAPATH	C0303
LEICA Microtomo rotativo (RM2255)	Leica	RM2255	equipo
Ly6g (clon 1A8)	BD Biosciences	551459	anticuerpo
Óxido de mercurio II	Reactivo	203793 SIGMA
Agente de compensación Omnis Clearify	DAKO	Reactivo CACLEGAL
Omnis EnVision Flex TRS	Reactivo DAKO	GV80011-2
Orange G	SIGMA	O3756
Parafina	Reactivo Sakura	7052
Equipos Peloris	LEICA
Percoll	SIGMA	P4937	reactivo
RPMI 1640 sin L-Glutamina	Microgem	Reactivo L0501-500
STS020	Equipos	Leica
Tissue-Teck Paraform Cassette seccionable	Equipo
Tissue-Tek Embedder de parafina automatizado	Equipo Sakura
Xileno	J.T.Baker	8080.1000	reactivo